RAG1(179615)和RAG2启动V(D)J重组过程,在该过程中,免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因的可变(V)、多样性(D)和连接(J)编码元件结合在一起,生成抗原特异性B细胞和T细胞接收器。两个RAG1分子和两个RAG2分子形成异四聚体,与V、D和J基因两侧的重组信号序列(RSS)结合,并在DNA中引入双链断裂,随后通过非同源末端连接DNA修复途径进行修复。RAG1包含RNase H折叠催化结构域和与RSS直接接触的区域,并负责RAG复合物的酶活性。RAG2通过扫描基因组以获得组蛋白-3(H3;参见602810)在lys4(H3K4me3)三甲基化的酶标记来促进DNA结合,并促进RAG1的切割功能(由Bosticardo等人审查,2021年)。
Oettinger等人(1990年)证明,RAG1基因(179615)与邻近基因RAG2的共同转染导致V(D)J重组频率至少增加1000倍,而RAG1单独诱导重组酶活性无效。Oettinger等人(1990年)报告称,2.1-kb的RAG2 cDNA编码527个氨基酸的假定蛋白质,其序列与RAG1的序列无关。与RAG1一样,RAG2在进行V(D)J重组的物种之间是保守的,其表达模式与V(D。RAG1和RAG2基因产物可能直接参与重组反应。
Lin和Desiderio(1994)发现,在未成熟的B细胞系和正常胸腺细胞中,RAG2蛋白优先在细胞周期的G0/G1期积累,并在细胞进入S期之前下降至少20倍。在S期、G2期和M期,RAG2蛋白的量始终较低。RAG1蛋白的含量波动较小。RAG2蛋白的变异可能是通过转录后机制确定的,至少部分是这样。这些观察结果向Lin和Desiderio(1994)表明,V(D)J重排完全或优先发生在G0/G1内。
在复合信号序列中形成双链断裂是V(D)J复合的早期步骤。McBlane等人(1995年)表明,纯化的RAG1和RAG2蛋白足以进行该反应。裂解反应可分为两个不同的步骤,即刻痕和发夹形成,每个步骤都需要信号序列和两种RAG蛋白的存在。
通过对RAG1和RAG2中的酸性氨基酸残基进行定点突变,Landree等人(1999)和Kim等人(1999年)确定了3个RAG1突变体,这些突变体保留重组信号序列的正常结合,但对缺口和发夹形成均无催化活性。数据表明,RAG1中的1个活性位点执行这两个步骤,并且这些氨基酸中至少有一个与金属离子接触并协调,而金属离子是裂解所必需的。结果还表明,RAG1包含RAG1/RAG2 V(D)J重组酶的大部分(如果不是全部的话)活性位点。
Hikida等人(1996年)报告称,在与白细胞介素-4(147780)和共刺激物(脂多糖和其他细胞因子)联合培养后,RAG1和RAG2在成熟小鼠B细胞中表达。免疫小鼠引流淋巴结中也检测到再次表达。Hikida等人(1996年)指出,先前报道的研究表明,RAG1和RAG2仅在未成熟的B细胞中表达。
Yu等人(1999年)研究了含有荧光指示剂的细菌人工染色体(BAC)转基因在体内对RAG1和RAG2的调控。RAG1和RAG2在B细胞和T细胞中的协调表达受到在RAG2基因的5-prime侧发现的不同遗传元件的调节。这一观察结果表明,不对称排列的顺式DNA元件可以影响原始转座子的表达,从而捕获脊椎动物进化所需的RAG。
在B细胞和T细胞的发育过程中,RAG1/RAG2蛋白复合物在保守重组信号序列(RSS)处切割DNA,以启动V(D)J重组。RAG1/RAG2还催化含有RSS底物的转座链转移到靶DNA中,形成分支DNA中间体。Melek和Gellert(2000)表明,RAG1/RAG2可以通过2条途径分解这些中间产物。RAG1/RAG2以一种与导致染色体易位的模型一致的方式,催化与转座RSS末端相邻的靶DNA上的发夹形成。或者,崩解将转座供体DNA从中间体中移除。在镁浓度较高的情况下,如哺乳动物细胞中的镁浓度,分解是首选的分解途径。作者认为,这可能部分解释了为什么RAG1/RAG2介导的转座在细胞中没有高频发生。
“kelch”基序以果蝇中首次发现的一个序列命名,是一个44-56-氨基酸片段,其一级序列同源性较低。其特征是存在4个疏水残基,然后是一个双甘氨酸元素,在可变间距后,酪氨酸和色氨酸残基被6个氨基酸分开。通常,其中4到7个基序形成一个kelch重复域和一个β螺旋桨,每个基序形成对应于螺旋桨的1个叶片的4股β片(Adams等人,2000)。Callebaut和Mornon(1998)通过疏水簇和间隙BLAST分析确定,RAG2的N末端355个残基由6倍的海藻重复序列组成,在活性核心中形成6叶片螺旋桨。他们提出,RAG2的螺旋桨结构可以作为RAG1(179615)一侧和DNA另一侧的结合支架。
邱等人(2001)针对RAG2中每个保守的碱性氨基酸进行了定点突变,发现了几个功能分离突变体。对这些突变体的分析表明,RAG2有助于识别或切割扭曲的DNA中间产物,并在V(D)J重组的连接步骤中发挥重要作用。此外,一些突变体在体外阻断了RAG介导的发夹开放,这一发现在这种生化活性和体内编码关节形成之间提供了关键联系。
Corneo等人(2007年)发现,去除小鼠Rag蛋白的某些部分后,NHEJ缺陷细胞中显示出强大的选择性非同源末端连接(NHEJ)活性,甚至在野生型细胞中也显示出一些选择性连接活性。Corneo等人(2007年)提出了一个2层模型,其中Rag蛋白与NHEJ因子协作,以在V(D)J重组期间保持基因组完整性。
Matthews等人(2007年)表明,RAG2包含一个植物同源结构域(PHD)指,该指可特异识别H3K4me3。小鼠RAG2 PHD手指与H3K4me3结合的高分辨率晶体结构揭示了RAG2识别H3K4me3的分子基础。消除RAG2对H3K4me3的识别的突变在体内严重损害了V(D)J重组。降低H3K4me3的水平类似地导致体内V(D)J重组的减少。值得注意的是,一种保守的色氨酸残基(W453)在免疫缺陷综合征患者(Omenn综合征;603554)中发生突变,它构成K4me3结合表面的关键结构成分,对RAG2识别H3K4me3.至关重要。Matthews等人(2007年)总结道,他们的结果确定了哺乳动物DNA重组中组蛋白甲基化的新功能。此外,他们的结果提供了第一个证据,表明干扰组蛋白修饰的读取可以导致遗传性人类疾病。
Deriano等人(2011年)表明,尽管RAG2 C末端对于重组来说是必不可少的,但对于维持基因组稳定性至关重要。来自“核心”Rag2纯合(Rag2c/c)小鼠的胸腺细胞显示Tcr-alpha(TCRA;见186880)/delta(见186810)基因座完整性的显著破坏。此外,所有Rag2c/c p53(191170)缺失小鼠,与Rag1c/c p53-null和p53-nulel动物不同,都会迅速发展为胸腺淋巴瘤,其染色体易位、扩增和缺失涉及Tcr-alpha/delta和Igh(147100)位点。Deriano等人(2011年)也在Atm-null小鼠的淋巴瘤中发现了这些特征。Deriano等人(2011年)表明,与ATM(607585)缺陷一样,核心RAG2严重破坏了RAG离体后复合体的稳定性。Deriano等人(2011年)的结论是,他们的结果揭示了RAG2的一种新的基因组保护作用,并表明类似的“最终释放/最终持久性”机制是Rag2c/c p53-null和Atm-null小鼠基因组不稳定性和淋巴癌的基础。
使用染色质免疫沉淀分析,Ji等人(2010年)证明,小鼠Rag蛋白结合在淋巴细胞发育过程中受到严格调控,主要集中在一个包含IgH、Igk(见147200)、Tcrb(见186930)和Tcra基因座中J和J近端D基因片段的小区域。这些区域,作者称之为重组中心,富含激活组蛋白修饰和RNA聚合酶II(见180660)。Rag2在基因组中广泛结合于H3的lys4处发生实质性三甲基化的位点(参见601128)。相反,Rag1结合更具特异性,主要发生在V、D和J基因片段两侧的重组信号序列(RSS)上。Ji等人(2010年)提出,重组中心是局部RAG浓度较高的特殊位点,有助于RSS结合和突触,并有助于调节重组顺序。
Oettinger等人(1990年)报告说,RAG2的基因组大小约为18 kb。收敛转录的RAG1和RAG2基因是不寻常的,因为它们的大部分(如果不是全部的话)编码序列和三重非翻译序列都包含在一个外显子中。
晶体结构
Matthews等人(2007年)确定了RAG2 PHD-H3K4me3复合体的晶体结构,分辨率为1.15-angstrom。结构显示,RAG2 PHD K4me3结合表面并非两侧、背部和顶部闭合(如其他PHD手指所观察到的),而是顶部开放,类似于“芳香通道”而非“芳香笼”作者认为,这种“通道”构象可能提供了一种调节组蛋白结合的机制。
Kim等人(2015)报告了小鼠RAG1(179615)-RAG2复合体的晶体结构,分辨率为3.2-angstrom。230-kD RAG1-RAG2异四聚体为Y形,2条RAG1链的氨基末端结构域形成缠绕的柄。每个RAG1-RAG2异二聚体组成Y的1个臂,活性位点位于中间,RAG2位于顶端。RAG1-RAG2结构使免疫缺陷患者中发现的60多个突变以及大量遗传和生物化学数据合理化。
Oettinger等人(1990年)发现RAG1和RAG2之间只有8 kb的距离。
Schwarz等人(1996年)报告称,严重联合免疫缺陷患者可分为B淋巴细胞阳性SCID患者和无B淋巴细胞阴性SCID患者。他们通过使用重叠整个RAG1和RAG2编码区的引物盒进行SSCP分析,在B阴性SCID患者中搜索RAG1与RAG2突变。14名B阴性SCID患者中有6名携带重组酶激活基因突变。突变导致通过基因重组无法形成抗原受体。在2个家族中,3名患者的RAG2扩增子迁移模式发生改变。然后对PCR产物进行测序。发现两名相关患者纯合子,其错义突变导致RAG2中cys476-to-tyr突变(179616.0001)。一名患者被发现从母亲那里遗传了一个RAG2错义突变(R229Q;179616.0002),从父亲那里遗传了涉及RAG1和RAG2的缺失。瞬时转染试验表明,SCID相关RAG2突变显示V(D)J重组活性完全丧失或显著降低。
Villa等人(1998年)报告称,Omenn综合征(603554)患者的RAG1(179615)或RAG2基因发生错义突变,导致这两种蛋白部分活性,这是一种严重的免疫缺陷,其特征是存在活化的无反应性寡克隆T细胞、嗜酸性粒细胞增多症和高IgE水平。其中两个氨基酸替换位于RAG1同源结构域内,降低了DNA结合活性,而另外三个氨基酸替换降低了RAG1/RAG2相互作用的效率。这些发现提供了证据,表明Omenn综合征患者的免疫缺陷是由降低V(D)J重组效率的突变引起的。
Gomez等人(2000)在2名患者中发现了预测的RAG2 kelch结构域重复序列2和5的第二β链内的gly95至arg突变(179616.0005)和ile273缺失(179616.0006),分别导致Omenn综合征和SCID。通过共聚焦显微镜分析,他们确定突变不会损害细胞核定位,但确实降低了RAG2与RAG1相互作用和介导重组信号切割的能力。此外,通过对一组突变体的分析,他们表明β片第二链中的疏水和富含gly的区域对RAG1-RAG2相互作用至关重要。
Tabori等人(2004年)对6例T阴性/B阴性SCID和8例Omenn综合征患者的RAG1和RAG2基因的PCR产物进行了突变分析。14个家庭中有7个报告有血缘关系。这些患者均无RAG1基因突变,但Tabori等人(2004年)在8例Omenn综合征患者中的6例和6例SCID患者中的4例中发现了RAG2基因的4个错义突变(见179616.0007)。
Yu等人(2014)对来自2名自身免疫和/或肉芽肿性疾病患者的CD4(186940)阳性和CD8(见186910)阳性T细胞中TCR-β的互补性决定区域-3(CDR3)进行了深度测序,但不是由RAG1或IL2RG(308380)突变引起的严重免疫缺陷;RAG1或RAG2突变引起的Omenn综合征5例;2例由ZAP70(176947)突变(见269840)或非典型DiGeorge综合征(188400)引起的Omenn综合征样表型患者;和4名健康对照。他们发现,与对照组和非RAG1或RAG2突变导致的Omenn综合征患者相比,RAG1和RAG2基因突变导致的患者TCR-β多样性较差。与自身免疫和肉芽肿性疾病相关的RAG1或IL2RG突变的2名患者的多样性并没有降低,而是出现了V-J配对和CDR3氨基酸使用的偏斜。Yu等人(2014)得出结论,RAG酶功能可能是正常CDR3连接多样性所必需的,TCR生成异常而非数值多样性可能会导致SCID亚型患者的免疫失调。
在携带生殖系突变的转基因小鼠中,RAG2编码区的大部分被删除,Shinkai等人(1992年)发现,尽管纯合子是活的,但它们不能产生成熟的B或T淋巴细胞。初级淋巴器官中存在未成熟淋巴细胞;然而,这些细胞并没有重新排列其免疫球蛋白或T细胞受体位点。因此,RAG2功能的丧失导致完全不能启动V(D)J重排,导致严重联合免疫缺陷(SCID)表型。由于SCID表型是在这些小鼠中检测到的唯一明显异常,因此RAG2功能和V(D)J重组酶活性本身不需要用于淋巴细胞以外的细胞的发育。
Shankaran等人(2001年)发现,与野生型小鼠相比,缺乏淋巴细胞特异性Rag2基因、Ifn受体信号转录因子Stat1(600555)、Ifngr1(107470)或Rag2和Stat1的小鼠更容易发生化学诱导的肿瘤形成,这表明T、NKT、,和/或B细胞对于抑制化学诱导肿瘤的发展至关重要。野生型小鼠未发生自发性恶性肿瘤,一半缺乏Rag2或Stat1的小鼠发生较晚,但82%缺乏这两种基因的小鼠发生较早。野生型小鼠排斥来自淋巴细胞缺乏小鼠(Shankaran等人,2001)或Ifng-无反应小鼠(Kaplan等人,1998)的化学诱导移植瘤,但不排斥来自免疫活性宿主的肿瘤,表明免疫缺陷小鼠的肿瘤具有更强的免疫原性,淋巴细胞和IFNG/STAT1信号通路共同形成肿瘤的免疫原表型,最终形成免疫活性宿主。Shankaran等人(2001年)提出,肿瘤是由其形成的免疫环境所决定的,“癌症免疫编辑”而非“免疫监视”最能描述免疫反应对发展中肿瘤的保护和塑造作用。
Rideout等人(2002年)使用免疫缺陷的Rag2-/-小鼠作为核供体,将其转移到去核卵母细胞中,并培养产生的囊胚,以分离出一个等基因胚胎干(ES)细胞系。Rag2-/-ES细胞中的一个突变等位基因通过同源重组修复,从而恢复正常的Rag2基因结构。用修复后的ES细胞以2种方式处理突变小鼠:(1)通过四倍体胚胎补体从修复后的胚胎干细胞中产生免疫力低下的小鼠,用作骨髓移植供体;(2)造血前体通过体外分化从修复的ES细胞中获得,并植入突变小鼠。移植后3-4周可检测到成熟的髓细胞和淋巴细胞以及免疫球蛋白。这些结果为通过治疗性克隆与基因治疗相结合来治疗遗传病奠定了一个范例。
Marrella等人(2007年)建立了一种敲除小鼠模型,在该模型中,内源性Rag2被替换为携带Omenn综合征和SCID患者中发现的R229Q突变的Rag2。这些小鼠表现出T细胞寡克隆性、循环B细胞缺乏和外周嗜酸性粒细胞增多。此外,肠道和皮肤的T细胞浸润会导致腹泻、脱发,在一些小鼠中还会导致严重的红皮病。这些发现与Aire胸腺表达减少(607358)和调节性T细胞和NKT淋巴细胞显著减少有关。Marrella等人(2007年)得出结论,Rag2 R229Q纯合小鼠模拟了人类Omenn综合征的大多数症状,Omenn综合症的病理生理学涉及免疫耐受受损和免疫调节缺陷。