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研究文章

分析瓣膜性心脏病患者左心房的microRNA特征揭示其在心房颤动中的意义

  • 罗莎·多尼亚特·普埃尔塔斯，

    角色概念化，调查，方法，写作–审查和编辑

    附属法国里昂里昂大学UMR CNRS 5310-INSERM U1217神经肌肉基因研究所（INMG）

    ⨯
  • 奥黛丽·贾拉伯特，

    角色调查

    附属法国里昂大学里昂-苏德医学院CarMeN实验室（UMR INSERM 1060-INRA 1397，INSA）

    ⨯
  • Emmanuelle Meugnier，

    角色形式分析，软件

    附属法国里昂大学里昂-苏德医学院CarMeN实验室（UMR INSERM 1060-INRA 1397，INSA）

    ⨯
  • 瓦妮莎·尤西尔，

    角色调查，监督

    附属法国里昂大学里昂-苏德医学院CarMeN实验室（UMR INSERM 1060-INRA 1397，INSA）

    ⨯
  • 菲利普·雪瓦利埃 ,

    为这项工作做出了同等贡献：菲利普·谢瓦利埃，索菲·罗马

    角色资金收购，调查，监督，写作–审查和编辑

    srome@univ-lyon1.fr公司（SR）；philippe.chevalier@chu-lyon.fr（个人电脑）

    附属公司神经肌肉基因研究所（INMG），UMR CNRS 5310-INSERM U1217/法国里昂里昂大学，法国布隆市里昂公民收容所Louis Pradel心脏病学医院心律科

    ⨯
  • 索菲·罗马

    为这项工作做出了同等贡献：菲利普·谢瓦利埃，索菲·罗马

    角色概念化，数据管理，形式分析，资金收购，调查，方法，项目管理，资源，软件，监督，写作——原稿，写作–审查和编辑

    srome@univ-lyon1.fr（SR）；philippe.chevalier@chu-lyon.fr（个人电脑）

    附属法国里昂大学里昂-苏德医学院CarMeN实验室（UMR INSERM 1060-INRA 1397，INSA）

    ⨯

摘要

背景

在可能导致心房颤动发生和持续的潜在因素中，miRNAs的失调被提出。因此，在本研究中，我们利用TaqMan定量了662个成熟人类miRNAs在左心房（LA）的基本表达，这些人来自接受心脏瓣膜修复手术的患者，无论是否患有心房颤动（AF）®低密度阵列（v2.0）。

结果

在所有患者表达的299个miRNA中，42个miRNA改变了AF患者的基础表达。Targetscan（物种间保守位点）结合位点预测表明，上调和下调的miRNA分别控制3310和5868个基因。为了确定在改变的miRNAs控制下最相关的细胞功能，我们重点研究了每个列表中的100个最具靶向性的基因，并确定了这些基因中的5个功能蛋白网络。上调的网络参与昼夜节律的同步性和AKT/PKC信号通路的控制(我.e（电子）.，增殖/粘附）。下调的网络是IGF-1通路和TGF-β信号通路以及参与RNA介导的基因沉默的网络，这首次表明房颤中miRNA的改变也会干扰整个miRNA机制。然后我们将miRNA预测基因列表和类似房颤患者中改变的mRNA列表交叉，我们发现分别有44.5%和55%的上调和下调mRNA被预测为改变的miRNA的保守靶点（3'-UTR中至少有一个结合位点）。由于它们参与了上述相同的生物过程，这些数据表明，AF患者先前在LA中发表的大部分转录缺陷可能是由于转录后水平的缺陷引起的，并且涉及miRNAs。

结论

我们的严格分析使我们能够识别LA中miRNA控制下的高靶向蛋白质网络，其中突出了那些miRNA特征改变的AF患者中特别受影响的蛋白质网络。现在需要进一步的研究来确定房颤病理中miRNA水平的改变是否是因果性的，还是代表着防止心脏电重构和结构重构的适应。

引用：Doñate Puertas R，Jalabert A，Meugnier E，Euthine V，Chevalier P，Rome S（2018）对瓣膜性心脏病患者左心房微RNA信号的分析揭示了其在心房颤动中的意义。公共科学图书馆·综合13（5）：e0196666。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666

编辑：阿尔芬斯·纳瓦罗（Alfons Navarro），西班牙巴塞罗那大学

收到：2017年11月24日；认可的：2018年4月17日；出版：2018年5月3日

版权：©2018 Doñate Puertas等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。

数据可用性：所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

基金：这项工作得到了医学基金会（编号DRM20101220456）的支持（授予SR）；https://www.frm.org/chercheurs/accueil网站资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

缩写：AF、，心房颤动；体重指数，体质指数；计算机断层扫描，阈值周期；HEK293T，人胚肾293T细胞系；IGF-1，胰岛素样生长因子1；洛杉矶，左心房；miRNA，微RNA；MVD、，二尖瓣疾病；PCR，聚合酶链反应；光伏，肺静脉；RA、，右心房；TBP、，TATA盒结合蛋白；TGF、，转化生长因子；VHD、，瓣膜性心脏病

背景

心房颤动（AF）是临床实践中最常见的心律失常[1]. 它的特点是向心室发出不规则的冲动，是栓塞性卒中的主要原因[1,2]. 房颤与左心房（LA）的心房重塑有关[三,4]目前尚不清楚房颤是否是由心脏病和有害环境因素引起的心房重构的最终结果[5]或者是重塑的主要原因，使其持续发展。在过去的十年里，对房颤机制的理解有了巨大的进步，许多基因[6–8]和表观遗传因素[9–11]已确定。在这种情况下，microRNAs（miRNAs）最近被添加到与房颤发展相关的分子因子列表中[11–17]尤其是心房重构的两个基本组成部分，即电重构(我.e（电子）.离子通道的改变）[18–22]和纤维化引起的结构重塑[12,23–28]. MiRNAs是心脏疾病的新调节器、生物标记物和治疗靶点[29–31]. 它们代表了一类进化上保守的非编码小RNA，起到基因表达的负调控作用[32]. 成熟miRNAs通过结合靶mRNAs和多蛋白RNA诱导的沉默复合物调节转录后基因表达[33]. 已经描述了通过miRNA进行基因调控的三种机制：（i）翻译抑制[32]，（ii）直接mRNA降解[34]和（iii）miRNA-介导的mRNA衰变[35]. 由于这些小RNA可以调节多个靶mRNA，单个mRNA可以被多个miRNAs靶向，因此，miRNA的解除调控是几种病理状态的标志也就不足为奇了。在房颤的背景下，一组miRNAs被鉴定为能够作为离子通道蛋白的调节器参与房颤[36]或与房颤发展有关，基于其在房颤患者心房中的基础表达改变[37,38]. 最近，我们对与房颤相关或不相关的瓣膜性心脏病（VHD）患者的人类LA进行了转录组学分析，以确定与房颤条件相关的转录特征，并证明启动子高甲基化与这些转录改变中的一些相关[39]. 为了确定miRNA失调是否也与心房颤动发展相关的心脏重塑有关(我.e（电子）左心房扩张和间质纤维化）我们使用TaqMan定量了房颤患者LA中662种不同成熟人类miRNA的miRNA水平®低密度阵列（v2.0）。在所有患者中表达的299个miRNA中，有42个miRNA的基础表达发生了改变，证实了miRNA参与了病理学。电子预测表明，它们参与了几个与房颤相关的重要生物过程和功能途径，如TGF-β1和胰岛素样生长因子1（IGF-1）信号传导、增殖和细胞粘附（MAPkinase和AKT途径），以及昼夜节律的昼夜钟/同步性，而且在RNA介导的基因沉默中(我.e（电子）.AGO/EIF2C蛋白）和miRNA机制(我.e（电子）TNRC6蛋白），进一步表明LA中miRNAs的改变实际上会扰乱整个miRNome。进一步的生物信息学分析表明，这些改变的miRNAs可能解释了先前被确定为与病理相关的部分改变的转录特征[39]据预测，改变后的miRNA将靶向房颤患者LA中改变的mRNA的一半。

方法

患者特征

许多心血管疾病容易发生房颤。然而，房颤患者的心脏组织通常与健康受试者的组织进行比较，这可能掩盖了与其他相关心脏疾病相比与房颤（一种左心房疾病）具体相关的变化的识别。因此，要确定与房颤病理学相关而非瓣膜性心脏病相关的miRNA特征，使用患有独特心脏病理学的对照组至关重要。从Louis Pradel心脏病学医院（Hospices Civils de Lyon，Bron，France）接受心脏手术进行瓣膜修复的8名患者中获取LA或肺静脉（PV）-LA连接处的样本。组织样品在液氮中快速冷冻，并立即储存在-80°C。本研究得到里昂伦理委员会的批准，并获得每位患者的知情同意（DC2015-2566）。患者临床特征见表1在这8名参与者中，有4名患有AF。患有和不患有AF的患者在药物治疗或体重指数（BMI）方面没有显著差异。

缩略图
下载：
表1。患者代谢参数，登记用于左心房miRNA定量。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.t001

MiRNA分析

用mirVana从心脏活检中提取总RNA™miRNA分离试剂盒（Ambion，AppliedBiosystems）。我们使用TaqMan定量了662个不同成熟人类miRNAs（Sanger miRBase v14）的表达®低密度阵列2.0版，Applied Biosystems 7900HT快速实时聚合酶链反应（PCR）系统配备384孔反应板[40]. 150ng总RNA用于使用Megaplex进行反转录™RT底漆。与Megaplex的预放大反应™PCR反应前进行PreAmp引物。使用标准条件进行实时PCR。仅选择8例患者中表达的miRNA进行进一步分析（n=315）。为了减少使用任意miRNA作为归一化校正因子引起的偏差，使用平均归一化分析，根据FA患者和对照组在每个阵列上的总miRNA表达的相对表达，对其miRNA表达进行比较。第页-值（未付学生的t吨-test）计算以基于阈值周期（Ct）值测试特定miRNA的差异。

分层聚类

使用成对平均连锁聚类计算层次聚类，并使用GenePattern绘制（v3.2.3，http://pwbc.garvan.unsw.edu.au/gp, [41,42]).

生物信息分析

MiRNA靶基因预测来自Targetscan 7.0(http://www.targetscan.org/vert_70/) [43]它通过搜索与每个miRNA的种子区域相匹配的8、7和6分子位点来预测miRNA的生物靶点[44]. miRNA功能的预测是通过使用DIANA-miRPathv3来确定的。0 (http://www.microrna.gr/miRPathv3) [45]. 使用STRING 10.5鉴定功能蛋白关联网络(https://string-db.org/) [46]. 使用BABELOMICS 4.3测定细胞KEGG途径的富集(http://v4.babelomics.org/) [47].

细胞培养

为了验证候选miRNA与预测靶基因的结合，人类胚胎肾293T细胞系（HEK293T，ATCC®CRL-1573型™)已使用。细胞生长在37°C、5%CO2湿化环境中的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM，PPA实验室）中，该培养基含有4.5 g/l葡萄糖、10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素（PPA实验）以及1%谷氨酰胺。所有实验均使用80%汇合处的指数生长细胞。

双荧光素酶报告分析

的3'-UTR区域Smyd2公司在pEZX-MT01中克隆，这是来自GeneCopoeia（#HmiT054794，Inc.，Rockville，MD，USA）的萤火虫/Renilla Duo-Luciferase报告载体。将MiR-519b-3p或MiR-519b-3p前体克隆在同样表达GFP的pEZX-MR04载体中（#Hmi R0453；#Hmi R0320，GeneCoppoemy™，Inc.，美国马里兰州罗克维尔）。HEK293T细胞以~3x10的密度进行电镀512孔板中每孔的细胞数。两天后，细胞被转染成四份Smyd2公司通过使用ExGen500转染试剂（EUROMEDEX），与miR-519a-3p或miR-519-3p前体或空pEZX载体共有的3'-UTR序列用作对照。48h后，使用Dual-Glo法在细胞裂解液上测量萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性®带有GLOMAX的荧光素酶报告分析系统（PROMEGA）™20/20光度计（Promega），采集时间设置为10秒。萤火虫荧光素酶活性的值与每个转染孔的Renilla荧光素酶活性值进行了标准化。

MiR-519b-3p过度表达

按照制造商的方案，使用ExGen500转染试剂（Euromedex）进行转染。以1:5的比例（μg DNA/μl ExGen500试剂）用pre-miR-519b-3p转染80%融合的HEK293T细胞。48h后，用TRIzol提取转染细胞的总RNA®试剂（T9424，Sigma-Aldrich）和Smyd2型用1μg总RNA（Sens_5´AGGCAGACATCCGAGAC；安提森斯_5´ATGGCCTGTACATCGTG)在Rotor Gene 6000系统（Corbett Life Science，Paris，France）上使用SYBER Green（Thermo Scientific）。相对变化Smyd2公司根据Ct值估计，并归一化为相应样品中测定的TATA盒结合蛋白（TBP）的相应Ct值。

统计分析

数据表示为平均值±SEM。对于两两比较，学生的t吨-使用了测试。当第页<0.05.

结果

miRNAs参与人类LA的组织维持和结构

来自LA或PV-LA交界处的组织取自8例伴有或不伴有AF的VHD患者。两组之间在年龄或BMI方面没有显著差异。多普勒超声心动图显示，如先前报道的那样，房颤患者的LA大小明显大于无房颤患者[39]. 对662个成熟miRNAs的水平进行了量化。AF患者中有356例表达，对照组有335例表达(图1A)所有患者中均表达299个miRNAs(图1B和S1表). 因此，与刘等人2014年的研究相反[48]，我们没有证实AF显著影响LA中表达的miRNAs的数量。预测299个常见的miRNA在11884个靶基因的3'-UTR中结合129703个结合位点（来自Targetscan保守家族的预测）(S2表). 具有显著miRNA靶基因富集的KEGG通路参与蛋白质降解、信号通路、细胞凋亡以及心房功能和结构(e（电子）.克.; 缝隙连接和收缩）(图1C). 有趣的是，299个常见的miRNA被预测与750个转录因子mRNA编码相互作用（G.O分子功能：转录因子活性（GO:0003700），第页=2.76518E-42，来自BABELOMICS的预测，数据未显示）支持miRNA作为LA转录特征的关键成分的证据。众所周知，单个miRNA可能会适度降低靶基因表达，而一组miRNA可能以组合方式发挥显著作用，我们进一步关注了100个最有针对性的基因(S2表)为了确定299个miRNAs在人类LA中最相关的细胞功能。基于已发表和预测的蛋白质相互作用[46]，我们鉴定了4个重要的功能蛋白网络，涉及22个与RNA介导的基因沉默和miRNA机制、囊泡运输、转化生长因子（TGF）-β反应和昼夜节律调节相关的高靶向基因(图2). 因此，这些功能中的许多都被严格调节，以维持心脏功能，防止纤维化和肥大[49]或控制血压和心率[50]，预计在LA中受miRNAs控制。有趣的是，我们发现参与RNA介导的基因沉默的蛋白质(我.e（电子）.AGO/EIF2C蛋白）和miRNA机制(我.e（电子）TNRC6蛋白）也被miRNAs高度靶向，这表明LA中的miRNA改变通常会干扰miRNA的功能。

缩略图
下载：
图1。与心房颤动相关的瓣膜性心脏病患者（VHD患者）或无心房颤动的患者（对照组）左心房（LA）中miRNA的表达。

A） 对照组或房颤患者LA中表达的miRNA数量。B） 在所有VHD患者中表达的299 miRNA基础表达的无监督分层聚类和热图。LA=LA活检；PV/LA=肺静脉-LA交界处的活检。C） 299个miRNAs的靶基因显著丰富了KEEG通路（BABELOMICS分析）（来自TARGETSCAN的预测）。只考虑了包含50个以上预测基因的途径。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g001

缩略图
下载：
图2。心脏瓣膜病患者左心房中299个miRNAs表达的100个最靶向基因之间的蛋白质相互作用。

预测的蛋白质-蛋白质相互作用来自STRING。相互作用包括直接（物理）和间接（功能）关联，要么来自计算预测，要么来自生物体之间的知识转移，要么来自其他（主要）数据库聚合的相互作用。基因列表见S2表.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g002

房颤与人类LA基础表达受损的miRNAs相关

由于在LA中表达的miRNA被预测为调节LA组织维持和结构的重要途径，我们假设miRNA基础表达的改变可能与AF有关。我们在AF患者中鉴定出42个失调的miRNA（n=4）(S4表)与非房颤患者相比，作为对照组（n=4）。因为这个结果与组织的起源无关（LA与/PV-LA连接）我们认为这些miRNAs与房颤状态有关（图第3页和4A级). 为了了解它们失调的起源，我们首先分析了它们的基因组位置。9个改变的miRNAs位于19号染色体上，该染色体是所有人类染色体中基因密度最高的。有趣的是，19号染色体包含与心肌病、先天性肌营养不良1C、肌营养不良边缘肌群2I型、带边缘空泡的肌营养不良和强直性肌营养障碍直接相关的基因[51]. 因此，我们的数据表明，该染色体的非编码部分也与肌肉改变有关；我.e（电子）.心房颤动。20%上调的miRNAs位于17号染色体上，到目前为止，17号染色体还与肌肉或心脏疾病无关。然后，正如文献中所建议的那样，内含子miRNAs的调控与宿主基因相似[52–54]我们通过之前对房颤患者左心房的转录组分析，确定了内含子miRNA是否失调[39]. 四种miRNAs的表达与它们的宿主基因（miR-126-5p、miR-589-3p、miR-15b-5p和miR-25-3p）类似。这些数据表明，事实上，大多数改变的内含子miRNAs在特定转录因子的控制下有其合适的启动子，AF中可能会改变这些转录因子坑x2[39]与房颤患者LA的下调有关[55]并可以解释miR-133a的下调(S3表)，受PITX2控制[56]. 此外，在过去十年中，有报道称转录因子的一些突变是与结构性心脏缺陷相关的先天性心脏病的基础[57–59]. 最后，大约一半的miRNA编码基因与CpG岛相关[60]可以设想，42个失调的miRNA代表DNA甲基化机制的候选靶点。例如，在肝细胞癌细胞中，高甲基化和低甲基化分别与miR-378和miR-25的下调和上调有关[61]. 有趣的是，这2个miRNA在房颤患者的LA中也分别上调和下调(S3表). 此外，miR-126、let-7a、miR-34a和miR-148在42种miRNAs改变的列表中，在癌症中经常被高甲基化[62–65]表观遗传调控特征，显著参与房颤[9,39].

缩略图
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图3。工作流程用于预测心房颤动（AF）患者左心房（LA）中42个改变的miRNA的功能。

A） 42 miRNA基础表达的无监督分层聚类和热图，在患有与房颤或无房颤相关的瓣膜性心脏病的患者中表达（C=对照组）。LA=LA活检；PV/LA=肺静脉-LA交界处的活检。B） mRNA图谱数据来自[39]并可从基因表达综合数据库GSE31821获得(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g003

缩略图
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图4。心房颤动（AF）患者左心房（LA）miRNA上调或下调对miRNA控制通路的影响预测。

A） 42种miRNA基础表达的无监督分级聚类和热图，在房颤或非房颤患者中发生改变（C=对照）。LA=LA活检；PV/LA=肺静脉-LA交界处的活检。B） 和C）利用42个改变的miRNAs的靶基因显著丰富了KEEG通路。路径预测来自DIANA-miRPath v3.0[45].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g004

miRNA谱改变与房颤病因相关基因

为了确定房颤患者LA中42 miRNA表达改变的功能后果，我们遵循了图3靶基因预测表明，上调和下调的miRNAs分别针对3310和5868个独特基因，其中1562个共同基因重叠(S4表). 基因显著丰富的KEGG途径如图所示图4A和4B这些途径主要是参与干细胞增殖、形态发生和多能性调节的信号途径，以及参与电重构、内吞、聚糖生物合成和肌动蛋白细胞骨架调节的途径。上调的miRNAs被预测为特异性下调脂质代谢和血小板活化途径；下调的miRNAs被特别预测为上调蛋白质降解和心律失常的途径。

根据miRNA结合位点，在两个列表中的100个最具靶向性的基因中(S4表)，5个功能蛋白网络被预测受到失调miRNAs的影响(图5). 预测的上调蛋白网络参与昼夜节律性的同步和AKT/PKC信号通路的控制，已知AKT/PKC信号通路调节细胞存活和凋亡之间的平衡(图5A). 预测下调的途径包括IGF-1途径（参与收缩性、糖代谢、肥大、自噬、衰老和凋亡的调节）、TGF-β信号途径（参与心肌肥厚和纤维化）以及参与RNA介导的基因沉默的网络(图5B).

缩略图
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图5。100个预测的最具靶向基因之间的蛋白质相互作用，无论是在患有或不患有心房颤动的瓣膜性心脏病患者的左心房中上调或下调的miRNA。

MiRNA靶基因预测来自TARGETSCAN。预测的蛋白质相互作用来自STRING。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g005

最近的数据表明，抑制机制主要是通过降低mRNA靶点的稳定性[66]. 因此，通过mRNA稳定性调节的miRNA靶基因与其miRNA调节因子的表达呈负相关。我们之前在房颤患者中发现了2簇mRNA，分别上调和下调与控制志愿者[39] (图3B). 为了鉴定miRNA-mRNA功能对，我们交叉了转录数据[39]42个失调miRNAs的靶基因列表(图3). 我们发现44.5%的上调mRNA(图6A)和55%下调的mRNA(图6B)被预测为改变的miRNAs的保守靶点（3'UTR中至少有一个结合位点），这强烈表明特异性miRNAs的失调可以解释以前AF患者LA中检测到的大部分转录缺陷[39]. 高靶向mRNA(我.e（电子）.每个列表中的前100个基因，S4表)参与7个功能网络的编码蛋白质(图6C和6D) (我.e（电子）TGF-β-IGF-1和MAPKinase信号通路，细胞粘附/接触，增殖和微管动态/离子通量，以及mRNA剪接和沉默）。

缩略图
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图6。伴有或不伴有心房颤动的瓣膜性心脏病患者左心房miRNAs和mRNA表达的改变呈负相关。预测来自TARGETSCAN。

A） 转录组分析中下调的miRNA和上调的mRNA的靶基因预测之间的数据交叉。B） 转录组分析中上调miRNAs和下调mRNA的靶基因预测之间的数据交叉。（C） 和（D），使用STRING分析两个列表（549和379）中100个最具miRNA靶向性的基因，以确定它们是否包含在蛋白质相互作用网络中。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g006

miRNA-mRNA相互作用的实验验证

我们的研究基于生物信息学分析，我们旨在确认部分改变的转录特征是AF患者LA中miRNAs失调的结果。为此，我们重点关注Smyd2公司（SET和MYND域包含2），这是AF患者与对照组LA中具有最高倍变化的前10个基因之一[39]. SMYD2是一种蛋白赖氨酸N-甲基转移酶，将组蛋白和非组蛋白甲基化，对小鼠心脏发育是不可或缺的[67]. SMYD2是一种心脏保护蛋白，通过p53的甲基化，可以防止细胞死亡[68].

2的3'-UTR区域Smyd2公司人类转录物被miR-519a-3p和miR-519-3p结合，这两种miRNA在LA中高度下调(S3表). 为了验证这些预测，一个含有3'-UTR区域的报告质粒Smyd2型与荧光素酶/肾素相关的基因与前miR-519a-3p或前miR-5129b-3p联合转染。如所示图7A，只有miR-519b-3p可以结合Smyd2公司并显著降低荧光素酶/肾素活性。为了验证下调Smyd2公司在mRNA水平上，在HEK293T中转染前miR-519b-3p。HEK293T中的GFP检测用于确认转染效率(图7B)，并且HEK293T受体细胞中miR-519b-3p的定量证实其强过表达(图7C). 如所示图7D，miR-519b-3p过度表达导致细胞内Smyd2公司mRNA，与随机miRNAs过度表达和SMYD2蛋白水平下调相比(图7E和7F). 这些数据证实，房颤患者左心房中miRNA基础表达水平的改变可能参与mRNA失调[39]. 在之前的研究中，我们已经证明表观遗传机制(我.e（电子）.; 启动子高甲基化）有助于房颤的发生，并对瓣膜性心脏病患者LA或肺静脉-LA交界处的转录组改变负责[39]. miRNAs与Smyd2公司AF中表达的改变证明了AF病理中DNA甲基化、组蛋白修饰和微小RNA之间的复杂相互作用。

缩略图
下载：
图7。Smyd2 mRNA与miR-519相互作用的验证。

A） 用含有3'-UTR区的报告质粒转染HEK293T细胞Smyd2公司与荧光素酶/肾素相关，与表达随机miRNAs的质粒或pre-miR-519a-3p或pre-mi R-519b-3p相关。B） 通过在HEK293T中观察GFP来验证miR-519b-3p的转染效率，发现与随机miRNAs的效率相似。C） HEK293T中miR-519b-3p过度表达的验证。D） 量化Smyd2公司HEK293T中的mRNA水平转染了含有前miR-519-3p或随机miRNA序列的质粒。E） 用前miR-519-3p或随机miRNA序列转染HEK293T中SMYD2蛋白水平的定量。F） HEK293T蛋白提取物的Western blot，转染前miR-519-3p或随机miRNA序列。左边，用抗SMYD2抗体进行印迹后，右边，用考马斯蓝显示丙烯酰胺凝胶，以验证每个样品的蛋白质装载量是相同的。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.g007

讨论

房颤与VHD患者的心房扩张有关，并导致病理恶化。在可能导致房颤发展和持续的潜在因素中，使用右心房附件的活检发现了miRNA的失调[69,70]. 令人惊讶的是，尽管90%的房颤来自LA，特别是来自PV，但通过比较有无房颤的VHD患者发现房颤与右心房miRNA基础表达的改变有关，而与LA无关[69]. 这项研究的作者假设这可能与组织可用性有关。一致的是，最近的一项研究得出了相反的结论，表明房颤的发生与RA和LA组织中miRNA表达的变化有关[48]. 在本研究中，我们量化了慢性房颤（>1年）二尖瓣疾病（MVD）手术患者中662个miRNAs的水平，并与MVD但没有房颤的患者进行了比较，仅关注LA病理。在MVD患者LA中表达的299个miRNA中，通过qRT-PCR检测到255个miRNAs，之前已使用微阵列进行鉴定，证实它们在人类LA中的表达。在这299个中，我们发现42个基础表达改变的miRNA，支持AF与LA中miRNA水平改变有关的结论[48]. 他们被预测调控35%的编码基因组，因此证实房颤是一种miRNA相关疾病。由于本研究中确定的299个miRNA与之前在LA组织中确定的213个miRNA仅部分匹配（48），因此在这两项研究中仅发现5个miRNA普遍改变(我.e（电子）miR-378a-3p、miR-15b-5p、miR-21-5p、miR-125b-5p和miR-451a）。42个改变的miRNAs被预测为靶向已知参与房颤的细胞通路(我.e（电子）电重构，以及结构重构和肥大发展的信号通路特征）进一步支持了它们在病理学病因中的重要性。然而，AF患者LA中其表达改变的原因尚不清楚，值得进一步研究。我们可以设想3种可能的机制（或这3种机制的组合），例如启动子区域超甲基化，转录因子的失调参与其调节或其宿主基因的调节。但由于大多数miRNA启动子区域尚未确定，因此很难得出结论。此外，我们的分析不允许确定这些miRNAs的表达是否与其对应的pri-miRNAs表达相关。

与之前的研究相反，这些研究的结论是基于对单个miRNAs预测功能的分析[36,38]，我们研究的原创性依赖于这样一个事实，即我们考虑了miRNA的集体作用，以确定AF中最相关的基因和蛋白质网络。事实上，已经证明单个miRNA的靶表达减少通常是相当适度的[71,72]并通过对Smyd2公司和miR-519b-3p。此外，在所有预测方法中，miRNA-目标预测均为假阳性。为了克服这些偏见，我们决定只考虑物种间保守的miRNA-结合位点预测[43]并将重点放在上调或下调的miRNA靶向性最强的100个基因上。经过这一过程，我们能够检索到AF中42个失调miRNAs共同控制的网络中所有伙伴受影响最大的细胞路径。它们参与了几个重要的生物过程和与AF相关的功能路径，如TGB-β1和IGF-1信号，增殖和细胞粘附（MAP激酶和AKT通路）以及昼夜节律的生物钟/同步性。事实上，TGB-β1途径被认为是导致选择性心房纤维化和促进房颤的促纤维化介质之一[73]. 低IGF-I血清水平与老年人AF独立相关[74]在大鼠室性心律失常模型上显示了其抗心律失常特性[75]. IGF-I可预防动脉粥样硬化，对抗内皮功能障碍，防止平滑肌细胞凋亡[76]. 此外，IGF-I减少促炎细胞因子的产生[76]和氧化应激[77]. 这可能具有相关性，因为炎症、氧化应激和内皮功能障碍与房颤的病因有关[78–80]. 此外，生物信息学预测确定了参与生理节律和调节生理节律的蛋白质相互作用网络，该网络高度受LA中miRNAs的控制。研究表明，生理节律改变可导致心脏病的发生(e（电子）.克.; 房颤呈双峰昼夜节律[81])它的再同步化可能成为预防疾病进展的有希望的治疗靶点[82]. 通过我们的方法，我们能够识别一个与昼夜节律同步相关的蛋白质网络，该网络预计将在房颤患者LA中改变的miRNAs的共同控制下。CREB1是蛋白质网络中连接最紧密的蛋白质，此前曾被预测为房颤患者miRNAs改变的靶基因[7,38,83]. 有趣的是，已经发现CREB蛋白的表达随着年龄的增长而显著增加，这种蛋白在幼年大鼠的心肌细胞中无法检测到[84]，这是房颤和昼夜节律紊乱的最大风险因素。另一项研究表明，当细胞受到氧化应激时，CREB具有细胞保护作用[85]，与AF相关的条件[79]. 因此，通过下调特异性miRNAs增加CREB1及其伴侣可能代表了AF发展过程中对细胞存活的一种保护/适应生物信息学数据强烈表明，miRNAs的功能（AGO蛋白、TNRC6B和TNRC6A）在房颤中受到干扰，被多个失调的miRNAss靶向。研究表明，心脏中AGO蛋白的表达水平似乎低于其他组织中的表达水平[86]表明miRNAs对其表达有严格控制。因此，房颤中miRNA表达减少可能会增加其水平，并严重干扰miRNA的功能。

最后，我们试图确定miRNAs水平的改变是否参与AF患者LA中转录特征的改变，并解释其原因[39]. 事实上，最近的数据表明，抑制机制也是通过降低mRNA靶点的稳定性来实现的[66,87]. 我们的分析预测，44.5%的上调mRNA和55%的下调mRNA是保守靶点，并且与改变的miRNAs反向表达。3'-UTR区结合位点的数量与mRNA折叠变化之间没有相关性。需要注意的是，我们基于TARGETSCAN预测的分析没有考虑到mRNA编码区中的miRNA结合位点。参与TGF-β和IGF-Ⅰ途径以及miRNA功能的高靶向基因预计在转录水平上受到调节，这表明这3条途径主要通过AF期间mRNA水平的降低来调节。

综上所述，本研究提供了证据表明，miRNA是房颤相关心房重塑和肥大患者LA分子改变的一部分。如果miRNA可以作为诊断生物标志物或监测治疗效果，我们的结果表明，选择性miRNA靶向治疗，由于腺病毒转染上调或抗戈米受体下调可能不适用于AF患者。由于miRNAs共同作用于基因表达并同时调节许多重叠的通路，因此选择一种特定的miRNAs-可能不足以恢复LA的体内平衡。此外，目前尚不清楚房颤病理中miRNA水平的改变是因果关系（病理中的早期事件），还是代表了一种对抗心脏电重构和纤维化发展的适应。

支持信息

S1表。人类左心房和肺静脉-LA交界处表达的299个miRNA列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.s001

（XLSX）

S2表。预测人类左心房299个常见表达的miRNA靶向的基因3'-UTR中miRNA结合位点的数量（n=8）。

来自TARGETSCAN的预测(http://www.targetscan.org/vert_70).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.s002

（XLSX）

S3表。房颤患者左心房miRNA差异表达列表。

miRNA I.D来自http://www.mirbase.org/; miRNA宿主基因测定来自http://mirstart.mbc.nctu.edu.tw/browse.php.寄主基因折叠变化来自Doñate-Puertas R等人，Transl Res.2017年6月；184:57–67.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.s003

（XLSX）

S4表。心房颤动患者左心房失调miRNAs的靶点。

预测来自TARGETSCAN 6.2(http://www.targetscan.org/vert_61/).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196666.s004

（XLSX）

致谢

我们感谢Elodie Morel在样本采集方面的协助，以及任何其他协助患者登记或参与样本采集的临床或护理人员。

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