2.1. QZ三聚体的合成

N个-中国银行-(S公司)-氨基酸硒环唑酯类由相应的N个-中国银行-(S公司)-氨基酸符合先前公布的程序（Tao等。, 2011). 硒环唑酯源自N个-中国银行-(S公司)-通过混合溶剂（5:1:2 THF:MeOH:H）中的NaOH溶液水解Ala（500 mg，1.44 mmol）₂O） 然后用50%的三氟乙酸在二氯甲烷中对Boc进行脱保护。将所得氨基酸（~1.4 mmol）溶于无水乙腈（14 ml）中，并用二异丙基乙胺（DIEA；1.0 ml，6.1 mmol）和五氟苯酚二苯基膦酸盐（FDPP；1.1 g，2.9 mmol）处理。在室温下将反应搅拌24小时，然后在真空下浓缩。将残留物溶解在二氯甲烷中，然后用NaHCO连续清洗_三5%HCl水溶液和NaCl溶液。有机相被浓缩，残渣被硅胶净化色谱法。收集主要产品并确定为所需产品QZ-Ala（92 mg，32%）。

其他环肽是通过同样的程序获得的。根据核磁共振波谱（补充图S1）以及反相和手性高效液相色谱（HPLC）分析，单个环肽的纯度大于98%。

QZ-Ala为白色固体，收率为32%。¹³C核磁共振（75 MHz，CDCl_三)δ（下午）：178.1（3C）、160.0（3C。¹核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl_三)δ（下午）：8.86（s，3×1H），8.50（d，J型=7.9赫兹，3×1H），5.67（dq，J型=13.7，6.8赫兹，3×1H），1.70（天，J型=6.8赫兹，3×3H）。为C计算的HRMS（ESI-TOF）₁₈H（H）₁₉N个₆O（运行）_三硒_三: (M（M）+H）⁺, 606.9009; 发现，606.9008。

QZ-Val的表征数据之前已经报道过（Aller等。, 2009).

QZ-Leu为白色固体，产率为45%。¹³C核磁共振（75 MHz，CDCl_三)δ（下午）：177.3（3C）、160.1（3C。¹核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl_三)δ（下午）：8.76（s，3×1 H），8.25（d，J型=9.6赫兹，3×1H，J型=5.9赫兹，3×3赫兹），1.00（天，J型=6.1赫兹，3×3H）。计算C的HRMS（ESI-TOF）₂₇H（H）₃₇N个₆O（运行）_三硒_三: (M（M）+H）⁺, 733.0417; 发现，733.0418。

以40%的产率获得白色固体形式的QZ-Phe。¹³C核磁共振（75 MHz，CDCl_三)δ（下午）：175.0（3C），160.1（3C。¹核磁共振氢谱（300 MHz，CDCl_三)δ（下午）：8.72（s，3×1H），8.48（d，J型=8.5赫兹，3×1H），7.32–7.21（米，3×3H），7.17–7.11（米，三×2H），5.76（td，J型=9.0，4.8赫兹，3×1H），3.50（日，J型=13.1，4.7赫兹，3×1H），3.04（dd，J型=13.0，9.4赫兹，3×1H）。计算C的HRMS（ESI-TOF）₃₆H（H）₃₁N个₆O（运行）_三硒_三: (M（M）+H）⁺, 834.9948; 发现，834.9949。

2.2. ATP酶活性的测定

使用Vogel&Steinhart（1976）描述的ATP再生系统在310 K下测量P-gp的ATP酶活性)由Urbatsch修改等。(1995). 简单地说，将1µg P-gp添加到100µl 50 mM（M）Tris–HCl pH 7.5缓冲液，含10mM（M）ATP，12米M（M）氯化镁₂，6米M（M）磷酸烯醇丙酮酸盐，1 mM（M）NADH、10单位乳酸脱氢酶、10单位丙酮酸激酶和一系列浓度的测试化合物。ATP水解通过OD时NADH吸光度的降低来确定₃₄₀使用Filtermax F5多波长分光光度计。ATP酶活性使用以下公式计算Δ外径/(∊×[蛋白质]×时间），其中ΔOD是吸光度的变化∊是NADH的消光系数。通过比较考马斯染色蛋白带的SDS–PAGE强度和已知量的BSA.EC来估计纯化的P-gp的浓度₅₀使用以下公式计算值GraphPad棱镜（GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥）使用整个浓度范围的非线性回归（曲线拟合）。

2.3. 钙调素-AM转运分析

钙黄绿素-AM（钙黄绿素乙酰氧基甲基酯）是一种膜透性P-gp底物，其游离酸钙黄绿质被内源性酯酶水解后，被困在胞浆中并显示出强荧光。它通常用于全细胞系统中基于荧光的P-gp转运分析（Al-Shawi&Senior，1993）). 在5µg ml的浓度下培养中国仓鼠卵巢CR1R12细胞⁻¹秋水仙碱维持P-gp过度表达。一般来说，～5×10⁵每个孔的CR1R12细胞在室温下用试验化合物以连续增加的浓度预处理15分钟；钙黄绿素-AM（0.25µM（M）)然后添加并在室温下培养15分钟，同时监测荧光强度（485 nm激发，535 nm发射）。100%是通过完全抑制CR1R12细胞中的P-gp获得的最大荧光。平均值和标准偏差是从四组实验中获得的。

2.4. 致敏试验

CR1R12细胞在秋水仙碱浓度增加的情况下以给定的受试化合物浓度生长3天。使用硫罗丹明B比色法测定细胞密度（Vichai和Kirtikara，2006). 100%是指不含秋水仙碱的生长。将亲代AUXB1细胞作为对照。

2.5. P-gp的表达、纯化、还原甲基化和结晶

基因优化小鼠P-gp(ABCB1a公司; GenBank JF834158）表达于毕赤酵母在BioFlo 415生物反应器（新不伦瑞克科学）中的10 l培养物中，通过缓慢添加甲醇（每升培养体积每小时3.6毫升）过夜诱导（Aller等。, 2009; 白等。, 2011). 通过单次通过Constant细胞破坏器（TS Series，Constant Systems Inc.）在287MPa下裂解细胞。通过离心法清除细胞碎片（12 500克，20 min，277 K），并通过38000离心制备粗膜克在277 K下持续2–3 h。如前所述纯化P-gp（Aller等。, 2009)经过修改。简单地说，含有P-gp的膜在冷缓冲液（100 m）中重新悬浮M（M）氯化钠、15%甘油、20 mM（M）Tris pH 8.0，23.4µM（M）leupeptin，7µM（M）E-64，4µM（M）凝乳抑素，14.5µM（M）胃蛋白酶抑制素A，1米M（M）PMSF，25米M（M）苯甲脒），并在277 K下用4.5%Triton X-100溶解1–2小时。在38 400下离心克和277 K处理30–60分钟，去除不溶物质，并使用FPLC（val KTA，GE Life Sciences）将上清液涂敷在Ni–NTA Superflow树脂（Qiagen）上。然后用0.5 m的缓冲液清洗柱M（M）TCEP（Thermo Scientific），0.04%胆酸钠（Sigma），20米M（M）咪唑pH 8.0，4.5%Triton X-100，100 mM（M）氯化钠，20米M（M）Tris–HCl pH 8.0，14%甘油。将树脂固定化P-gp缓冲交换至20 mM（M）HEPES pH 8.0，0.2 mM（M）TCEP，100米M（M）氯化钠，20米M（M）咪唑，0.04%胆酸钠，0.065%β-DDM公司。用20 m洗脱P-gpM（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）氯化钠，0.2米M（M）TCEP，0.04%胆酸钠，200 mM（M）咪唑pH 7.5，0.065%β-DDM公司。然后用20 m将洗脱的蛋白质按1:10稀释M（M）HEPES pH 8.0，100 mM（M）氯化钠，0.2米M（M）TCEP，0.04%胆酸钠，0.065%β-DDM并反弹至Ni–NTA Superflow树脂。用上述含有20 m的缓冲液清洗树脂M（M）咪唑，用上述含有200 m的缓冲液洗脱M（M）咪唑。然后浓缩蛋白质（Centricon YM-50或YM-100；Millipore），以95000转/分钟的转速旋转⁻¹（TLA120.1转子）在277 K下保持30–60分钟，并承受尺寸排除色谱法（SEC；Superdex 200 16/60，GE Healthcare），277 K。

SEC后，P-gp（约1–2 mg ml⁻¹)受到还原甲基化作用（Rayment，1997). 将新制得的硼烷二甲胺和甲醛添加到蛋白质溶液中，最终浓度分别为50和100 mM（M）然后在4°C下培养2小时。通过添加25 m的冰块，使反应停止M（M）甘氨酸，并在4°C下孵育30分钟。然后将甲基化P-gp浓缩至1 ml（Centricon YM-50或YM-100；Millipore），用9 ml淬火缓冲液（20 m）稀释M（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）氯化钠，0.2米M（M）TCEP，0.01%胆酸钠，0.035%β-DDM），并将该浓度/稀释步骤重复两次。在环肽共结晶的情况下，从50 mM（M）储存在100%二甲基亚砜中，最终浓度为2 mM（M）10ml中的环肽等分的约1–2 mg ml时的P-gp⁻¹隔夜孵化。第二天早上，通过浓缩至～1 ml并使用淬火缓冲液稀释至～15 ml，去除多余的环肽；在浓缩结晶试验之前重复两次。

P-gp晶体生长在24孔Cryschem板（汉普顿研究所）中，蛋白质浓度为～10–12 mg ml⁻¹使用蛋白质与母液比例为1:1的4µl坐滴液，使用含0.1的良好母液M（M）HEPES pH值7–8，50 mM（M）硫酸锂，10 mM（M）乙二胺四乙酸（EDTA），24-29.5%(w个/v（v）)聚乙二醇600。晶体在277 K下生长；它们通常在1-3天后出现，并在大约两周内继续生长到完全大小。

收集的晶体首先通过浸泡在0.1中进行低温保护M（M）pH值与晶体生长条件相同的HEPES，50 mM（M）硫酸锂，10 mM（M）乙二胺四乙酸，32%聚乙二醇600。晶体的尺寸通常为～650×400×300µm。

2.6. X射线数据采集，结构测定和精炼P-gp环肽共晶结构

斯坦福同步辐射实验室（SSRL；BL11-1）或加拿大光源（CLS；08ID-1）在100 K下收集X射线衍射数据。对P-gp–环肽共晶体进行荧光扫描，以最大限度地提高掺入硒的异常信号贡献（表1). 所有衍射数据均用MOSFLM公司（巴蒂等。, 2011)并减少了SCALA公司（Evans，2006年)在中央对手方清算所4套程序（Winn等。, 2011). 在QZ-Ala的情况下同晶晶体一起缩放以最大限度地提高完整性（表1). P-gp的3.4μl分辨率结构最初由分子置换（MR）与相位器（麦考伊等。, 2007)使用先前确定的P-gp结构（PDB条目4千立方厘米; 病房等。, 2013)作为一个没有修改的搜索模型。与我们2013年报道的相同的更“开放”的晶体形式相比，与改进的分辨率相一致，新的电子密度特征引导了我们模型的调整（沃德等。, 2013)并在补充图S2中进行了总结。残基30-32位于电子密度中，导致TM1之前第一螺旋（残基30-43）中残基的登记发生了随后的变化。对细胞内螺旋1（IH1；残基154–168）、细胞外环3（ECL3；残基318–338）和通向第一个NBD的部分TM6（残基358–387）的拓扑结构进行了修正。在NBD1中，重建了残留物398–404、424–427、520–526和597–602。肘部螺旋2（EH2）从残基689重建为708。一个注册问题从ECL4（残基738）修改为TM8（残基760），另一个问题是TM9、ECL5和TM10的开头部分（残基826-855）。调整了IH3的拓扑结构（残基795-806）、ECL6（残基961-967）和部分TM12（残基972-984）。在导致和促成NBD2的区域进行了进一步修改（残基1010–1028、1042–1047、1129–1137和1165–1172）。残基1272和1273也位于C末端的电子密度图中。至于迄今为止确定的P-gp的所有结构，“连接体”区域（残基627–688）不位于电子密度中。许多结构调整与最近的调整基本一致（李等。, 2014)根据2009年首次报道的P-gp更“封闭”构象的模型（Aller等。, 2009). 在精炼过程中，模型经历了刚体和约束位置精细化，H原子应用于其骑乘位置，使用菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012)针对最大似然带分组的目标函数B类因素、二级结构约束、参考模型约束和TLS。第轮，共轮精炼手工检查和纠正σ_A类-加权电子密度图库特（埃姆斯利等。, 2010)模型几何和立体化学的改进使用摩尔浓度（陈）等。, 2010). 后续环肽共晶结构通过MR或刚体求解精炼使用改进的3.4º分辨率模型，去除TM4（218–243）和EH2（689–694）中的残基，以避免它们在电子密度图中的位置出现偏差。然后以类似于3.4º分辨率结构的方式对这些结构进行了细化，并增加了一轮定位精炼带配体B类设置为Wilson的因子B类值。配体描述词典使用菲尼克斯·埃尔博（亚当斯等。, 2010)并使用以下方法验证了掺合硒的结晶位置反常散射方法。根据以下因素确定，精细结构具有良好的几何形状：摩尔浓度（陈）等。, 2010). 产生的结果细化统计如表1所示.

3.1. 环肽P-gp配体的合理设计与功能表征

先前的功能研究已经在P-gp的油腻、多特异性结合腔中确定了底物和抑制剂的至少四个，可能多达七个，有时重叠的结合位点（Shapiro&Ling，1997; 马丁等。, 2000). 为了探索这一现象，以前在一份研究报告中报道的环状肽QZ59-SSS（此处称为QZ-Val）共晶小鼠P-gp/Mdr1a（Aller）的结构等。, 2009)作为基础，设计了一系列硒标记的同三聚体环肽（图1一). 这个R（右）系统地改变该系列的基团，以生成丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸衍生化合物（分别为QZ-Ala、QZ-Val、QZ-Leu和QZ-Phe），增加R（右）-群大小和疏水性。

图1 硒标记的同源三聚环肽的结构和功能。(一)环肽系列的化学结构具有相同的骨架，但侧链的大小和疏水性（从左到右）系统地增加。(b)刺激纯化P-gp.QZ-Ala（绿色）的基础ATP酶活性，相对于基础活性，产生最高程度的刺激（～16倍），EC50值为0.92µM（M）之后是QZ-Val（蓝色；～7倍）。显示了维拉帕米（黑色）、QZ-Leu（黄色）和QZ-Phe（红色）的数据。(c（c）)抑制P-gp过度表达的CR1R12细胞中钙调素-AM的转运。每种化合物均采用与中相同的配色方案(b)并使用希尔方程对数据进行拟合。三重和四重实验的平均值和SD如所示(b)和(c（c）)分别是。

我们测量了每个配体对纯化P-gp的ATP水解基础水平的影响。我们的结果表明，较小的化合物更有刺激性，最显著的是，最小的配体QZ-Ala在测试浓度下以剂量依赖的方式有效刺激ATP水解，类似于维拉帕米（图1b). 与这些底物样相互作用一致，P-gp介导细胞对QZ-Ala的轻度耐药性（补充图S3）。这些数据表明，TMD处的QZ-Ala和QZ-Val的结合在较小程度上会向NBD发出信号，从而加速核苷酸水解。我们还使用过表达P-gp的CR1R12细胞对配体进行了表征。P-gp介导的钙调素-AM从细胞外转运出现了一种模式，即配体抑制输出的效力与R（右）-组大小（图1c（c）). 较小的QZ-Ala抑制钙调素-AM输出（IC₅₀=140牛顿M（M）)与QZ-Val（IC）相比最好₅₀= 1.7 µM（M）)，QZ亮氨酸（IC₅₀= 5.4 µM（M）)和QZ-Phe（IC₅₀= 24 µM（M）)（图1c（c）). 将数据拟合到Hill方程中，每种情况下的Hill系数都大于1，表明它们与至少两个位点的结合具有正合作性。所有四种化合物还阻止了P-gp介导的抗癌药物秋水仙碱的输出，并以剂量依赖的方式使CR1R12细胞敏化（补充图S4）。

3.2. 环肽配体配合物中P-gp的结构

在测定P-gp配体之前共晶结构，载脂蛋白小鼠P-gp/Mdr1a的改进结构被确定为3.4º分辨率。迄今为止，该模型是哺乳动物ABCB1/MDR1型转运体的最高分辨率结构（与人类P-gp的同源性为87%；图2，表1). 该模型与最近描述的模型相似（沃德等。, 2013)与2009年最初报道的情况有很大不同（Aller等。, 2009). 分辨率的提高也促进了电子密度图驱动的模型改进（见§2 材料和方法; 图2，表1)，结果更好精炼统计数据。

图2 分辨率为3.4º的鼠标P-gp概述。不同方向的放大插图显示为结果2毫发o个−DF公司c（c）电子密度（其中米是功绩和D类是σA类加权因子）1等高线σ; 单个跨膜螺旋以不同的颜色显示。TM1为红色，TM2为橙色，TM3为黄色，TM4为浅绿色，TM5为天蓝色，TM6为粉红色，TM7为深棕色，TM8为橄榄色，TM9为浅棕色，TM10为森林，TM11为深蓝色，TM12为深紫色。

审问R（右）-配体结合中的群体依赖性变化，共晶确定了P-gp与每个配体的结构（图3一, 3b, 3c（c）和4). 配体使用不同的电子密度和强反常散射来自三个三角化的Se原子（图3d日). 所有与P-gp结合的配体（图3d日)和大多数配位侧链在电子密度图中都得到了很好的解析。配体与结合囊残基发生许多相互作用（图4)，掩埋了配体的高比例溶剂可及表面积（补充表S1）。

图3 P-gp–环肽共晶结构概述。(一)与P-gp结合的同三聚环肽化合物的叠加，显示了它们在底物结合囊中的相对位置和方向。(b)在P-gp的底物结合囊中结合的子集A配体的两个方向（QZ-Ala和QZ-Val；显示为棒状）。QZ-Ala显示为绿色，QZ-Val.显示为蓝色。(c（c）)在P-gp的底物结合囊中结合的B亚群配体（QZ-Leu和QZ-Phe）的两个方向。QZ-Lue显示为黄色，QZ-Pher显示为红色(d日)配体特写图，颜色如(b)和(c（c）)，结果为2毫发o个−DF公司c（c）蓝色电子密度（轮廓水平1.0σ)异常差异密度峰值为粉红色（轮廓水平为3.0σ对于QZ-Ala、QZ-Va、Q-Phe和4.0σ用于QZ-Leu），用于硒原子（橙色球体）。

图4 与同三聚体环肽结合有关的关键P-gp残基。结合囊的立体图垂直于膜，从胞浆观察。P-gp残基显示为棒状，参与结合亚群A配体的残基呈黄色，参与结合亚群B配体的残基呈品红色。配体着色与图3所示一致; QZ-Ala，绿色；QZ-Val，蓝色；QZ-Leu，黄色；QZ Phe，红色。

4.1. 环肽配体与P-gp配合物的比较

我们的P-gp配体共晶结构显示了类似基底的广泛可能的结合模式（图3一). 在结合囊中，我们的结构将四个配体分为两个子集，这两个子集与大小和疏水性相关（图3b, 3c（c）和4). 较小的配体QZ-Ala和QZ-Val（子集A）共享上下结合位点（图3b和4)，而更大且更疏水的配体QZ-Leu和QZ-Phe（子集B）共享不同的上结合位点，而QZ-Pher也与第二个独特的下结合位点结合（图3c（c）和4). P-gp由两个伪对称半体组成，每个半体包含六个跨膜（TM）螺旋束。从膜平面上看，结合在A亚群和B亚群上部位置的配体楔入腔顶，与两个伪手的TM螺旋啮合（图3b和3c（c）). 相反，下部位点中的配体与P-gp的不同假手性相互作用，这些假手性对每个配体子集都是互斥的（图3b, 3c（c）和4).

4.2. TM4在配体结合时的运动

在apo小鼠P-gp的先前结构中，以及与B亚群有关的配体中，TM4采用了以较弱的电子密度为特征的大部分直螺旋构象，这表明了区域灵活性（Ward等。, 2013). A亚组配体不仅显示出有序的TM4，而且还显示出巨大的构象变化（当比较相应的C^α位置；图5一). 这种结构扭结不太可能是晶格接触的结果，因为晶体形式相同（表1). 因此，我们必须得出结论，A亚群配体的结合导致TM4发生这些变化。这种配体结合诱导的TM4扭结开始于Pro219，然后回到球窝区Tyr243的apo野生型拓扑结构（Loo等。, 2013)接近NBD2。

图5 EH2配体结合位点和TM4的配体诱导运动概述。(一)与TM4在子集B中的“直”拓扑结构相比，图中显示了TM4对子集A配体的扭结（蓝带）共晶结构（红丝带）。QZ-Val配体的位置和由此产生的2毫发o个−DF公司c（c）电子密度（轮廓为1.0σ)将显示。残留物Pro219和Trp228显示为黄色球体。(b)QZ-Val结合在EH2位点，P-gp呈现为分子表面表示。结果2毫发o个−DF公司c（c）配体的电子密度显示在1.0的等高线水平σ硒原子（橙色球体）的异常差异峰显示为3.5σ。特写插图将周围的TM9和TM12分别描绘为棕色和紫色树枝，而EH2则描绘为黑色树枝。靠近配体（Trp694、Phe990和Tyr994）的残基被标记。

观察到TM4在底物/配体结合上的运动可能具有重要的生物学意义。TM4和TM6构成一个膜内入口，用于底物进入结合腔，这些螺旋的构象变化可能会影响配体的进入和结合（Loo&Clarke，1994, 2005; 呜呜叫等。, 2008). 在最近的结构中氰化汞P-gp，野生型蛋白中TM4的一部分固有紊乱（Kodan等。, 2014). 该区域的突变不仅导致有序、直链构象，而且功能上破坏了底物运输，表明TM4在促进底物进入和/或结合（Kodan等。, 2014). 对于共晶属于A亚类配体的结构，TM4的运动使残基221–228更接近低结合位点中的结合配体，促进与Trp228的分子间相互作用，Trp228是类固醇与P-gp（Gruol）结合的残基等。, 2002). 我们认为TM4在结合亚群A化合物上的运动提供了近十年前提出的P-gp药物结合诱导效应模型的结构一瞥（Loo等。, 2003b).

几种配体可将P-gp的ATP水解基本速率提高几倍（Al-Shawi&Senior，1993）; 安布德卡等。, 1992; 斯卡伯勒，1995年; 图1b). 然而，将TMD中的配体结合与NBD中增加的ATP转换偶联的机制尚不完全清楚。对P-gp和细菌同源物MsbA的交叉链接和FRET研究表明，配体结合导致在存在核苷酸，导致催化作用增加（萨博等。, 1998; Eckford&Sharom，2008年; Liu和Sharom，1996年; 卢等。, 2003一; Siarheyeva&Sharom，2009年; 王等。, 1998; 斯卡伯勒，1995年; Doshi&van Veen，2013年). 具体而言，TM4中的构象变化与TMD–NBD耦合有关（Doshi&van Veen，2013)，与我们的模型一致。在我们的结构中，配体更像是ATP酶的激活剂（图1b; QZ-Ala和QZ-Val；亚群A）扭结TM4，而那些功能更多的ATPase活性抑制剂（QZ-Ile和QZ-Phe；亚群B）维持TM4的直螺旋，正如在载脂蛋白结构中观察到的那样。这里，我们只证明了两种不同的配体亚群引起的TM4（扭结或直螺旋）的两种不同变化。TMD中可能存在其他配体结合位点，从而导致TM4或延伸至NBD的其他TM螺旋的相应结构变化。例如，TM螺旋结构扭结程度的变化可能适用于其他化合物。

在本研究中，我们无法解决延伸至NBD2的细胞内螺旋（残基242-256）的长程结构变化，这将为TM4和NBD2之间任何潜在耦合机制的确切性质提供进一步的见解。有几种可能解释这一观察结果。例如，TM4延伸至NBD2的结构变化可能只发生在转运器从宽开口到闭合的向内面构象时，即NBD开始接触的位置。这些变化也可能需要ATP的存在，而ATP在这些结构中是不存在的。另一种可能性是，这些结构变化可能太小，无法使用我们当前的数据解决。如果是这样，使用这些模型并结合其他生物化学衍生的限制条件进行的计算研究对于理解P-gp中的底物模拟ATP水解是如何启动的非常有价值。结合其他补充研究（Loo等。, 2003一; Doshi&van Veen，2013年)，我们的结构为配体诱导的fit机制提供了一个起始的分子结构框架，该机制将结构变化从TMD传递到NBD。

4.3. 膜界面上的配体结合位点

先前的生物化学实验已经提出，P-gp从质膜的内叶中挤出药物，起到所谓的“疏水真空吸尘器”的作用（Raviv等。, 1990; 德格拉夫等。, 1996; Bolhuis公司等。, 1996). 在我们的QZ-Val中共晶结构，我们在P-gp的外部观察到一个额外的结合位点，该位点由TM9、TM12和EH2的残基结合（图5b). 该部位远离转运蛋白，但靠近预测的膜-水界面和膜内底物入口。据报道，EH附近的药物结合使用电子顺磁共振细菌P-gp同系物脂类（思密特等。, 2009). 这些数据有力地证明了在中央结合腔（Dey等。, 1997; Al-Shawi&Omote，2005年).