1.简介

X射线晶体学在过去30年中取得的巨大成功很大程度上归功于高强度同步辐射（SR）设施的可用性。最近，不断增长的驱动力亮度X射线源的增加导致在美国和日本建立了X射线自由电子激光（FEL）设施，在欧洲、东南亚和其他地方正在建设新设施（Weckert，2015). X射线自由电子激光提供了巨大的强度增益，允许从几纳米的晶体中获得分子结构（查普曼等。, 2011)，最终，在完全不需要晶体的情况下，以高分辨率可视化大分子结构和复合物的可能性（Stern等。2014年). 扩展到亚原子分辨率的X射线衍射数据(即。≤1º）可以得到非常精确的电子密度图，从而可以确定大部分H原子的位置。氢原子位置的知识提供了质子化状态的详细信息(例如用于氨基酸侧链、结合药物/抑制剂等）、水结构和氢键，这对理解大分子功能至关重要（Kosinka Eriksson等。, 2013; 松冈等。, 2015; 尾形等。, 2015). 此外，可以获得电荷密度信息，如克雷姆宾（杰尔施）的研究所示等。, 2000)醛糖还原酶（Guillot等。, 2008)和胆固醇氧化酶（扎里赫塔等。, 2015). 中子晶体学为亚原子X射线晶体学提供了一种定位H原子的替代方法，是定位高极化H原子和质子（H⁺)因为这些用X射线是看不见的。由于H及其同位素氘（D）的相干中子散射长度与大分子的其他常见元素的大小相似（表1)，它们的位置可以比X射线所需的分辨率低得多。此外，在亚原子分辨率的电子密度图中观察到的H原子通常是具有低热运动的H原子，而更具流动性的H原子，通常是生物学上最感兴趣的，往往保持不可见，因为它们本已微弱的散射信号被进一步抹杀。尽管中子衍射数据集的分辨率低得多，但中子晶体学已显示出难以在亚原子电子密度图中观察到的H原子位置（加德伯格等。, 2010).

使用中子的另一个优点是，它们不会对晶体造成任何可观察到的辐射损伤，因此可以在室温下收集数据，避免任何潜在的低温冷却效应（Keedy等。2014年)从而确定无损伤结构。这一点尤其重要，因为尽管X射线探测器和数据采集协议取得了所有进步，但在100 K时仍可能发生辐射损伤（利布施纳等。, 2013; 凯基莉等。2014年). 这对于金属蛋白中的氧化还原中心尤其明显（Kekilli等。2014年; 苏加等。, 2015)以及含有羧酸的残留物天冬氨酸和谷氨酸，因为X射线会导致一氧化碳₂消除、排除测定天冬氨酸和谷氨酸质子化状态（Gerstel等。, 2015). 我们注意到，尽管蛋白质数据库（PDB）中有大量的X射线结构，但在环境温度下，氧化还原系统真正的“无损伤”结构仍然稀缺。

中子晶体学在大分子中氢原子定位的应用历来局限于研究小单元-细胞系统（细胞边缘<30º），其中大晶体的直径为几毫米^三可以种植。即便如此，由于缺乏优化的仪器，仍需要数月的长时间数据采集（Schoenborn，2010). 随着中子晶体学扩展到传统边界之外，以更小的样本和更短的数据采集时间解决更大和更复杂的问题，情况不再是这样。这种转变的起源可以在许多进展中找到，包括准劳（Blakeley）的发展等。, 2010; 梅勒尔等。, 2013)和单色（Kurihara等。, 2004;https://www.mlz-garching.de/biodiff)带柱面成像探测器的衍射仪核反应堆中子源，散裂中子源处的飞行时间（TOF）劳厄衍射仪等。, 2004; 科茨等。, 2010; 库萨卡等。, 2013)样品氘化的集中设施和结构计算的新工具精炼（黄嘌呤等。, 2010; 格鲁尼等。2014年). 在PDB中的83个中子结构中，自2010年以来有一半以上（49/83）是沉积的（图1). 其中许多说明了X射线和中子晶体学相结合的互补性，以确定重要的氢原子位置，从而提高我们对大分子结构和功能的理解。

图1 自2010年以来，PDB中沉积的大分子的中子和联合X射线/中子结构，包括每个大分子的数据收集细节和晶体学参数。结构按照晶体体积与不对称单位体积之比从最低到最高排序。那些比率最低的人被认为是最具挑战性的。红色突出显示的是HIV-1蛋白酶与抗逆转录病毒药物amprenavir结合的研究（Weber等。, 2013)晶体体积与非对称单元体积。橙色突出显示了对来自硫还原热球菌（I-P基地；休斯等。, 2012)这是目前最大的单位电池和非对称单元待研究的体积。蓝色突出显示的是对红血球毒素从火球菌属（RdPf；Munshi）等。, 2012)这是到目前为止14小时收集数据的最快速度。绿色部分突出显示的是另一项关于RdPf（Cuypers）的研究等。, 2013)这是目前分辨率最高的研究，为1.05°。以紫色突出显示的是在100 K下进行的细胞色素中子低温结晶研究c（c）过氧化物酶（MW～34 kDa）（卡萨迪等。2014年)和β-内酰胺酶（MW～28 kDa）（Coates等。2014年)以黄色突出显示的是对Cu亚硝酸盐还原酶（MW～37 kDa）的研究环折无色杆菌(交流电NiR）和细胞色素c（c）′（MW～14 kDa）来自产碱木糖氧化酶类(阿克斯CytCp）。

2.H/D交换和全氘化

在中子大分子晶体学中，D取代H有两个主要原因。首先，H有一个异常大的非相干散射 横截面，而D的值要低～40倍（表1). 由于H原子约占高分子晶体中原子的一半非相干散射信号对高散射背景有显著影响；因此，通过降低非相干背景，H/D同位素替换提高了衍射数据的信噪比，从而扩大了分辨率极限。其次，由于D的相干散射长度是正的，大约是H的两倍，因此D原子比H原子更容易定位在中子图中。

中子研究通常使用D交换单晶（Tomanicek）进行（64/83，77%）等。, 2010; 瓦列夫斯基等。, 2010, 2012; 费希尔等。, 2012; 横山等。, 2013; 卡萨代等。2014年; 黄等。2014年; 兰根等。2014年; 奥克萨南等。2014年; 万等。2014年; 联合国等。, 2015; 米查尔奇克等。, 2015). H/D交换可以通过蒸汽交换或浸泡在D中实现₂O溶液，允许交换附着在氧或氮上的溶剂可及氢原子，但不允许交换附着到碳上的氢原子。从D交换晶体中收集的中子数据可以很容易地以2.5º的分辨率显示O或N原子上的D原子。为了容易地定位H原子，数据必须扩展到~1.5º的分辨率（Chen等。, 2012)因为在较低分辨率下（正负中子散射体之间）的抵消效应限制了H原子附着在C原子上的可视化(例如中国₂，中国_三组）。越来越普遍的是使用全氘化样品进行的研究（总体上，19/83个结构，23%；自2010年以来，17/49个结构，35%）通过细菌在氘化培养基上的表达（Petit-Haertlein等。, 2009). 因为全氘化提供了完全的氘化(即。全H被D取代），来自氘代晶体的中子衍射数据大大提高了信噪比，缩短了数据收集时间（Munshi等。, 2012)和/或提供更高分辨率的数据（Cuypers等。, 2013). 由于成功的中子晶体学研究的历史瓶颈是需要足够大的晶体体积，也许最重要的是，过氘化允许从更小的晶体体积中收集数据(囊性纤维变性。D-交换样品）（霍华德等。, 2011; 韦伯等。, 2013)，使更大的单元-细胞系统更易于研究。此外，避免了中子图抵消效应，使所有D原子（分辨率为2.5º），包括附着在碳原子上的原子，都可以很容易地可视化(例如光盘₂，CD_三组）（费希尔等。2014年). 世界各地的中子设施现已开发出专门的氘化实验室，如劳埃-朗之万研究所（ILL）的氘化实验室和橡树岭国家实验室（ORNL）的生物氘化实验室。

反应堆中子源处的中子仪器

近年来，在开发新的和改进的中子大分子晶体学仪器方面取得了很大进展。在反应堆中子源中，使用圆柱形中子敏感成像（NIP）探测器，该探测器完全包围样品并提供大范围的互易空间(>2π斯特拉迪安）已被纳入仪器设计中，如LADI-III衍射仪（布莱克利等。, 2010)在ILL高通量反应堆，BioDIFF衍射仪(https://www.mlz-garching.de/biodiff)在Forschungsreaktor Munchen II研究反应堆（FRM II）、BIX-3和BIX-4衍射仪（田中等。, 2002; 栗原市等。, 2004)日本原子能机构（JAEA）的JRR-3M反应堆和IMAGINE衍射仪（Meilleur等。, 2013)在最高点通量ORNL的同位素反应器（HFIR）。为了减少所需晶体的体积，LADI-III和IMAGINE衍射仪使用准蓝方法进行数据采集，其中窄带通过(例如 δλ/λ=30%）从原始宽带波长光谱（白光）中提取。准寿命方法在通量相对于单色方法，与使用全白光束相比，减少了背景散射和反射重叠。2012年，LADI-III衍射仪被重新安置在靠近ILL反应堆的新导轨（H143）上。新的终端位置提供了改进的带通剖面（由于上游缺少仪器），最重要的是增加了四倍通量在样品位置(囊性纤维变性。之前的H142位置）。由于最近的这些改进，LADI-III正在进一步扩大该领域的范围。目前的2.0º分辨率结构（PDB代码：4JEC公司)与amprenavir结合的全氘化HIV-1蛋白酶（MW～21 kDa）（韦伯等。, 2013)具有用于数据采集的晶体体积的最低比率（33）（0.2 mm^三)到非对称单元研究的大分子体积（60000μ^三). 此外，2.5º分辨率结构（PDB代码：第3季度第3季度)无机焦磷酸酶（I-PPase，MW～125 kDa）的非对称单元体积(一= 106.1 Å,b条= 95.5 Å,c（c）= 113.7 Å,β= 98.1°/C类2） 到目前为止（休斯等。, 2012). 该结构是使用5 mm的数据确定的^三I-PPase的D交换晶体；然而，最近使用LADI-III衍射仪收集到的数据分辨率为～2.5º，但数据来源于更小（0.32 mm^三)I-PPase的全氘化晶体，说明了全氘化的巨大好处（Ng/Garcia-Ruiz，未发表的结果）。1.05Ω分辨率中子结构（PDB代码：第4页第3页)全氘化物的氧化形式红血球毒素从火球菌属（RdPf，MW～6 kDa）是迄今为止沉积的任何结构中分辨率最高的（Cuypers等。, 2013). 这些数据是从6.9 mm^三使用ILL的单色热中子衍射仪D19对RdPf的全氘化晶体进行测量。虽然D19衍射仪更常用于结构化学中的衍射研究，但它能够从小分子（细胞边缘<50以及从更大的大分子（细胞边缘<100º）到中等分辨率（1.8–2.5º），前提是足够大的晶体数毫米^三可用。近年来，木糖异构酶（MW～43 kDa）的中子研究集成证明了这一点（Kovalevsky等。, 2010, 2012; 兰根等。2014年).

散裂中子源的中子仪器

在散裂中子源中，质子脉冲产生的中子具有“时间戳”，通过记录TOF信息，可以计算出每个中子的相应能量和波长。TOF技术与大型位置敏感探测器（PSD）相结合，可以使用所有可用中子（Langan等。, 2004). 因此，TOF-劳厄方法具有反应堆源所用准劳厄方法的所有优点，但在波长范围内不受反射重叠和背景散射积累的影响。在过去的几年里，已经建造了两台专门用于大分子晶体学的新型TOF-Laue衍射仪；MaNDi（科茨等。, 2010)ORNL和iBIX（Kusaka）散裂中子源（SNS）等。, 2013)在日本质子加速器研究中心（J-PARC）。表2提供了反应堆和散裂中子源当前运行的衍射仪的详细信息。

5.中子低温结晶术

由于用于晶体学实验的能量中子不会造成任何辐射损伤，所以数据采集通常在室温下进行。然而，在低温下收集数据的能力很有意义。由于低温下动力学无序的减少降低了原子位移参数（ADP），这导致了核散射密度定义的改进（布莱克利等。, 2004)并允许使用较小的晶体[囊性纤维变性。室温（RT）]，以实现等效或潜在的更高分辨率数据。此外，某些晶体在室温下不稳定，因此低温冷却晶体以收集数据的能力增加了可行实验的数量。此外，还可以对不同温度下确定的结构进行比较。这一点很重要，因为质子化状态可以因p而改变灵魂对温度的依赖性。此外，由于绝大多数X射线结构是在100 K下测定的，因此检查低温冷却引起的大分子结构变化非常重要，而无需从辐射损伤效应中进行反褶积。最后，低温结晶法允许进行更复杂的实验，例如酶反应中间体的低温捕获（Casadei等。2014年). 现在可以在BioDIFF、LADI-III、D19、iBIX和MaNDi上以类似于100K下X射线数据采集的常规方式在低温下进行数据采集，即。使用标准低温针、环等。（科茨等。2014年).

6.结构精炼中子衍射数据的选择

最近几年精炼已开发出允许结构精炼单独或联合中子数据精炼使用X射线和中子衍射数据的策略。添加H和D原子后，中子结构的原子数大约是X射线结构的两倍。因此，尝试以中等分辨率细化中子结构(例如 d日_最小值从2.0到2.5º），尤其是具有较大单位单元的单元，由于数据与参数的比率较低，可能会出现问题。通过结合X射线和中子技术的数据，可以提高数据与参数的比值，同时可以减少系统误差的影响。联合X射线/中子精炼策略使允许精炼在结构中的所有原子中，原则上会产生更精确的结构。这个菲尼克斯定义程序（Afonine等。, 2010)例如，能够在联合X射线/中子策略中细化结构，以及仅针对中子数据。此外，对SHELXL2013表（格鲁尼等。2014年)使程序更便于使用精炼根据中子数据分析高分子结构。

7.亚原子分辨率X射线结构仪器的最新发展

自从100多年前发现X射线以来光辉X射线源通过SR源增加了10个数量级。世界上第一个专门为该目的设计和建造的专用X射线源Daresbury SRS问世仅35年，它提供了近10亿倍的X射线束增长光辉与当时最好的X射线管相比。对越来越强烈的X射线束的需求日益增长，在过去十年中，已经产生了几种先进的紧凑型第三代SR源，SOLEIL（2006）、Diamond（2007）和上海同步辐射设施（2009）带来了束流光辉类似或超过{10¹⁷–10²⁰ 光子[s mm²磁共振成像²(10⁻³带宽）]⁻¹}大循环（>1 km）储存环、6 GeV ESRF（1993）、8 GeV SPring-8（1997）和7 GeV APS（1998），在世纪之交前投入使用。过去十年中，许多存储环引入了自顶向下的操作模式，通过定期注入少量电流来维持存储环中的稳定电流，通过长时间保持热负荷恒定，在存储环和光束线上提供更稳定的光束。尽管SR源的性能在以下方面取得了巨大进步亮度在过去的几十年中亮度增益的速度是半导体改进速度的两倍（摩尔定律），高水平发射率仍然是实现极限的限制因素亮度梁的长度。通过使用包含弯曲磁铁以及聚焦电子束所需的高阶多极磁铁的大量聚焦电池构建环，可以彻底降低水平发射率。最初在欧洲核子研究所（CERN）进行的用于抽真空系统的非蒸发吸气剂（NEG）泵的技术开发使得磁间隙大大减小。这被部署在两个创新环MAX-IV（瑞典）和Sirius（巴西）中，这两个环使用多弯曲消色差晶格构建，以实现衍射限制存储环。这些环的水平发射率预计为3×10² pm rad带来平均值亮度共10页²² 光子[s mm²磁共振成像²(10⁻³带宽）]⁻¹十年前的实验（埃里克森等。2014年). 包括ESRF、APS和SPring-8在内的许多主要设施正在利用这些新的技术突破升级其资源。

越来越亮的光源提供的X射线光子密度越来越大，这要求光束线、光学元件和探测器的快速发展。对于X射线大分子晶体学，第二代光源最初使用非对称切割晶体水平压缩光束，使用镜子垂直压缩光束。上世纪末，出现了许多进步，允许使用XAFS型单色器，第二块晶体提供水平焦点并保持固定的光束位置。这些还提供了从硫定相的～2.5Å到SPring-8超高分辨率的～0.4Å的全波长可调谐性。过去十年中，在多个来源提供微型论坛专用设施方面取得了重大进展。本世纪初，Riekel在ESRF的ID13上进行了微焦点束的开创性工作（Riekel，2004). 使用X射线波导光学器件（Mo/C/Mo三明治结构，碳间隔80 nm）可以提供0.1µm的一维光束（米勒等。, 2000). X射线通过相对金属层的全反射在波导管中通过轻元素层传输。分级多层镜可用于将光束水平聚焦至3µm，而波导可将光束垂直聚焦至0.1µm（菲舍蒂等。, 2009). 在2012年诺贝尔奖中发挥重要作用的APS的（GM/CA-CAT）双倾斜波荡器光束线开发了一种“迷你光束”设备，可将聚焦光束（20µm×65µm）调节为5µm或10µm（FWHM）直径，并具有高强度。最近，一种四光束小型准直器已经实现，它能够提供高强度（5×10¹⁰和3×10⁹)样品位置的最小焦距为5和1µm。现在大约有24条微焦点高分子晶体学光束线，在3.5至35 keV的宽能量X射线范围内，在样品上传输5–20µm的光束（Smith等。, 2012).

X射线的增加光辉需要对X射线探测器进行重大改进。在第二代来源，如SRS（达累斯伯里）、Photon Factory和NSLS，早期数据是在照相胶片上收集的，直到引入了成像系统。图像处理系统最初是在离线模式下使用的，在数据采集期间需要扫描平板。20世纪90年代，出现了在线成像系统的发展，在该系统中，无需实际处理图像板即可进行读取和擦除（Amemiya，1997). 电荷耦合器件（CCD）探测器出现于上个世纪末，几家商业公司在尺寸、像素分辨率、读出速度和灵敏度方面不断改进，其价格可由大多数SR中心为其晶体学设施提供。过去十年中，光电计数混合像素阵列硅探测器（Broennimann等。, 2006)为SR晶体学提供无百叶窗数据采集程序。这些探测器提供了非常高的动态范围，零暗信号和零读出噪声，因此能够在短读出时间和高帧速率下实现最佳信噪比。图2显示了PILATUS3系列探测器的速率响应。

图2 PILATUS探测器在波长范围内不断发展和提高空间分辨率、计数率、读出速度以及灵敏度。最近，一种独特的真空X射线探测器PILATUS 12M-DLS被安装在钻石光源的I23光束线上，用于长波X射线晶体学。PILATUS 12M-DLS是一种半圆柱形探测器，覆盖2个θ±100°的范围，可同时采集低分辨率和高分辨率数据。（数据由Clemens Schulze-Briese博士提供，比较了PILATUS3和PILATUS2。）

8.氧化还原生物学：从电子的供给到利用

许多生物过程依赖于利用金属中心或簇的氧化还原特性的氧化还原过程。原子到亚原子分辨率的X射线结构能够以前所未有的细节水平提供结构信息，但一个主要挑战仍然是氧化还原中心首先受到光还原（亚诺等。, 2006; 霍夫等。, 2008; 埃利斯等。, 2008; 凯基莉等。2014年). 目前正在开发几种解决方案来克服这一问题，包括将大晶体与带有快速CCD和光子计数探测器的微聚焦光束结合起来部署。使用来自XFEL的超亮飞秒脉冲可以使大多数损伤过程失效，并且最近启用了结构测定牛细胞色素的完全氧化静息状态c（c）氧化酶（平田等。2014年)以及SACLA FEL（Suga）的光系统II的未受损含氧复合体等。, 2015)使PSII中Mn团簇的细节与XAFS公司。为了尽量减少辐射损伤，晶体可以每隔几度转换数据，以提供纯氧化还原状态的结构，而不是X射线辐解产生的混合物。这一发展可以与中子衍射研究相结合，因为在从同一晶体获得亚原子分辨率X射线结构之前，该晶体可以首先用于收集高分辨率中子衍射，而不存在任何辐射损伤问题。实现这一点的一个例子是高电位铁硫蛋白（HiPIP）。HiPIP的MW为～9 kDa，并含有Fe₄S公司₄簇，表现出+2/+3氧化还原状态，并作为细胞色素的电子载体公元前1个复合物到光合紫色细菌中的反应中心复合物。使用体积为2.3mm的D交换HiPIP晶体^三在J-PARC使用TOF劳厄衍射仪iBIX收集中子数据，分辨率为1.17º。随后，使用短X射线波长（0.4º）和强微聚焦光束，以及数据采集过程中大晶体的平移，收集了分辨率为0.48º的X射线数据（Hirano&Miki，未发表的结果；数据在2014年IUCr大会上提交）。HiPIP获得的X射线分辨率相当于迄今为止由更小的蛋白质crambin保持的记录（在2014年IUCr大会上提出），其分子量为～5 kDa。联合X射线/中子结构精炼这些非常高分辨率的数据集肯定有助于我们理解电子和质子转移动力学的耦合。

亚硝酸铜还原酶（NiRs）中发生电子和质子转移的耦合，这已通过对这些酶的广泛结构-功能研究（Antonyuk等。, 2005, 2013; 莱费林克等。, 2011). 这里，我们包括了0.87º分辨率的NiR X射线结构的结果环裂无色杆菌(交流电NiR）（MW～37 kDa），底物亚硝酸盐结合。该结构包含所有固有残基（残基4–340）、两个铜离子、两个丙二酸离子、一个亚硝酸盐离子、三个醋酸盐离子、一种硫酸盐离子和674个水分子。决赛R（右）_工作和R（右）_自由的影响因素分别为12.3%和13.9%。X射线数据的数据收集和处理统计如表3所示.由于X射线数据的分辨率很高，¹该结构中观察到61%的预期氢原子（图3). 图4显示了亚硝酸盐结合活性中心，催化核心可见大量H原子。尽管如此，尽管可见的氢原子比例很大，但质子路径中的许多关键氢原子是不可识别的。因此，观察到的Asp98的多重构象代表不同的反应状态，使得不可能看到质子（图4)与这个提取质子的残留物有关。这促使我们开始对交流电可以生长大晶体的NiR（见下文）。

图3 左：X射线结构交流电NiR（来自环裂无色杆菌)，显示了电子密度图中0.87º分辨率下可见的H原子数（1649）。右：相同的X射线结构交流电NiR，但显示结构中所有2700个预期氢原子；在这个0.87º分辨率的X射线结构中观察到61%的预期氢原子。

图4 第二类Cu站点交流电与亚硝酸盐结合的近红外光谱分辨率为0.87º。催化重要的残基Asp98以多种构象出现，有两种明显的构象。第2个F类o个−F类c（c） 电子密度图（青色）轮廓为1.5σ水平和F类o个−F类c（c）氢省略图（红色）的等高线为2.0σ级别。

9.中子衍射数据采集和处理交流电尼罗河流域

可用的最大晶体交流电NiR，体积～0.3 mm^三（0.8×0.7×0.6 mm）浸泡在D中₂O在中子数据采集前一个月缓冲，以便将不稳定的H原子换成D原子。使用12至24小时的曝光，从D交换晶体收集RT下的衍射数据，分辨率为2.3Å（图5)在15天内使用LADI-III。使用劳根（坎贝尔等。, 1998)，波长标准化使用l刻度（阿尔茨等。, 1999)并使用CCP4计划进行扩展和合并SCALA公司（获胜者等。, 2011). 中子数据的数据收集和处理统计如表4所示.结构精炼中子数据的使用目前正在进行中，并将在其他地方报告。此外，全氘化交流电自那时以来，ILL的氘化实验室已生产出NiR，以及约1 mm的较大晶体^三已经长大（图6). 2015年夏天，我们希望使用LADI-III收集这些较大的全氘化物的完整数据集交流电NiR晶体，目的是扩展衍射数据的分辨率，从而增强质子路径中所有H原子（如D原子）的可见性。

图5 左图：D交换晶体的中子准蓝衍射图样交流电NiR（体积=0.3 mm三)使用准Laue LADI-III衍射仪收集。中子衍射数据处理为2.3º分辨率。右图：部分准蓝衍射图案的放大特写。

图6 全氘化大晶体交流电NiR最近生长，是最大的（～1 mm三)如图所示。

10.分子传感：基于血红素的气体传感器

在生物学中，底物具有独特的大小、形状和电荷分布，这些都是由其目标生物伴侣蛋白质所特别识别的。气体O之间的区别₂血红素蛋白的NO和CO是生物特异性的一个显著例子，因为这些分子是非极性的，并且大小非常相似。这些气体的分子识别对于呼吸、细胞吞噬、趋气性/趋化性和基因表达调控至关重要。细胞色素c（c）'（CytCp）属于五配位（5c）血红素蛋白家族，可区分这些双原子气体，有效保护细菌在反硝化过程中免受亚硝基胁迫和/或NO穿梭。最具特征的CytCp（MW～14 kDa）来自反硝化细菌产碱木糖氧化酶类(阿克斯)（霍夫等。, 2011)，不与O形成稳定的络合物₂以远端六配位（6c）血红素羰基（6c-CO）弱结合CO，并与NO反应形成独特的近端5c血红素亚硝基（5c-NO）通过远端6c血红素-亚硝基（6c-NO）中间体。血红素的两面在配体结合中的利用是前所未有的。所有CytCp蛋白的拥挤的远端血红素口袋都含有靠近Fe的非极性残基（Leu、Phe或Met），这增强了外源配体结合的选择性。这里，我们包括CytCp的0.84º分辨率X射线结构的结果木糖氧化酶无色杆菌(阿克斯CytCp）（PDB代码2YKZ公司)（安东纽克等。, 2011). 由于X射线数据的高分辨率，从989个预期氢原子中观察到694个氢原子，即。70%的预期氢原子（图7). 图8显示了血红素结合囊，其中一些H原子可见于关键残基Leu、Phe和Met，这些残基在配体识别中起着重要作用。然而，并不是所有的H原子都能在配体-歧视囊中看到，因此，有必要对其进行中子晶体学研究阿克斯CytCp.周期。

图7 左：0.84º分辨率的X射线结构阿克斯CytCp，显示了在F类o个−F类c（c）氢省略图（红色），2.0等高线σ级别。右：相同的X射线结构阿克斯CytCp，但显示结构中所有989个预期的H原子。

图8 下摆包边口袋阿克斯CytCp的分辨率为0.84º，显示与关键残基Leu、Phe或Met相关的H原子（红色）的电子密度。第2个F类o个−F类c（c） 电子密度图（青色）轮廓为1.5σ、和F类o个−F类c（c）氢省略图（红色）的等高线为2.0σ.

11.中子衍射数据采集和处理阿克斯CytCp公司

最大的晶体阿克斯容积～1.5 mm的CytCp^三（3.2×0.7×0.65 mm）浸泡在D中₂O在中子数据采集前一个月缓冲，以便将不稳定的H原子换成D原子。使用3–18小时的曝光，使用LADI-III在10天内从D交换晶体收集到2.1º分辨率的RT衍射数据。使用劳根（坎贝尔等。, 1998)，波长标准化使用l刻度（阿尔茨等。, 1999)最终使用CCP4项目进行扩展和合并SCALA公司（获胜者等。, 2011). 中子数据的数据收集和处理统计如表5所示.结构精炼目前正在使用中子数据，并将在其他地方进行报告。作为生产全氘化物的尝试阿克斯到目前为止，CytCp已经失效，新的D交换晶体体积增加（～2.0 mm^三)已经长大了。2015年7月，我们希望使用LADI-III收集这些较大数据集的完整数据阿克斯CytCp晶体旨在进一步扩大分辨率，提高最终结构的精度和准确性。

12.结论

由于最近中子大分子晶体学能力和容量的增强，PDB中沉积的中子结构数量显著增加。该领域的局限性不断扩大，新的例子进一步说明了晶体体积或数据采集时间的减少，以及可实现的分辨率或单位体积的增加。此外，中子冷冻晶体学的可行性已经得到证明，可以进行更多的研究。通过对现有仪器的进一步改进，如为iBIX和MaNDi仪器增加新的探测器，以及建造新的仪器，如欧洲散裂源的TOF劳厄衍射仪“NMX”，这一趋势将继续下去。然而，可以公平地说，尽管在该领域取得了相对于X射线的所有进展，但中子衍射研究始终需要大得多的晶体（约线性尺寸的十倍），特别是随着研究更大的大分子和复合物的发展。正是在这个意义上，需要进一步开发用于大晶体生长的仪器和方法。创建专门用于优化晶体体积和质量的实验室，类似于集中氘化设施，将有助于提高中子大分子晶体学的效率。由于实验要求苛刻，结构生物学家已被劝阻从事中子衍射研究，但随着更多示例的发布，说明了X射线无法提供的重要结构信息，和从更可行的晶体体积来看，中子晶体学的应用将变得更加普遍。除了众所周知的中子晶体学强度外，很明显，该方法在环境温度下获得大分子的无损伤结构方面有很大贡献。微焦点X射线束的使用，结合将晶体平移到没有损伤传播的位置，以及高效准确地合并来自晶体不同部分的序列图像的数据的能力，已经证明是有效的。理解X射线自由电子激光飞秒脉冲辐射损伤过程的工作仍在继续（例如，见Jönsson等。, 2015; Nass公司等。, 2015)细胞色素方面的一些早期成功报道c（c）氧化酶与光系统II。虽然中子和X射线晶体学都无法预测蛋白质到结构的途径，但对于后者，甚至对于膜蛋白来说，它已经变得更加可靠。重大努力(例如全氘化和晶体体积/质量优化）是中子界和设施提供商的要求，以使更广泛的结构生物学界更容易获得中子结晶学。