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半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,在细胞凋亡过程中起到关键作用,被广泛用作凋亡的生物标志物。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在凋亡过程中,被剪切成分子量分别为17kDa(p17)和12kDa的两个片段,并易位至细胞核。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3经过剪切激活后,可以激活 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6、-7和-9形成凋亡级联反应。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3参与了亨廷顿蛋白的降解。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3中国
在肺,脾,心脏,肝脏和肾脏中高度表达。
脑和骨骼肌内中水平表达,睾丸低水平表达。
在许多细胞系中表达,在免疫系统细胞中的表达最高。
在细胞质中表达,当受到刺激时,易位到细胞核。
人(P42574):32kDa(预测)
鼠(P70677):31kDa(预测)
(第55213页):31kDa(预测)
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、B、6、8和10“”,“”
Caspase-7和Caspase-3的大亚基之间也会结合形成异二聚体。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在其催化位点发生亚硝基化,凋亡途径激活后发生去亚硝基化。
请注意胱天蛋白酶-3存在多种蛋白形式,不同样本诱导后引起细胞凋亡的程度不同,最终检测到的蛋白条带大小可能会存在差异,包括约32 kDa半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(有些样本可能会观察到中间切割产物 29 kDa)、17 kDa(有些样本可能会观察到中间切割产物19 kDa)、12 kDa
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3仅在细胞凋亡时才会被剪切,所以,大多数情况下样本无需药物处理即可检测到胱天蛋白酶-3前体蛋白;如果想要检测剪切后的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3,建筑会议诱导样本进入凋亡通路(例如:使用星形孢菌素处理样本,可作为给药组的阳性对照)同时,诱导后会观察到胱天蛋白酶-3前体蛋白含量的减少。
请注意不同抗体检测的胱天蛋白酶-3蛋白形式可能存在差异:比如,只能检测前体蛋白的ab32499号,17 kDa约32042,预测17千Daab32351型,能同时检测前体蛋白和12千Da约179517。
使用相同抗体检测不同种属的样本时,检测的胱天蛋白酶-3蛋白形式也可能存在差异:比如约184787能够在人类样本(例如:Jurkat)中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的前体和剪切体,但无法在小鼠和大鼠样本中检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
胱天蛋白酶-3存在多种翻译后修饰,在 工作分解结构检测的条带大小可能与预测值不同。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3):HAP1、Jurkat、HeLa S couples
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3剪切体:星形孢菌素处理的HAP1、Jurkat、HeLa小苏打(诱导详情见产品说明书)
CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)HAP1细胞系/全细胞裂解液
关键控制点
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。
布拉德福德(Bradford)回报分析、劳里(Lowry)回报分析(BCA)分析测定样本总蛋白浓度。
样本超声破碎可以富集细胞核蛋白并增强WB信息
电泳
对于分子量较小的靶标蛋白(空气<25 kDa)请使用较高浓度15%的分离胶进行电泳。
20微克总蛋白进行电泳。
转膜
对于分子量较小的靶标蛋白,建议使用0.22μm PVDF
建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功(如果选择荧光标记检测,请确保丽春红完全清洗干净)。
抗体孵育
请根据产品说明书选择最优的抗体工作浓度。