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融合标签可用于目标蛋白没有特异性抗体的多种应用,例如,目标蛋白是一种新型蛋白时。应用技术包括 Western Blot、免疫沉淀、ELISA、免疫荧光、免疫电镜、表面等离子共振等。
用于结构研究的技术,如核磁共振(核磁共振)光谱学、X(X)光晶体学和低温电子显微镜,需要优质纯蛋白进行分析1。这意味着依靠洗涤剂或还原剂的纯化方法可能不适用,因为这些方法可能会妨碍优质晶体的形成或者影响蛋白结构1。
美国核磁共振研究来说太大。
从蛋白中切割标签则可以解决这一问题,但这样会增加实验成本。虽然如此,仍有超过 75% 的纯化结晶蛋白与融合标签连接。一些标签可能比其他标签更适合结构研究,因此务必仔细考虑您的实验设计。
纯化后产生具有功能活性的蛋白对某些研究而言至关重要,尤其是那些潜在疗法的研究1。功能研究的一个主要方面是保留正确的信号域和准确的蛋白质折叠。因此,小标签可能是首选,因为小标签不太可能影响蛋白质功能。标签的位置对这些研究也很关键,因为位置不正确会降低正确的表达量。如果蛋白的结构是已知的,则有助于确定最佳位置。
表位和荧光标签都是评估目标蛋白定位的重要工具。免疫荧光显微镜是最常见的可视化技术,既可以直接通过荧光标签实现,也可以间接通过免疫检测实现。还可以用于发现蛋白的哪些区域有助于定位2。
分析,分析2。
由于荧光标签无毒,因此可用于观察活细胞中蛋白的运动。
如果想把某一基因导入某一细胞,可以用融合标签来保证该基因的表达。也可以使用相同或不同的标签评估两个基因的共表达2。
重组蛋白还用于在原核系统中表达真核蛋白。该技术通常用于获得高水平的目标蛋白,以便开展后续研究。以这种方式分离真核蛋白面临的挑战之一是:20-40% 的真核蛋白不能在原核系统中以可溶形式表达1。融合标签(如 消费税或 MBP)可以通过增加目标蛋白的溶解度来帮助克服这一障碍。
蛋白纯化依赖于四个基本步骤:
亲和层析、免疫沉淀 (IP)和蛋白复合体免疫沉淀 (联合IP)是最常见的蛋白纯化技术2。尽管这些方法都采用了上述四个步骤,但每种技术使用的固定基质不同。
亲和层析常使用色谱柱作为固定相,并利用氢键或离子键等分子特性。首先让粗裂解液流经色谱柱,使目标蛋白结合,然后洗去多余的裂解液。可添加特定缓冲液或溶液,从色谱柱中洗脱目标蛋白。
另一方面,IP(IP)的固定相为目标蛋白的抗体。将细胞裂解液与固定相一同孵育,促使抗体与溶液中的蛋白结合。然后使用蛋白 A/G公司偶联琼脂糖微珠将抗体/抗原复合体从样本中分离,用于后续分析。例如,通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,用于 西部印记分析。
Co-IP公司也可使用抗体结合已知的靶点,但其目的是将目标蛋白连同其结合的任何其他蛋白一起分离。通过这种方式,可以找到新的结合伴侣或蛋白质网络1。为全面了解与主要已知蛋白相关的蛋白网络,后续实验通常包括使用其他分离中发现的蛋白作为靶点进行重复 联合IP
虽找[图 1]。
蛋白纯化:伊斯标签、生物素、c-myc公司
蛋白表达:DDDK、CBP
检测GFP、mCherry、HA
免疫沉淀:c-myc、DDDK
蛋白定位:GFP、mCherry公司
功能分析:DDDK公司
增加蛋白溶解度:消费税
图 1:广泛使用的融合标签的分子量比较