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研究文章

肾小管细胞源性细胞外囊泡诱导间充质干细胞上皮转化

摘要

间充质-上皮相互作用在肾小管形态发生和维持肾脏结构中起着重要作用。本研究的目的是研究人肾近端小管上皮细胞（RPTEC）产生的细胞外囊泡（EVs）是否可以诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）的间质-上皮转化。为了验证这一假设，我们描述了EV的表型和RNA含量，并评估了在体外间充质干细胞对EV的摄取和活性。MicroRNA（miRNA）分析表明，EV携带的miR-200家族可能与MSC的上皮承诺有关。骨髓源性MSC与EV、RPTEC源性总条件培养基或EV耗尽的条件培养基共同培养。作为阳性对照，MSCs与RPTEC在跨孔系统中共同培养。通过实时PCR和免疫荧光分析特定间充质和上皮标记物的细胞表达来评估MSCs的上皮承诺。在用EVs和总条件培养基培养一周后，我们观察到MSCs的间质-上皮转变。用缺乏EV的条件培养基刺激，不会引起间充质和上皮基因表达的任何变化。由于发现EV含有miR-200家族，我们使用合成的miR-200模拟物转染MSC。转染一周后，MSCs中诱导了间质-上皮转变。总之，RPTEC释放的携带miR-200的EV可诱导MSC的上皮细胞参与，这可能有助于MSC的再生潜能。基于用miR-200模拟物转染MSC的实验，我们认为miR-200家族可能参与MSC的间质-上皮转变。

引用：Chiabotto G，Bruno S，Collino F，Camussi G（2016）肾小管细胞衍生的细胞外囊泡诱导的间充质基质细胞上皮转化。公共科学图书馆·综合11（7）：e0159163。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163

编辑：意大利分子生物技术中心Benedetta Bussolati

收到：2016年2月4日；认可的：2016年6月28日；出版：2016年7月13日

版权：©2016 Chiabotto等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。

数据可用性：所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。

基金：作者没有任何支持或资金可供报告。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

缩写：厘米，无细胞外小泡的条件培养基；EMT、，上皮-间充质转化；电动汽车，来自RPTEC的细胞外囊泡；遇见，间充质-上皮转化；小RNA，微RNA；MSC、，间充质基质细胞；qRT-PCR、，定量实时逆转录酶聚合酶链反应；RPTEC，肾近端小管上皮细胞；三通，跨上皮电阻；TOT-CM、，总条件培养基

引言

上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用协调肾脏的发育，在维持成人器官完整性方面发挥关键作用，并有助于损伤后的肾脏再生。骨髓源性间充质干细胞（MSCs）具有多潜能特性，因为它们可以分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。此外，在共培养条件下，肾小管上皮细胞诱导的骨髓源性MSCs的上皮结合已被证明[1]. 最近，来自肾小管上皮细胞的条件培养基也被证明可以诱导脂肪来源的成人MSC的上皮细胞分化[2]骨髓源性MSCs[三,4].

MSCs的上皮重编程包括获得极化上皮细胞的形态、抗原和功能特性。间充质-上皮转换（MET）被定义为上皮基因的激活，包括编码细胞角蛋白、桥粒、粘附分子和紧密连接的基因，以及间充质基因的失活，如波形蛋白和胶原[5]. MET是在肾发生过程中观察到的一种现象，即后肾间质发育为肾单位[6]. 在胚胎发生过程中，MET和上皮-间质转化（EMT）——MET的逆转程序——对器官发育至关重要。尽管有大量研究分析了EMT与慢性炎症和肿瘤转移中的纤维化有关[7–13]，对MET与肾脏形成相关的研究相对较少。这一过程似乎受成对框2等基因的调控(PAX2)，骨形态发生蛋白7(骨形态发生蛋白7)和Wilms肿瘤1(重量1) [14–16].

除了物理相互作用，如直接细胞与细胞接触、纳米管和细胞膜，以及可溶性因子的释放，细胞外囊泡（EV）最近已成为细胞间通信的一种重要机制。EV一词包括来源于内胚层室膜的外泌体和来源于质膜芽生的微泡。它们都是小的膜碎片，可以将细胞溶质蛋白、受体、生物活性脂质和核酸穿梭到靶细胞上，作为一种强有力的旁分泌机制，可以改变细胞命运[17]. 拉塔奇萨克等.[18]首先描述了来源于胚胎干细胞的EV可能通过mRNA依赖机制对造血祖细胞重新编程。Quesenberry和Aliotta认为，通过转移EV对细胞进行持续的遗传调控可能参与了骨髓干细胞表型的连续变化。EV介导的蛋白质和遗传信息从损伤细胞转移到骨髓源干细胞可能会重新编程其表型以获得损伤组织的特征[19,20].

EV携带蛋白质、脂质和核酸，包括microRNAs（miRNAs）[21–23]短的非编码RNA，通过触发mRNA切割或抑制翻译来调节几个基因的转录后表达[24,25].

本研究的目的是评估肾小管上皮细胞（RPTEC）衍生的EV是否参与骨髓源性MSC的上皮分化以及EV携带的miRNAs的作用。

材料和方法

细胞培养

人骨髓源性MSCs取自Lonza（瑞士巴塞尔），培养和鉴定如前所述[26,27]. 简单地说，MSCs在间充质干细胞基础培养基（MSCBM，Lonza）的存在下培养，并保存在含有5%CO的增湿环境的培养箱中237°C时。以10000个细胞/cm的密度接种MSCs2并在第七段中使用。如前所述，测定MSCs的成脂、成骨和成软骨分化能力[26,27].

根据制造商的说明，从Lonza获得人RPTEC，并在补充有肾上皮细胞生长培养基子弹试剂盒（REGM，Lonza）的肾上皮细胞基础培养基（REBM，Lonsa）中培养。

免疫荧光分析

对培养在玻片上的细胞进行间接免疫荧光（美国纽约州罗切斯特Nalgen-Nunc International）。将细胞固定在2,5%多聚甲醛中，并用Hepes-Triton X100缓冲液（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）渗透。使用了以下抗体：小鼠单克隆抗波形蛋白（Sigma-Aldrich）、小鼠单克隆抗全细胞角蛋白（Bio-Rad，Hercules，CA）、兔多克隆抗细胞角蛋白18和山羊多克隆抗氨肽酶A（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX）。作为对照，省略了主要抗体，并用非免疫小鼠IgG替代。Alexa Fluor 488抗小鼠（Invitrogen，Carlsbad，CA）用作二级抗体。为了进行核染色，将Hoechst 33258染料（Sigma-Aldrich）添加到固定细胞中。使用蔡司LSM 5 Pascal共焦显微镜（德国卡尔蔡司国际公司）进行共焦显微镜分析。

MSCs表达高水平的波形蛋白(S1A图)，而未检测到细胞角蛋白表达(S1B图). RPTEC表达低水平的波形蛋白(S2A图)和高水平的细胞角蛋白(S2B图).

细胞荧光分析

在每次传代时对细胞进行计数，并使用FACS Calibur（BD Biosciences，San Jose，CA）通过细胞荧光分析分析其免疫表型。使用以下抗体，所有缀合的异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）：抗CD105，-CD146（Miltenyi Biotech，Bergisch-Gradbach，德国）-CD29、-CD44、-CD45、-α5整合素（CD49e）、-α6整合素-EpCAM，-HLA-I（生物传奇，加利福尼亚州圣地亚哥）。小鼠IgG等型对照来自Miltenyi。

MSCs表达典型的MSC表面标记分子：CD29（整合素β-1）、CD44、CD73（外-5’-核苷酸酶）、CD90（Thy-1细胞表面抗原）、CD105（内皮素）和CD146（黑色素瘤细胞粘附分子，MCAM），而上皮标记物EpCAM未检测到(S1C图).

RPTEC显示CD24、CD29、CD44、α-5整合素（CD49e）、α-6整合素、CD73、CD146、EpCAM和HLA-I类表面分子的表达，而造血标记物CD45、内皮标记物VEGFR2和间充质基质细胞标记物CD105未检测到(S2C图).

细胞外囊泡的分离和条件培养基的制备

在100000 g离心15小时后，从在RPMI（不含酚红，Invitrogen）中培养过夜的≥80%融合RPTEC的上清液中获得EV（Optima L-90K超离心机，印第安纳波利斯Beckman Coulter）。收集细胞上清液，在2000 g下离心20分钟以去除碎片，并进行处理以获得：（1）细胞外囊泡（EVs），（2）EVs总条件培养基（TOT-CM）和（3）在100000 g超离心15小时后去除EVs后的条件培养基。

如Théry及其同事所述，通过差速超速离心从无细胞上清液中分离EV[28]. 在100000 g超速离心后收集的颗粒被重新悬浮在含有10%二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich）的RPMI中，并储存在-80°C下。

使用配备纳米颗粒跟踪分析（NTA）2.0分析软件的NanoSight LM10仪器（英国阿姆斯伯里NanoSightLtd）测量颗粒大小和浓度[29,30].

TOT-CM和CM通过2700 g离心，在4°C下40分钟，使用3 kDa分子量截止值的超滤装置（Amicon Ultra-15，离心过滤装置，Millipore，Billerica，MA）浓缩约20倍。为了保持电动汽车的完整性，TOT-CM补充了10%的二甲基亚砜并储存在-80°C下，而CM直接储存在-20°C下。

电动汽车特性

如前所述进行细胞荧光分析[30,31]. 简言之，将EV与以下FITC或PE结合抗体在4°C下孵育15分钟：抗CD24、-CD29、-CD44、-α5整合素（CD49e）、-α6整合素酶（CD49f）、-CD63、-CD73、-CD81、-CD107、（Becton Dickinson）、-CD146、-EpCAM、-HLA1（加州圣地亚哥BioLegend）。以FITC或PE小鼠非免疫同种型IgG（Miltenyi）为对照。对于每种EV制剂，使用Guava easyCyte™流式细胞仪（Millipore）采集5000个颗粒，并使用InCyte™软件进行分析。

电动汽车并入MSC

为了研究骨髓间充质干细胞纳入EV的情况，我们将这些细胞与30000个标记EV/细胞在37°C下培养6-15-24小时。根据制造商的说明，EV之前用与脂质膜结合的红色荧光染料染色（Vybrant™DiI细胞标记溶液，Invitrogen）。Hoechst 33258（Sigma-Aldrich）染色用于观察细胞核。通过共焦显微镜评估EVs摄取。

使用RPTEC衍生EV或TOT-CM或CM的刺激实验以及共培养实验

为了测试RPTEC衍生的旁分泌因子在MSC分化中的作用，将MSC以50000个细胞/孔的密度接种在MSCBM中的6孔板（Becton Dickinson）中，并在RNA提取前用150000个EVs/细胞、30%CM或30%TOT-CM刺激7-14天。当使用TOT-CM刺激MSC时，我们保持了与使用EV刺激MSC相同的EV：细胞比率。对于共培养实验，使用带有1μm孔径渗透膜的跨孔系统（Becton Dickinson）在6孔板中物理分离RPTEC和骨髓间充质干细胞（Becton-Dickinson）。RPTEC以100000个细胞/孔的密度接种到DMEM中跨阱系统的上部插入物中，加入5%的FBS。将MSC以50000个细胞/孔的密度接种到该共培养系统的下室中。以MSCBM中单独培养的MSCs作为对照。在提取RNA之前，细胞在共培养条件下保持7天。进行了六个不同的实验，结果相似。

跨上皮电阻

跨上皮电阻（TEER）被用作上皮分化和完整性的指标（30）。对照MSC或在EV或TOT-CM存在下培养的MSC，或与RPTEC共同培养的MSCs被镀在聚碳酸酯膜跨孔上（Falcon Corning Corp.，Cambridge，MA），并允许其汇合。使用上皮伏特计（EVOM，佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）测定TEER。对无细胞膜插入物进行测量，并从所有后续测量中减去，用欧姆/厘米表示2.所有值均为膜面积的标准值。所有实验均一式三份。

白蛋白摄取

如前所述，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的白蛋白（Sigma-Aldrich）分析融合MSC单层中白蛋白的细胞摄取[32]. 简言之，与RPTEC共培养14天后，或与EV或TOT-CM刺激后，刷新细胞培养基，并在37°C下用50μg/ml FITC-标记的BSA（Sigma-Aldrich）培养MSC 2小时。通过细胞荧光分析测定荧光发射。

Western Blot分析

为了进行蛋白质分析，将EV和细胞在4°C的RIPA缓冲液（20 nM Tris-HCl、150 nM NaCl、1%脱氧胆酸盐、0.1%十二烷基硫酸钠、1%Triton X-100、pH 7.8）中溶解30分钟，并添加PMSF、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）。EV样品采用蛋白质Bradford分析进行定量。由于EVs蛋白浓度低于2 mg/ml，如前所述，使用甲醇-氯仿-水混合物进行蛋白质定量沉淀[33,34]. 在还原条件下，在10%丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE上运行等分的含有30μg蛋白质的细胞裂解液。使用iBlot™干吸系统（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）的7分钟转移程序将蛋白质转移到PVDF膜上。用添加0.1%吐温-20（PBS-T）的PBS中5%的脱脂奶封闭斑点。以下主要抗体以1∶200稀释度使用：抗人氨肽酶A和抗人全细胞角蛋白（圣克鲁斯生物技术公司）。在4°C下用一级抗体培养15小时后，用PBS-T清洗膜，然后在室温下用过氧化物酶结合二级抗体培养1小时（Santa Cruz Biotechnology）。最后，使用PBS-T清洗膜，使用ECL检测试剂（英国白金汉郡阿默沙姆的GE healthcare）开发膜，并使用Chemidoc XRS系统（Bio-Rad）检测膜。

RNA提取和定量实时逆转录酶聚合酶链反应

根据制造商的说明，使用miRNeasy迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市）从EV和细胞（用于共培养和刺激实验）中分离出总RNA，并用分光光度法进行量化（Nanodrop ND-1000，德国威尔明顿）。使用真核总RNA 6000 Pico Kit，在安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）上通过毛细管电泳评估EVs衍生RNA的质量。使用小RNA试剂盒（安捷伦科技）在EV和细胞样本中验证小RNA的存在。

通过实时定量PCR评估与EVs共同培养或刺激的MSCs的mRNA表达。如前所述，使用了高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）和Power SYBR®Green PCR Master Mix[26]. 阴性cDNA对照（无cDNA）与每次运行并行循环。使用96孔StepOne实时系统（Applied Biosystems）进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）。序列特异性寡核苷酸引物购自MWG-Biotech AG（德国埃伯斯堡，www.mwg-biotech.com)和如所示表1与对照组相比，mRNA表达的折叠变化为2-ΔΔCt对于所有样品，使用TBP作为标准化剂。EVs的内源性控制与其来源细胞的内源性控制显著不同。因此，未对细胞和EV之间的miRNA进行比较。

缩略图
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表1。qRT-PCR中用于评估mRNA表达的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.t001

实时定量PCR分析MicroRNA

如前所述，分析EV中成熟miRNA的表达水平[29,30]. 使用Applied Biosystems TaqMan®MicroRNA Assay Human Panel Early Access Kit（Life Technology）通过逆转录的顺序步骤（Megaplex RT Pools；Life Technical），利用Applied Biosystems 7900H qRT-PCR仪器分析754个成熟miRNA。使用SDS软件（2.3版）计算原始CT型值、自动基线和阈值。从C开始T型值35表示单分子模板检测，CT型高于35的数值被认为低于检测水平，并被排除在分析之外。

如前所述，使用miScript逆转录试剂盒和miScript SYBR Green PCR试剂盒（均来自Qiagen），通过微阵列分析筛选，以确认MET相关miRNAs的表达[22]. 按照制造商的方案（Qiagen）所述，所有样品一式三份，每个反应使用3 ng cDNA。hsa-miR-200a、200b、200c、141和429的MiRNAs特异性引物列于表2和都用于相同的反应。小核仁RNA RNU-6B被用作参考对照，以使数据正常化。96度阶梯TM公司实时系统（应用生物系统）用于执行qRT-PCR。

缩略图
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表2。qRT-PCR中用于评估microRNA表达的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.t002

微RNA靶点预测和通路分析

基于网络的应用程序DIANA-mirPath（2.0版）用于对生物途径中miRNA预测的靶基因进行富集分析。选择算法microT-CDS来预测EVs衍生的miRNA靶点，使用默认的microT阈值0.8。

如前所述，DIANA-mirPath对所有已知KEGG通路的多个miRNA靶基因进行了富集分析[36,37]. 通过mirPath软件计算与确定的生物功能相关的统计显著性值(http://microrna.gr/mirpath). p值小于0.001的生物途径被视为显著富集。

用miRNA模拟物转染MSC

根据制造商的方案，使用HiPerFect转染试剂（Qiagen）用miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429模拟物（20μM，MiScript miRNA模拟物，Qiagen）瞬时转染MSC。简单地说，MSC以10000个细胞/cm的密度接种到6孔板中2将浓度为20 nM的MiRNA模拟物与适当体积的HiPerFect转染试剂（Qiagen）混合，并在室温下培养10分钟。采用Allstars阴性对照siRNA（20μM，Qiagen）作为加扰对照。按照制造商的说明，将转染混合物滴入FBS耗尽的培养基中的细胞中。培养24小时后，去除转染培养基，在MSCBM中培养细胞7天。

荧光素酶报告分析

从GeneCopoeia（Rockville，MD）获得包含人类细胞周期蛋白D1（CCND1，登录号NM_053056.2）的3′非翻译区（UTR）序列和插入荧光素酶报告基因下游的人类胰岛素样生长因子1受体（IGF1R，登录号为NM_000875.3）的pEZX-MT05荧光素素酶报告载体。为了进行荧光素酶报告分析，HEK 293T细胞接种在24孔板中的DMEM高糖缺乏抗生素中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）联合转染荧光素酶-3’UTR报告体（0.8μg）或空表达载体（阴性对照）与miR-200a、miR-200b、miR-2001c、miR-141和miR-429 mimics（0.5μg，MiScript miRNA mimics，Qiagen）。转染24小时后，用含10%FBS的DMEM高糖替换培养基。24小时后使用LucPair™miR Duo-luciferase Assay Kit（如上所述）在相同样品的培养基中测量萤火虫和Renilla荧光素酶活性[38].

统计分析

采用t检验进行统计分析。统计显著性设置为P（P）<0.05。

结果

RPTECs诱导MSCs的上皮结合

为了研究RPTECs对骨髓间充质干细胞的影响，在非对照条件下联合培养人骨髓源性MSCs和RPTEC。7天后，特异性间充质标记物Twist的mRNA水平（扭转1），波形蛋白（VIM）和FOXC2系列MSC显著减少(图1A和1E); 此外，MSCs表达较高水平的上皮特异性标记细胞角蛋白18（KRT18）提示MET发生于MSCs(图1B和1H). 当MSCs与TOT-CM孵育时观察到相同的结果(图1A、1B、1D和1G). 为了研究旁分泌因子在RPTEC诱导的MSCs上皮分化中的作用，MSCs也与CM或纯化的EVs孵育。有趣的是，在与CM孵育一周后，我们没有观察到MSCs中间充质和上皮标志物的表达有任何变化，这表明可溶性因子的作用不足以诱导MSCs的上皮结合(图1A和1B). 在EVs刺激的MSCs中，我们观察到间充质标志物的表达显著降低(图1A和1C)上皮特异性标记的表达增加吉尔吉斯斯坦共和国18在某种程度上可以与共培养体系相媲美(图1B和1F). 这些结果表明，EVs在诱导MSC中的MET中起着相关作用。

缩略图
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图1。骨髓间充质干细胞治疗一周后间充质和上皮标记物表达分析。

（A-B）与RPTEC（条纹条）共培养一周后，或用EV（黑色条）或RPTEC衍生条件培养基（TOT-CM，虚线条）刺激后，显示MSCs中间充质标记物（A）和上皮标记物（B）相对于对照细胞（CTR，灰条）的相对表达（RQ）的直方图或无EV的条件培养基（CM，白色条）。结果表示为一式三份的六个独立实验的平均值。数据通过Student t检验进行分析（未配对，双尾）*与CTR相比，P<0.05。（C-H）代表性显微照片，显示EVs（C-F）、TOT-CM（D-G）刺激的MSCs或与RPTEC（E-H）共同培养的MSCs表达波形蛋白（C，D，E）和细胞角蛋白（F，G，H）。细胞核用Hoechst染料复染。进行了六个独立实验，结果相似。原始放大倍数：X630。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g001

值得注意的是，用EVs刺激两周后，间充质标记物表达下调，细胞角蛋白18表达增加(图2A、2B和2C)、TOT-CM(图2A、2B和2D)与RPTEC共同培养(图2A、2B和2E). 肾小管特异性标记物氨肽酶A的表达轻微但显著增加（欧洲政治公众人物协会）在EV刺激的MSC中也观察到(图2B和2F)、TOT-CM(图2B和2G). 早期表达欧洲政治公众人物协会MSCs与RPTEC共同培养(图1B)也在14天后维持(图2B和2H)这表明，两个细胞群之间的旁分泌因子双向交换促进了MSCs的肾小管结合。

缩略图
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图2。骨髓间充质干细胞治疗两周后间充质和上皮标记物表达分析。

（A-B）显示MSC中间充质标记物（A）和上皮标记物（B）相对于对照细胞（CTR，灰色条）的相对表达（RQ）的直方图，在与RPTEC共培养两周后（条纹条），或在用EV（黑色条）或RPTEC衍生的条件培养基（TOT-CM，虚线条）刺激后。结果表示为一式三份的六个独立实验的平均值。数据通过Student t检验进行分析（未配对，双尾）*与CTR相比P<0.05。（C-H）显示细胞角蛋白18（C，D，E）和氨肽酶A（F，G，H）在EVs（C-F）、TOT-CM（D-G）刺激的MSCs或与RPTEC（E-H）共同培养的MSCs中表达的代表性显微照片。细胞核用Hoechst染料复染。原始放大倍数：X630。（一） 与RPTEC共培养、EVs或TOT-CM刺激的MSC单层对FITC-标记白蛋白（BSA-FITC）的摄取显著增加*与CTR相比P<0.05。（J） 与RPTEC共培养、EVs或TOT-CM刺激的MSC单层中TEER的显著变化*与CTR相比P<0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g002

人近端肾小管上皮细胞通过受体介导的内吞作用有效地重新吸收白蛋白[39]. 为了验证这种小管上皮特异性功能是否由间充质干细胞中的EVs诱导，我们使用细胞荧光分析定量荧光标记的白蛋白摄取。用EVs、TOT-CM刺激MSCs，并与RPTEC共同培养成功纳入FITC-标记白蛋白(图2I). 此外，TEER作为上皮分化和完整性指标的评估表明EVs和TOT-CM诱导MSCs中TEER显著增加(图2J). 综上所述，这些结果证实EVs可以诱导MSCs的上皮性结合。

电动汽车特征和纳入MSC

为了更好地阐明RPTECs诱导MSCs上皮承诺的机制，我们评估了EVs并入MSCs的能力，并对EVs的特异蛋白和mRNA的存在进行了表征。从孵育6小时开始，标记的EV被MSCs内化，在孵育15小时和24小时时，EV在细胞内逐渐分区(图3).

缩略图
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图3。将电动汽车纳入MSC。

共聚焦显微镜观察37°C下Vybrant Dil（红色）染色6小时（A）、15小时（B）和24小时（C）的EVs MSCs内化的代表性显微照片。进行Z堆叠以验证EV的有效内化。细胞核用Hoechst染料复染。进行了三个实验，结果相似。原始放大倍数：X630。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g003

细胞荧光分析显示，EVs携带多种表面粘附分子，如CD24、CD29、CD44、CD73、CD146、α-5整合素（CD49e）、α-6整合素、HLA1和EpCAM，也表达在RPTEC的质膜上。EV也表达经典的外体标记CD63、CD81和CD107a（LAMP1）(图4A). 此外，我们发现EV穿梭于上皮特异性蛋白和mRNA（如细胞角蛋白）以及小管特异性标记ENPEP(图4B和表3).

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图4。EVs蛋白表达特征。

（A） 通过细胞荧光分析表征EV。EVs的代表性FACS分析显示CD24、CD29、CD44、α-5整合素（CD49e）、α-6整合酶（CD49f）、CD73、CD146、EpCAM和HLA-class I表面分子的表达，以及经典的外体标记物CD63、CD81、CD107（粗线）。虚线表示同型对照。对三种不同的EV制剂进行了分析，结果相似。（B） RPTEC细胞和EV的代表性蛋白质印迹分析。进行了三个不同的实验，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g004

缩略图
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表3。RPTEC细胞和EV对上皮特异性mRNA表达的分析。

结果表示为三个独立实验的平均值±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.t003

纳米视力分析显示EV的平均尺寸为185 nm，模式为163 nm，标准偏差为84 nm(图5A). TOT-CM中也证实了EVs的存在，平均大小为162 nm，模式为141 nm，标准偏差为84 nm(图5B). RPTEC上清液超速离心后，CM中EVs浓度显著降低(图5B).

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图5。EV大小和RNA含量的特征。

（A-B）通过NTA直接测量的代表性EV大小分析，在EV（A）和具有（TOT-CM）或不具有EV（CM）的RPTEC衍生条件培养基中（B）通过NTA直接测量，显示EV耗尽前后EV浓度的差异。（C） 代表性生物分析仪图谱，显示了从EVs和细胞中提取的总RNA的大小分布。第一个峰值（每个面板的左侧）代表一个内部标准。虽然核糖体RNA 18S和28S的两个峰值在细胞中可检测到，但在相应的EV中几乎无法检测到。与原始细胞不同，EV表现出相关的小RNA峰值。显示了细胞和EV的RNA完整性编号（RIN）。（D） 对EV进行的小RNA的代表性生物分析图谱显示，相对于原始细胞，miRNA部分（范围：33-36%）富集（范围：4-7%）。对三个不同的样品进行了一式三份的EV和细胞分析，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g005

EV中的MicroRNA谱分析和比较通路分析

我们用EVs及其来源细胞总RNA的生物分析仪图谱验证了EVs衍生RNA的质量和小RNA的存在。EV包含广泛的RNA大小，RNA完整性数（RIN）为7.30（共10个）(图5C). 使用针对小RNA的生物分析试剂盒进行的更全面的分析显示，EV内小RNA类的相关峰值特征，miRNAs的富集率约为36%(图5D). 从EVs中提取的RNA用于754个已知的人类成熟miRNA。我们发现237个miRNAs表达(S1表). 其中，我们发现了5个miRNAs（miR-200a、miR-200b、miR-2001c、miR-141和miR-429）的子集，它们属于miR-200家族，已知参与EMT[40,41].

为了研究哪些生物途径可能参与调控靶细胞的上皮承诺，我们将软件DIANA MirPath应用于65个来源于EVs的表达量最高的miRNAs。我们对KEGG数据库中包含的预测性miRNA靶基因进行了富集分析，发现63个KEGG生物过程显著富集（p<0.001，FDR校正）(S2表). 在EV中发现的20个miRNAs揭示了与几种已知的调节EMT的生物途径密切相关(表4).

缩略图
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表4。电动汽车穿梭的微小RNA与EMT相关的KEGG途径相关。

结果表示为三个独立实验的平均值±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.t004

我们的分析表明，这些miRNAs的预测靶基因主要参与以下EMT和MET相关通路：ECM受体相互作用、Wnt通路、缝隙连接、癌症转录调控异常、TGF-β通路、癌症通路、MAPK信号通路、p53信号通路、局灶粘附、，PI3K-Akt信号通路，调节肌动蛋白细胞骨架(表5) [11,42–45].图6提供了我们从分析中选择的20个miRNAs调控的最显著富集路径的图形表示。

缩略图
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图6。显示miRNA与途径的热图。

使用选项通路联合，DIANA MirPath提供了20个选定EVs衍生miRNAs富集的路径的图形概览。较深的颜色表示较低的重要性值。MET相关通路（以圆圈线突出显示）由p值很低的选定miRNAs靶向（p<10−7，FDR修正）。所附的树状图说明了miRNAs和通路的层次聚类结果。显示类似通路靶向模式的MiRNAs聚集在一起。对生物途径也进行了类似的聚类。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g006

缩略图
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表5。EV中发现的20个选择性miRNAs丰富了生物通路，其中包含EMT相关基因。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.t005

我们从预测分析中选择了两个miRNA靶点，CCND1号机组和IGF-1R型，并在与EVs或TOT-CM孵育一周后检测其在MSCs中的表达。在这两种情况下，我们观察到CCND1号机组和IGF-1R型在MSCs中，这可能归因于miRNA介导的抑制作用(图7). 这些数据表明，EV可能通过传递参与MET相关通路的特异性miRNAs，促进靶细胞的上皮承诺。

缩略图
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图7。EVs刺激MSCs中miRNA预测靶基因的分析。

用EVs（黑条）或RPTEC衍生条件培养基（TOT-CM，虚线条）刺激MSCs一周（A）和两周（B）后，相对于对照细胞（CTR，灰条），显示MSCs中miRNA预测靶基因的相对表达（RQ）的直方图。结果表示为一式三份的六个独立实验的平均值。数据通过Student t检验进行分析（未配对，双尾）*与CTR相比P<0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g007

miR-200家族在MSCs上皮承诺中的作用

我们使用qRT-PCR来验证从miRNA阵列中选择的属于miR-200家族的五个miRNA的表达水平。我们发现这五种miRNAs都在EV中强烈表达，我们选择它们来研究它们在MSC中MET诱导中的可能作用。使用模拟物混合物增加MSCs中miR-200a、miR-200b、miR-2001c、miR-141和miR-429的表达。转染1周后，MSCs显示出较低水平的MET标记物VIM公司和纤连蛋白1(FN1）(图8A)和较高水平的上皮标记物吉尔吉斯斯坦共和国18和管状标记欧洲政治公众人物协会(图8B). 此外，根据我们的预测分析，用miR-200模拟物转染MSCs可减少两个miRNA靶点的表达，CCND1号机组和IGF-1R型(图8C).

缩略图
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图8。miR-200模拟物转染MSCs的间充质干细胞和上皮标记物表达分析。

显示骨髓间充质干细胞（MSCs）中间充质标记物（A）、上皮标记物（B）和miRNA预测靶基因（C）的相对表达（RQ）的直方图，在对照细胞（CTR，灰条）转染miR-200模拟物（黑条）或对照miRNA（打乱，白条）一周后。结果表示为三次独立实验的平均值。数据通过Student t检验进行分析（未配对，双尾）*与CTR相比P<0.05。（D） 荧光素酶在联合转染HEK 293T细胞中的表达CCND1号机组或IGF1R型3'UTR报告员构建和miR-200家族模拟24小时。对于每个基因特异性3'UTR，萤火虫荧光素酶表达归一化为Renilla荧光素酶，并表示为与阴性对照载体（CTR）共同转染的相同细胞荧光素素酶活性变化的百分比。数值表示为三个独立实验的平均值*与CTR相比P<0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.g008

评估miR-200家族是否可以通过结合CCND1号机组和IGF1R型3'UTR，我们进行了荧光素酶报告分析。MiR-200家族模拟物与荧光素酶报告基因构建物pEZX-MT05共同转染HEK 293T细胞CCND1号机组或IGF1R型3'UTR紧跟荧光素酶编码序列。因此，miR-200家族诱导转染细胞中荧光素酶活性降低90%。

综上所述，这些结果表明EV携带的miR-200家族可以通过与预测的靶基因（如CCND1和IGF1R）的3'UTR序列结合，在MSC中诱导MET(图8D).

讨论

EVs介导的细胞通讯机制允许细胞之间交换蛋白质和遗传信息，因为EVs可以将mRNA、长非编码RNA（lncRNA）和miRNA转移到靶细胞[18,20,46–48]. Quesenberry的研究小组已经证明了来自分化组织的EVs诱导的骨髓来源细胞的上皮结合[49]. 他们表明，EV介导的蛋白质和遗传信息从肺损伤细胞转移到骨髓源细胞可能会重新编程骨髓细胞表型以获得肺上皮特异性标记物[19,20]. 此外，来自前列腺癌或肺癌细胞的EV和来自肺损伤细胞的EVs也能触发骨髓细胞中稳定的表观遗传变化，激活前列腺或肺特异性基因的表达[50,51]EV内化为靶细胞后[52]. 综上所述，这些结果表明，从分化损伤组织中收集的EV可以有效地诱导骨髓细胞的表观遗传修饰，从而获得起源组织的表型特征。

先前的研究表明，肾小管上皮细胞及其条件培养液可诱导MSCs的上皮转化[1–4]. 在本研究中，我们证明RPTEC释放的EV是骨髓源性MSC上皮分化的主要介质。事实上，我们注意到缺乏EVs的RPTEC衍生的条件培养基不再能够在MSC中诱导MET。特别是，在MSCs与EVs孵育一周后，我们观察到TWIST1、FOXC2的表达降低，已知其抑制上皮基因表达[53,54]和波形蛋白，一种参与细胞粘附和迁移的蛋白质[55,56]. 此外，在用EVs刺激MSC两周后，我们观察到上皮标记物细胞角蛋白18的表达增加，这有助于维持上皮细胞极性，并在细胞粘附和细胞间相互作用中发挥重要作用[57–59]氨肽酶a的表达略有增加。这种锌依赖性金属蛋白酶通常在肾近曲小管细胞刷状缘膜中表达，已知其参与清除不同肽（例如血管紧张素II）中残留的N末端氨基酸[60,61]. 综上所述，这些结果表明EVs诱导了MSCs的上皮分化。

为了了解EVs诱导MSCs上皮结合的机制，我们对EV蛋白和RNA含量进行了表征。我们发现EVs中含有上皮特异性蛋白和转录物，这些转录物在传递到靶细胞后可能与MSCs的早期上皮结合有关。坚持吉尔吉斯斯坦共和国18用EVs刺激14天后，MSCs中的表达表明表观遗传改变有助于维持MSCs上皮承诺。MSC转录组的长期改变可能是由于非编码RNA（如miRNAs）转移后的表观遗传改变[62]. 最近，已观察到EVs介导的miRNAs在分化的正常细胞之间的转移[21,63]间充质干细胞与分化细胞之间[64–66]间充质干细胞和癌细胞之间[67–69]以及肿瘤微环境内部[70–72].

为了研究EV的miRNA含量，我们分析了754个已知人类成熟miRNA的RNA，并鉴定了20个与EMT通路密切相关的miRNA。特别是，我们检测到一些属于miR-200家族的miRNAs的表达。肿瘤细胞研究进展[73–76]已证明miR-200家族miRNAs（miR-200a、miR-200b、miR-2001c、miR-141、miR-429）参与EMT。事实上，成熟的miR-200家族miRNAs通过锌指E-box结合转录因子1和2的转录后抑制获得上皮细胞表型，从而促进E-cadherin的表达(ZEB1号机组和ZEB2型) [77]. 在EMT期间，ZEB1号机组和ZEB2型过度表达导致E-cadherin的转录抑制，促进间充质细胞表型。这个过程可能是可逆的，因为miR-200家族miRNAs表达增加会启动MET，恢复E-cadherin表达并促进上皮表型[77].

由于miR-200家族miRNAs是由EV转运的，我们研究了这些miRNA在MSCs中的作用及其对MET的可能贡献。用5种合成miR-200模拟物转染骨髓衍生的MS细胞一周后，我们观察到VIM公司和FN1型是另一种与细胞粘附、细胞迁移、细胞生长和细胞分化有关的间充质标志物[78]. 此外，我们观察到恩普表明miR-200 miRNAs可以诱导MSCs的上皮性结合。这些数据表明，EV可能通过转移属于miR-200家族的一小部分miRNAs来促进MSC的上皮细胞承诺。

此外，为了验证我们对EV衍生miRNAs的预测分析结果，我们随机选择了cyclin D1（CCND1）和胰岛素生长因子-1受体（IGF1R），来自所有预测性miRNA靶基因。

CCND1号机组编码细胞周期依赖性激酶4（CDK4）和细胞周期依赖激酶6（CDK6）的调节亚单位，其活性是细胞周期G1/S转换所必需的[79]. CCND1参与细胞增殖、存活、侵袭、转移形成，其过度表达与肿瘤发生有关[80,81]. 最近的研究表明，CCND1激活可以在肿瘤细胞中诱导EMT，例如卵巢癌[82]，乳腺癌[83]，食管癌[84]和表皮样癌细胞[85]. 尤其是苏等. [84]研究表明，抑制CCND1可下调其他间充质标志物的表达，并逆转食管癌细胞中的EMT。

IGF1R是一种与配体IGF1结合的跨膜受体酪氨酸激酶，可激活PI3K-Akt途径和Erk-MAPK途径。先前的研究表明，IGF1R激活可以诱导前列腺癌的EMT[86]，乳腺癌[87,88]，乳腺上皮细胞[89]和肺癌细胞[34,90]. 努尔维迪亚等. [35]发现抑制IGF1R可逆转缺氧诱导的EMT。周等. [90]据报道，IGF1R激活通过上调蜗牛的表达和促进β-catenin从细胞膜转移到细胞核，进而下调E-cadherin的表达，在肺癌细胞中诱导EMT。

我们评估了CCND1号机组和IGF1R型用EVs或TOT-CM孵育后，以及用miR-200模拟物转染细胞后，在MSCs中。我们发现EV和miR-200家族miRNAs都能有效减少CCND1号机组和IGF1R型MSCs表达。这些结果证实了CCND1号机组和IGF1R型下调提示MET。荧光素酶报告试验证明CCND1号机组和IGF1R型是EV递送的miRNA的靶基因，从而验证了我们miRNA预测分析的结果。

总之，从管状上皮细胞释放的EVs可以通过诱导上皮结合来改变MSCs的表型，这可能有助于MSCs的再生潜力。是否发生此现象体内仍有待定义。

支持信息

S1图。人骨髓源MSCs的特征。

A-B）显示MSCs表达波形蛋白（A）和细胞角蛋白（B）的典型显微照片。细胞核用Hoechst染料复染。进行了三个独立的实验，结果相似。原始放大倍数：X630。C） MSCs的典型FACS分析显示CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面分子的表达（蓝色区域）。未检测到EpCAM的表达。绿线表示同型对照。对6种不同的MSCs制剂进行了分析，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.s001

（畅通节能法）

S2图。人肾小管细胞（RPTEC）的特征。

A-B）显示MSCs表达波形蛋白（A）和细胞角蛋白（B）的典型显微照片。细胞核用Hoechst染料复染。进行了三个独立的实验，结果相似。原始放大倍数：X630。C） RPTEC的典型FACS分析显示CD24、CD29、CD44、α-5整合素（CD49e）、α-6整合素、CD73、CD146、EpCAM和HLA-class I表面分子（蓝色区域）的表达。未检测到VEGF受体II（KDR）、CD45和CD105的表达。虚线表示同型对照。对六种不同的RPTEC制剂进行了分析，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.s002

（畅通节能法）

S1表。电动汽车中发现的237个miRNAs的列表。

结果表示为三个独立实验的平均值±SD。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.s003

（DOCX）

S2表。EV中发现的miRNAs显著丰富了KEGG生物途径列表（p<0.001，FDR校正）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159163.s004

（DOCX）

作者贡献

构思和设计实验：G.Chiabotto SB G.Camussi。进行实验：G.Chiabotto SB。分析数据：G.Chiabotto SB FC G.Camussi。提供的试剂/材料/分析工具：FC G.Camussi。论文撰写人：G.Chiabotto SB FC G.Camussi。

工具书类

  1. 1Singaravelu K，Padanilam BJ。MSC体外分化为具有肾小管上皮样表型的细胞。任正非失败了。2009;31(6):492–502. 采购经理人识别号：19839827
  2. 2Baer PC、Bereiter Hahn J、Missler C、Brzoska M、Schubert R、Gauer S等。来自肾小管上皮细胞的条件培养基启动人间充质干细胞的分化。细胞增殖。2009年2月；42(1):29–37. pmid:19143761
  3. 三。Wan JX、Zou ZH、You DY、Cui J、Pan YB。骨髓间充质干细胞体外分化为管状上皮样细胞。细胞生物化学功能。2012年3月；30(2):129–38. pmid:22125055
  4. 4Papadimou E、Morigi M、Iatropoulos P、Xinaris C、Tomasoni S、Benedetti V等。使用无细胞提取物将人类骨髓基质细胞直接重编程为功能性肾细胞。干细胞报告。2015年4月14日；4(4):685–98. pmid:25754206
  5. 5Fanni D、Fanos V、Monga G、Gerosa C、Nemolato S、Locci A等。人类肾发生过程中间质-上皮过渡中的MUC1：改变肾祖细胞/干细胞的命运？《母婴医学杂志》，2011年10月；24补充2:63–6。采购订单编号：21966898
  6. 6Kanazawa T、Ichii O、Otsuka S、Namiki Y、Hashimoto Y、Kon Y。肝细胞核因子4α与C57BL/6小鼠发育中肾脏的间质-上皮转变相关。兽医医学杂志。2011年5月；73(5):601–7. 采购订单编号：21186337
  7. 7Kallui R，Neilson EG.上皮-间质转化及其对纤维化的影响。临床投资杂志。2003年12月；112（12）：1776–84。电话：14679171
  8. 8Lee JM、Dedhar S、Kalluri R、Thompson EW。上皮-间充质转化：信号、发育和疾病的新见解。细胞生物学杂志。2006年3月27日；172(7):973–81. 电话：16567498
  9. 9瓜里诺M.上皮-间质转化与肿瘤侵袭。国际生物化学与细胞生物学杂志。2007;39(12):2153–60. 采购订单编号：17825600
  10. 10Yang J，Weinberg RA。上皮-间充质转化：处于发育和肿瘤转移的十字路口。开发单元。2008年6月；14(6):818–29. 采购经理编号：18539112
  11. 11Kalluri R，Weinberg RA。上皮-间充质转化的基础。临床投资杂志。2009年6月；119(6):1420–8. 采购经理编号：19487818
  12. 12Thiery JP，Acloque H，Huang RY，Nieto MA。发育和疾病中的上皮-间质转化。单元格。2009年11月25日；139(5):871–90. 采购经理人识别号：19945376
  13. 13Nieto MA。健康和疾病中上皮细胞向间充质细胞转化的过程。Annu Rev细胞开发生物学。2011;27:347–76. 采购经理编号：21740232
  14. 14利普舒茨JH。肾脏的分子发育：基因破坏研究结果综述。美国肾脏病杂志。1998年3月；31(3):383–97. 采购订单编号：9506676
  15. 15Rothenpieler UW，Dressler GR.Pax-2是肾脏发育过程中间质-上皮转化所必需的。发展。1993年11月；119（3）：711–20。pmid:8187639
  16. 16Hogan BL，Kolodziej PA。器官发生：小管发生的分子机制。Nat Rev基因。2002年7月；3(7):513–23. 采购订单编号：12094229
  17. 17Ratajczak J、Wysoczynski M、Hayek F、Janowska-Wieczorek A、Ratajgzak MZ。膜衍生微泡：细胞间通信的重要和未被重视的介质。白血病。2006年9月；20(9):1487–95. 采购订单编号：16791265
  18. 18Ratajczak J、Miekus K、Kucia M、Zhang J、Reca R、Dvorak P等。胚胎干细胞衍生的微泡对造血祖细胞重新编程：mRNA和蛋白质水平传递的证据。白血病。2006年5月；20(5):847–56. 采购订单编号：16453000
  19. 19Aliotta JM、Sanchez-Guijo FM、Dooner GJ、Johnson KW、Dooner MS、Greer KA等。肺源性微泡改变骨髓细胞基因表达、蛋白质生成和植入肺：表型调节的新机制。干细胞。2007年9月；25(9):2245–56. pmid:17556595
  20. 20Aliotta JM、Pereira M、Johnson KW、de Paz N、Dooner MS、Puente N等。微泡进入骨髓细胞通过直接传递mRNA和诱导转录介导mRNA的组织特异性变化。实验血液学。2010年3月；38(3):233–45. 采购订单编号：20079801
  21. 21Valadi H，Ekström K，Bossios A，Sjöstrand m，Lee JJ，Lötvall JO。外泌体介导的信使核糖核酸和微小核糖核酸的转移是细胞间遗传交换的一种新机制。自然细胞生物学。2007年6月；9(6):654–9. pmid:17486113
  22. 22Collino F、Deregibus MC、Bruno S、Sterpone L、Aghem G、Viltono L等。来源于成人骨髓和组织特异性间充质干细胞的微泡穿梭选择的miRNAs模式。公共科学图书馆一号。2010年7月27日；5（7）：e11803。采购经理编号：20668554
  23. 23Penfornis P、Vallabhaneni KC、Whitt J、Pochampally R.肿瘤微环境中作为微RNA、蛋白质和脂质载体的细胞外囊泡。国际癌症杂志。2016年1月1日；138(1):14–21. 采购订单编号：25559768
  24. 24Bartel博士。微RNA：基因组学、生物发生、机制和功能。单元格。2004年1月23日；116(2):281–97. 采购订单编号：14744438
  25. 25Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，Tuschl T.小表达RNA编码新基因的鉴定。科学。2001年10月26日；294(5543):853–8. 采购经理编号：11679670
  26. 26Bruno S、Grange C、Deregibus MC、Calogero RA、Saviozzi S、Collino F等。间充质干细胞衍生的微泡可预防急性肾小管损伤。《美国肾脏病杂志》。2009年5月；20(5):1053–67. pmid:19389847
  27. 27Bruno S、Grange C、Collino F、Deregibus MC、Cantaluppi V、Biancone L等。来源于间充质干细胞的微泡提高急性肾损伤致死模型的存活率。公共科学图书馆一号。2012;7（3）：e33115。采购订单编号：2243199
  28. 28Théry C，Amigorena S，Raposo G，Clayton A.从细胞培养上清液和生物液中分离和鉴定外泌体。电流原细胞生物。2006年4月；第3章：单元3.22。
  29. 29Collino F、Bruno S、Incarnato D、Dettori D、Neri F、Provero P等。间充质基质细胞衍生的携带微小RNA的细胞外囊泡诱导的AKI恢复。《美国肾脏病杂志》。2015年10月；26(10):2349–60. 采购订单编号：25901032
  30. 30Lindoso RS、Collino F、Bruno S、Araujo DS、Sant’Anna JF、Tetta C等。间充质基质细胞释放的细胞外小泡调节肾小管细胞中的miRNA并抑制ATP耗竭损伤。干细胞开发，2014年8月1日；23(15):1809–19. 采购订单编号：24669934
  31. 31Grange C、Tapparo M、Bruno S、Chatterjee D、Quesenberry PJ、Tetta C等。通过光学成像监测的急性肾损伤模型中间充质干细胞衍生细胞外囊泡的生物分布。《国际分子医学杂志》，2014年5月；33(5):1055–63. 采购订单编号：24573178
  32. 32Jang KJ、Mehr AP、Hamilton GA、McPartlin LA、Chung S、Suh KY等。用于药物转运和肾毒性评估的人肾近端小管芯片。集成生物（Camb）。2013年9月；5(9):1119–29.
  33. 33Wessel D，Flügge UI。一种在含有洗涤剂和油脂的稀溶液中定量回收蛋白质的方法。分析生物化学。1984年4月；138(1):141–3. 采购订单编号：6731838
  34. 34Dimuccio V、Ranghino A、PraticóBarbato L、Fop F、Biancone L、Camussi G等。移植肾功能缓慢和血管损伤患者的尿CD133+细胞外小泡减少。公共科学图书馆一号。2014年8月6日；9（8）：e104490。采购订单编号：25100147
  35. 35Nurwidya F，Takahashi F，Kobayashi I，Murakami A，Kato M，Minakata K等。用胰岛素样生长因子1受体抑制剂治疗可逆转非小细胞肺癌中缺氧诱导的上皮-间质转化。生物化学与生物物理研究委员会。2014年12月12日；455(3–4):332–8. 采购订单编号：25446090
  36. 36Vlachos IS、Kostoulas N、Vergoulis T、Georgakilas G、Reczko M、Maragkakis M等。DIANA miRPath v.2.0：研究微RNA在通路中的组合效应。《核酸研究》，2012年7月；40（Web服务器问题）：W498–504。采购订单编号：22649059
  37. 37Xu JF，Yang GH，Pan XH，Zhang SJ，Zhao C，Qiu BS，等。人骨髓源性间充质干细胞成骨分化过程中外显体中microRNA表达谱的改变。公共科学图书馆一号。2014年12月11日；9（12）：e114627。采购订单编号：25503309
  38. 38Hupkes M、Sotoca AM、Hendriks JM、van Zoelen EJ、Dechering KJ。MicroRNA miR-378促进BMP2诱导的间充质祖细胞成骨分化。BMC分子生物学。2014年1月27日；15:1. 采购订单编号：24467925
  39. 39伯恩·H，Christensen EI。生理和病理学中的肾白蛋白吸收。《肾脏国际》2006年2月；69(3):440–9. pmid:16514429
  40. 40Korpal M，Kang Y.miR-200家族微RNA在上皮-间质转化和肿瘤转移中的新作用。RNA生物学。2008年7月至次年12月；5(3):115–9. pmid:19182522
  41. 41Mongroo PS，Rustgi AK。miR-200家族在上皮-间质转化中的作用。癌症生物治疗。2010年8月1日；10(3):219–22. 采购订单编号：20592490
  42. 42Campanaro S、Picelli S、Torregrossa R、Colluto L、Ceol M、Del Prete D等。参与TGF-β1驱动的肾上皮细胞上皮-间充质转化的基因在人类相互作用图谱中具有拓扑相关性。BMC基因组学。2007年10月22日；8:383. pmid:17953753
  43. 43Moustakas A，Heldin CH.胚胎发生和癌症进展期间引导上皮-间充质转化的信号网络。癌症科学。2007年10月；98(10):1512–20. pmid:17645776
  44. 44Katoh Y，Katoh M.Hedgehog信号转导，上皮-间充质转化和miRNA（综述）。国际分子医学杂志，2008年9月；22(3):271–5. 采购经理编号：18698484
  45. 45刘X、云F、石磊、李志华、罗恩润、贾毅夫。信号通路在肿瘤内皮细胞-间充质转化中的作用。亚太癌症预防杂志。2015;16(15):6201–6. 采购订单编号：26434817
  46. 46Chen X，Liang H，Zhang J，Zen K，Zhang-CY。分泌的微RNA：一种新的细胞间通讯形式。趋势细胞生物学。2012年3月；22(3):125–32. pmid:22260888
  47. 47Gallo A、Tandon M、Alevizos I、Illei GG。血清和唾液中检测到的大多数微小RNA集中在外泌体中。公共科学图书馆一号。2012;7（3）：e30679。pmid:22242.78万
  48. 48Raposo G，Stoorvogel W.细胞外小泡：外分泌体、微泡和朋友。细胞生物学杂志。2013年2月18日；200(4):373–83. pmid:23420871
  49. 49Quesenberry PJ，Aliotta JM。细胞表型转换和微泡。Adv Drug Delive Rev.2010年9月30日；62(12):1141–8. 采购订单编号：20558219
  50. 50Renzulli JF 2nd、Del Tatto M、Dooner G、Aliotta J、Goldstein L和Dooner M等。正常人骨髓细胞中前列腺特异性基因表达的微泡诱导。乌洛尔杂志。2010年11月；184(5):2165–71. 采购订单编号：20850816
  51. 51Del Tatto M，Ng T，Aliotta JM，Colvin GA，Dooner MS，Berz D等。人类肺癌细胞诱导的骨髓细胞遗传表型变化。实验血液学。2011年11月；39(11):1072–80. 采购订单编号：21864488
  52. 52Aliotta JM、Pereira M、Sears EH、Dooner MS、Wen S、Goldberg LR等，肺源性外体对骨髓祖细胞/干细胞和分化细胞的摄取和表观遗传调控。《细胞外囊泡》。2015年9月16日；4:26166. pmid:26385657
  53. 53Yang J、Mani SA、Donaher JL、Ramaswamy S、Itzykson RA、Come C等。Twist是形态发生的主要调节因子，在肿瘤转移中起着重要作用。单元格。2004年6月25日；117(7):927–39. 采购订单编号：15210113
  54. 54Mani SA、Yang J、Brooks M、Schwaninger G、Zhou A、Miura N等。间充质叉头1（FOXC2）在转移中起着关键作用，并与侵袭性基底样乳腺癌有关。美国国家科学院院刊2007年6月12日；104(24):10069–74. pmid:17537911
  55. 55Eckes B，Dogic D，Colucci-Guyon E，Wang N，Maniotis A，Ingber D等。波形蛋白缺乏的成纤维细胞的机械稳定性、迁移和收缩能力受损。细胞科学杂志。1998年7月；111（第13部分）：1897–907。pmid:9625752
  56. 56Ivaska J、Pallari HM、Nevo J、Eriksson JE。波形蛋白在细胞粘附、迁移和信号传递中的新功能。实验细胞研究2007年6月10日；313(10):2050–62. pmid:17512929
  57. 57Chu PG、Weiss LM。人类组织和肿瘤中的角蛋白表达。组织病理学。2002年5月；40(5):403–39. 采购订单编号：12010363
  58. 58欧文斯DW，莱恩EB。对简单上皮角蛋白功能的探索。生物论文。2003年8月；25(8):748–58. pmid:12879445
  59. 59Messai Y、Noman MZ、Derouiche A、Kourda N、Akalay I、Hasmim M等。细胞角蛋白18表达模式与肾细胞癌进展相关：与蜗牛的关系。国际癌症杂志。2010年5月；36(5):1145–54. 采购订单编号：20372788
  60. 60Wang J，Cooper MD。氨肽酶A锌结合基序中的组氨酸残基对酶活性至关重要。美国国家科学院院刊1993年2月15日；90（4）:1222–6。pmid:8433982
  61. 61Goto Y，Hattori A，Ishii Y，Mizutani S，Tsujimoto M.人氨肽酶A的酶学特性。钙和血管紧张素对其酶活性的调节。生物化学杂志。2006; 281: 23503–13. pmid:16790432
  62. 62Aliotta JM、Pereira M、Li M、Amaral A、Sorokina A、Dooner MS等。肺源性微泡诱导骨髓细胞的稳定细胞命运变化。《细胞外囊泡》。2012年4月16日；1
  63. 63Njock MS、Cheng HS、Dang LT、Nazari-Jahantigh M、Lau AC、Boudreau E等。内皮细胞通过分泌含有抗炎microRNA的细胞外小泡抑制单核细胞活化。鲜血。2015年5月14日；125(20):3202–12. pmid:25838349
  64. 64Yuan A，Farber EL，Rapoport AL，Tejada D，Deniskin R，Akhmedov NB，等。通过胚胎干细胞微泡转移微RNA。公共科学图书馆一号。2009;4（3）：e4722。采购经理人识别号：19266099
  65. 65Xin H，Li Y，Buller B，Katakowski M，Zhang Y，Wang X，等。外显子介导miR-133b从多能间充质基质细胞向神经细胞的转移有助于神经突起的生长。干细胞。2012年7月；30(7):1556–64. 采购经理编号：22605481
  66. 66Martin PJ、Haren N、Ghali O、Clabaut A、Chauveau C、Hardouin P等。通过骨髓脂肪细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）在成骨细胞中转移脂肪生成RNA。BMC细胞生物学。2015年3月18日；16:10. 采购订单编号：25887582
  67. 67Lee JK、Park SR、Jung BK、Jeon YK、Lee YS、Kim MK等。来自间充质干细胞的外显子通过下调乳腺癌细胞中VEGF的表达抑制血管生成。公共科学图书馆一号。2013年12月31日；8（12）：e84256。电话：24391924
  68. 68Katakowski M、Buller B、Zheng X、Lu Y、Rogers T、Osobamiro O等。表达miR-146b的骨髓基质细胞的外显子抑制胶质瘤生长。癌症快报。2013年7月10日；335(1):201–4. pmid:23419525
  69. 69Ono M、Kosaka N、Tominaga N、Yoshioka Y、Takeshita F、Takahashi RU等。骨髓间充质干细胞的外显子含有一种促进转移性乳腺癌细胞休眠的微RNA。科学信号。2014年7月1日；7（332）:ra63。pmid:24985346
  70. 70Singh R、Pochampally R、Watabe K、Lu Z、Mo YY。外显子介导的miR-10b转移促进乳腺癌细胞侵袭。摩尔癌症。2014年11月26日；13:256. pmid:25428807
  71. 71Neviani P，Fabbri M.肿瘤微环境中的外体microRNAs。Front Med（洛桑）。2015年7月22日；2:47.
  72. 72Ridder K、Sevko A、Heide J、Dams M、Rupp AK、Macas J等。肿瘤微环境中功能RNA的胞外囊泡介导转移。肿瘤免疫学。2015年3月19日；4（6）：e1008371。采购订单编号：26155418
  73. 73Korpal M，Lee ES，Hu G，Kang Y.miR-200家族通过直接靶向E-cadherin转录阻遏物ZEB1和ZEB2抑制上皮-间充质转化和癌细胞迁移。生物化学杂志。2008年5月30日；283(22):14910–4. 采购经理编号：18411277
  74. 74Park SM，Gaur AB，Lengyel E，Peter ME。miR-200家族通过靶向E-cadherin阻遏物ZEB1和ZEB2来确定癌细胞的上皮表型。基因开发2008；22:894–907. 采购经理编号：18381893
  75. 75Gibbons DL，Lin W，Creighton CJ，Rizvi ZH，Gregory PA，Goodall GJ等。环境细胞外线索通过调节miR-200家族表达促进肿瘤细胞EMT和转移。基因开发2009；23:2140–51. 采购订单编号：19759262
  76. 76Perdigáo-Henriques R、Petrocca F、Altschuler G、Thomas MP、Le MT、Tan SM等。miR-200通过抑制Zeb2和Snail1转录抑制复合物的多个成员，促进间充质向上皮的过渡。致癌物。2016年1月14日；35(2):158–72. 采购订单编号：25798844
  77. 77Teague EM，Print CG，Hull ML。微RNA在子宫内膜异位症和相关生殖条件中的作用。Hum Reprod更新。2010年3月至4月；16(2):142–65. 采购经理编号：19773286
  78. 78Pankov R，Yamada KM.纤维结合蛋白一览。细胞科学杂志。2002年10月15日；115（第20部分）：3861–3。采购经理编号：12244123
  79. 79Musgrove EA、Caldon CE、Barraclough J、Stone A、Sutherland RL。Cyclin D作为癌症治疗靶点。Nat Rev癌症。2011年7月7日；11(8):558–72. 采购订单编号：21734724
  80. 80Kim JK，Diehl JA。核细胞周期蛋白D1：人类癌症的致癌驱动因素。细胞生理学杂志。2009年8月；220(2):292–6. 采购经理人识别号：19415697
  81. 81Shan J，Zhao W，Gu W.通过促进细胞周期蛋白D1降解抑制癌细胞生长。分子细胞。2009年11月13日；36(3):469–76. 采购经理人识别号：19917254
  82. 82焦杰，黄磊，叶峰，石敏，程X，王X，等。细胞周期蛋白D1影响上皮性卵巢癌干细胞样细胞的上皮-间质转化。Onco针对Ther。2013年6月20日；6:667–77. pmid:23836980
  83. 83Tobin NP、Sims AH、Lundgren KL、Lehn S、Landerg G.Cyclin D1、Id1和EMT在乳腺癌中的作用。BMC癌症。2011年9月28日；11:417. 采购经理编号：21955753
  84. 84Su H，Jin X，Shen L，Fang Y，Fei Z，Zhang X，等。抑制细胞周期蛋白D1可提高食管癌细胞对放射治疗的敏感性并逆转上皮细胞向间质细胞的转化。肿瘤生物学。2016年4月；37(4):5355–63. 采购订单编号：26561473
  85. 85Mejlvang J、Kriajevska M、Vandewalle C、Chernova T、Sayan AE、Berx G等。SIP1对细胞周期蛋白D1的直接抑制可减弱经历上皮-间质转化的细胞的细胞周期进展。分子生物学细胞。2007年11月；18(11):4615–24. 采购订单编号：17855508
  86. 86Graham TR，Zhau HE，Odero Marah VA，Osunkoya AO，Kimbro KS，Tighiouart M等。胰岛素样生长因子I依赖性ZEB1的上调驱动人类前列腺癌细胞中上皮向间充质的转变。癌症研究2008年4月1日；68(7):2479–88. pmid:18381457
  87. 87Irie HY、Pearline RV、Grueneberg D、Hsia M、Ravichandran P、Kothari N等。Akt1和Akt2在调节细胞迁移和上皮-间质转化中的不同作用。细胞生物学杂志。2005年12月19日；171（6）：1023–34。pmid:16365168
  88. 88Taliaferro-Smith L、Oberlick E、Liu T、McGlothen T、Alcaide T、Tobin R等。FAK激活是IGF1R介导的间充质三阴性乳腺癌细胞EMT、迁移和侵袭调控所必需的。Oncotarget公司。2015年3月10日；6(7):4757–72. 采购订单编号：25749031
  89. 89Kim HJ、Litzenburger BC、Cui X、Delgado DA、Grabiner BC、Lin X等。组分活性I型胰岛素样生长因子受体导致永生化乳腺上皮细胞的转化和异种移植生长，并伴有NF-kappaB和蜗牛介导的上皮-间充质转化。分子细胞生物学。2007年4月；27(8):3165–75. 采购订单编号：17296734
  90. 90周杰，王杰，曾毅，张旭，胡强，郑洁，等。上皮-间充质转变在晚期非小细胞肺癌IGF1R诱导的EGFR-TKIs耐药中的意义。Oncotarget公司。2015年12月29日；6(42):44332–45. 采购订单编号：26554308