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批号144208订单号PO#57883问题描述使用从[竞争对手]购买的抗Lef-1抗体(与Ab12035和Ab12034相同)和Using Jurkat全细胞裂解物作为对照,我假设我会在western blot上看到55-57kD带。在4-20%梯度凝胶上,我看到了125kD的优势带。也有从125kD到15kD等强度的小谱带。这些乐队都不突出。西药本身看起来很好,凝胶运行良好,分离良好,等等……如果在预测的55-57 kD分子量下没有任何突出的东西,我不相信Jurkat阳性对照。在125 kD的Jurkat全细胞裂解物中,我看到的主要谱带是什么?初级抗体[一个竞争者](Mab 3752)和[一个竞争对手](Mab3751)在封闭缓冲液中1小时RT(以5ug/ml使用)用阻挡缓冲液清洗。检测方法皮尔斯的SuperSignal West Pico化学发光基板套件。使用的正负控制Jurkat全细胞裂解物(abcam)RIPA e 9.5天胚胎裂解液——样品M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂-e 9.5天胚胎裂解物-样品抗体储存条件这不是抗体。它是抗Lef-1抗体的阳性对照。我现在已经从Abcam购买了3管Jurkat全细胞裂解液。我曾尝试用Jurkat全细胞裂解物作为阳性对照物,使抗lef-1抗体在西方起作用。我应该在55-57 kD波段看到。样品制备Jurkat全细胞裂解物(ab7899)准备装载。装载的蛋白质量10 ul 2 mg/ml样品。。。20微克的全细胞裂解物。。。按照产品表上的建议电泳/凝胶条件还原条件Bio-Read的4-20%梯度凝胶转移和阻塞条件在70伏电压下传输2小时TBS/0.05%吐温20/3%无脂奶粉(Bio-Rad)1小时RT次级抗体Abcam(Ab6728)兔抗鼠IgG H&L(HRP)最初以1:10000的比例进行试验。非常小的信号。上次使用时间为1:4000。良好的信号最小背景。在1:4000 RT封闭缓冲液中稀释1小时在阻挡缓冲液中清洗。检测前在TBS中进行最后几次清洗。您试用了多少次该应用程序?5您是否运行了“无主”控制?不你每次都得到同样的结果吗?是的你改变了哪些步骤?洗涤液-吐温的首次浓度可能过高
Abcam社区
已验证客户
2006年1月24日被问及
我很抱歉听到您在使用我们的Jurkat裂解物ab7899时遇到问题,并试图查看[竞争对手]抗体,以确定它们是否与ab12034和ab12035相同。事实上,它们不是相同的抗体,而是相同的克隆,[竞争对手]的抗体是“纯化腹水”,而Abcam抗体是经过蛋白G纯化的。因此,纯化过程可能不同,腹水会产生更多的条带,因为它没有得到很好的纯化。我建议询问[竞争对手]关于报告的带有抗体的125kda带,因为这可能是由于他们产品的纯度。我怀疑这个问题也可能是由于实验中的阻滞剂造成的,特别是如果你看到你的其他裂解液中有很多非特异性条带的话。我们发现,如果存在过多的阻断剂,许多抗体会非特异性结合,因此我建议在牛奶中用5%的TBST在膜上孵育1小时,在另一个膜上用5%的BSA在TBST中孵育一小时。然后我建议在TBST中轻轻清洗膜(10秒),并仅在TBST培养一级抗体(和二级抗体)。我希望这些建议能对您有所帮助,如果我能提供进一步帮助,请随时与我联系,
回复于 2006年1月25日