1.简介

高压单晶衍射技术已经在广泛的科学学科中广泛应用于材料研究。最近在压力下进行结构解释的材料示例包括自旋交叉复合物（特纳等人。2020年)分子磁体（Etcheverry-Berrios等人。2020年)、制药（奥斯瓦尔德等人。, 2010)，分子和骨架多孔材料（McKellar&Moggach，2015)，气体（Lunegaard等。, 2009)，纯金属（McMahon&Nelmes，2006)、合金（Perez-Albourne等人。, 1966)、蛋白质（Librizzi等人。, 2018)与行星科学相关的分子（Cable等人。, 2021). 多年来，为了研究这些材料，开发了一系列高压单晶衍射仪，包括用于两种实验室衍射仪的高压毛细管压力室（Yufit&Howard，2005)用于中央设施（McMonagle等人。2020年)用于探索低压（<2000 atm）对软材料的影响（McMonagle等人。, 2022). 到目前为止，用于施加更高压力（>2000 atm，0.2 GPa）的最常见的高压单晶衍射仪是金刚石压砧电池（或DAC）（Merrill&Bassett，1974; 莫加等人。, 2008). DAC通常由不锈钢（或高强度Vascomax钢）制成的阀体、支撑盘、金刚石砧和垫片材料组成（图1). 钻石表面有一个小的平面（称为浮石），大小不一，但通常约为几百微米。样品室形成为一个圆柱形孔（直径小于金刚石颗粒），通过垫圈钻孔，垫圈通常由钨、铬镍铁合金或钢制成，放置在相对的金刚石砧座之间（Dustan，1989). 样品室中可以放置单晶或多晶粉末，以及通常为液体或软固体的压力传递介质（Tateiwa&Haga，2010). 红宝石也被放置在细胞内作为内部压力校准剂，使用红宝石荧光法测量压力（巴奈特等人。1973年). 还使用了其他衍射校准剂，包括石英和铅（Angel等人。, 1997; 斯特拉塞尔等人。, 2014).

图1 为MX1设计的micro-Merrill–Bassett（MMB）电池的渲染图像如下所示(一)带有钢制主体、菱形砧座、支撑盘、垫片和平头螺钉的放大图，用于水平对齐(b条)MMB电池直径俯视图(c（c）)微型-Merrill–Bassett电池顶视图，电池直径突出显示尺寸对比，以及(d日)MMB的渲染视图，显示关闭的单元格。

在实验室仪器上已经建立了数据收集和简化程序，大多数衍射仪制造商在其仪器中都强调了这一能力。大多数DAC都针对Merrill–Bassett型DAC的数据采集进行了优化，因为它们足够小，可以安装在实验室衍射仪上，但需要进行一些轻微的修改，包括更短的准直器和扩展的光束阻挡器。高压单晶衍射在世界各地的许多中心设施也得到了很好的发展，包括同步加速器和中子散射设施。示例包括钻石光源（英国）（诺威尔）的光束线I19等人。, 2012)，美国先进光子源GSECARS 13-BM-C光束线（张等人。, 2017, 2022; 沈等人。, 2005)和SPring-8（日本）的BL10XU光束线（Hirao等人。2020年; 宇都美等人。, 2002; 四月一日等人。, 2001). 这些光束线专用于极端条件，具有大型测角仪和宽敞的实验小屋，能够容纳Merrill–Bassett DAC或其他环境电池。

在这里，我们在澳大利亚同步加速器的MX1光束线上提出了一种新的高压单晶衍射装置，该装置不需要对现有配置进行修改（Coweeson等人。, 2015). 该装置在其他同步加速器上使用微型梅里尔-巴塞特（MMB）电池（最大直径22 mm）；该技术可以适用于任何光束线，而不需要专用的高压光束线。

MX1光束线在用户定义的8–18 keV范围内工作(λ=0.69–1.77º），带双晶Si（111）单色器（Coweeson等人。, 2015). Kirkpatrick–Baez双晶片镜将光束在垂直和水平方向聚焦到120µm×120µm（FWHM）的尺寸（Cowieson等人。, 2015; Siewert公司等人。, 2012). 镜子和相机（Navitar变焦和对焦相机）分别与光束成45°和90°角，这样就可以在轴上观察样品，并且可以通过“点击中心”的电动舞台居中，调节焦距并在横向和垂直位置移动样品。MX1光束线配备迷你-κ测角头（布罗克豪斯等人。, 2013)允许六次采集衍射数据ω-在三种设置下扫描70°φ和κ这使得高压数据的完整性达到了结构的45%L（左）-苏氨酸模型空间组 P（P）2₁2₁2₁例如。Dectris EIGER2 9M光子计数探测器可以快速收集数据。两种材料的高压衍射数据，即氨基酸，L（左）-苏氨酸和蛋白质，四方蛋清溶菌酶（tHEWL），被用来证明可以收集的高压数据的实用性、速度和质量。

2.金刚石压砧单元和底座设计

我们设计并建造了一个小型金刚石压砧电解槽（以下简称MMB电解槽），其设计与最初的Merrill–Bassett电解槽相似，只是通过将电解槽体直径的尺寸从40 mm减小到22 mm，电解槽体的主要质量有所减轻mm，并移除其中一个支撑盘，同时保持80°的全开启角[图1(一)–1(c（c）)]. 尽管这限制了金刚石砧的对准能力，但通过在细胞体的一半上安装对准螺钉和支撑盘，仍然可以轻松实现金刚石对准。减少细胞体的质量是为了将细胞安装在澳大利亚同步加速器MX1束线上的测角仪上，而不需要修改束线样品环境，只需要收回开式低温恒温器（图2). 与其他极端条件的光束线相比，这提供了简单性，在这些极端条件下，需要大型测角仪和宽敞的实验小屋来容纳较重的压力传感器（诺威尔等人。, 2012; 麦克马洪，2015年; 艾伦等人。, 2017).

图2 MMB磁性基底电池夹持器设计，MMB电池安装在澳大利亚同步加速器的MX1光束线上。

该电池在设计上与麦金太尔及其同事使用的微型DAC相似（Novelli等人。, 2022)对于联合X射线和中子实验，尽管为了便于生产，此处建造和使用的电池中的电池体和支撑盘由富钴420级不锈钢制成，而不是由铍铜合金（BERYLCO-25）制成，而电池体设计用于容纳Boehler–Almax切割的金刚石砧座，与标准改良Merrill–Bassett试管中的相同，具有4.00 mm、80°（100）定向、16面、±0.33克拉的金刚石砧座和600µm的颗粒。设计了一个基于磁性的夹具，用于固定电池，并允许将MMB安装到测角仪上（图2). 夹钳的磁性底座与商业供应商提供的单晶衍射磁性底座相同，因此，如果需要，可以很容易地转移到其他光束线或实验室测角仪。因为减少的质量以及有限的金刚石排列能力，不太可能获得~5GPa以上的压力；然而，小单元设计和易于安装到测角仪上，使其成为分子系统上高通量高压衍射的理想选择。

3.MMB单元加载、对齐、数据收集、缩减和细化

确定数据收集、简化和精细化，选择了两个测试样本-氨基酸L（左）-苏氨酸和蛋白质tHEWL。选择这两种系统是因为它们都是高度结晶的，并且之前已经对这两种系统进行了高压研究，以确保在所研究的压力区域内没有相变或异常的结构行为会影响数据质量。晶体L（左）-苏氨酸按原样使用（Sigma-Aldrich），而冻干鸡肉蛋清溶菌酶通过溶解至40 mg ml结晶⁻¹20米M（M）醋酸钠pH 4.7，通过蒸汽扩散生长，如前所述（山田等人。, 2015).

在数据收集之前L（左）-苏氨酸是在实验室Synergy-S HyPix衍射仪上使用钼在环境条件下收集的K_α辐射。然后使用乙醇作为0.15 GPa的静水液体将同一晶体加载到MMB电池中，并在同一Synergy-S HyPix衍射仪上收集，以与同步加速器数据进行比较。根据程序的优化策略计算收集数据CrysAlisPro公司（里加库-牛津衍射，2019年)对于具有40°半开角的DAC。将tHEWL晶体装入母液中，母液用于使样品结晶，作为压力传递介质，置于0.44 GPa的单独MMB池中。这两个样品都装有红宝石球体，用作内压校准剂，采用红宝石荧光法测量压力。没有在tHEWL上收集实验室数据，以尽量减少光束损伤。

然后将MMB电池安装在澳大利亚同步加速器MX1上的水平气浮测角仪上(λ=0.7109º），使用定制磁保持架（图2)（科维森等人。, 2015)DAC的平面朝下ω-轴设置为90°。在DAC的平面上放置一个小的水平仪，并在角度计上调整磁性支架，以确保DAC水平，因此当ω为0°。

这个ω-然后将轴旋转至0°，以便样品可以通过可视化相机进行光学对准。样品室通过电动舞台启用的“点击中心”系统找到并居中，因此它位于十字准线的中心。这个x个-测角仪的轴，位于ω=0°（和180°）沿光束方向移动，通过图形用户界面（GUI）进行调整，使DAC样品室和晶体聚焦。的位置x个-轴（单位：µm）记录在GUI中。然后将角度计旋转至ω=180°和x个-再次调整轴，使DAC样品室和晶体重新聚焦。该位置x个-axis也记录在GUI中。GUI自动计算x个-轴，它代表DAC的两颗钻石之间的中心点，因此也代表位于ω测角仪的旋转轴。的位置x个-轴更改为此中间位置。然后在用户GUI上调整样本相机的焦距，使样本聚焦。此样本定心协议用于使晶体在测角仪的旋转轴上居中，同时还允许在ω-轴为0°和180°。定心过程可能需要几分钟。

此样品校准程序是必要的，因为折射率钻石的焦距会发生变化。然而，由于金刚石砧的尺寸、形状和厚度相同，因此单元两侧的焦距变化相同，这意味着可以在DAC两侧聚焦观察样品室，从而实现光学对准。MX1的宽光束意味着对晶体的不精确定心不会严重影响数据采集的质量。

对齐后，通过旋转ω-轴（表1). 由于Dectris EIGER2 9M的大面积，所有数据收集都是用2θ0°。数据采集是在探测器尽可能靠近样品的位置进行的，距离晶体105 mm。

压力传感器主体的阴影限制了数据的完整性。虽然这可以通过使用较短的波长来补偿，该波长将衍射图样压缩成较小的体积，但当前波长(λ=0.7109Ω），MX1光束线接近可接近极限。要访问更多冗余数据，请调整κ-和φ-迷你轴-κ制作测角头。第一次运行是围绕70°旋转ω=0°，使其从−35°旋转到35°，其中一半框架被细胞体遮蔽，另一半框架被胞体遮蔽。第二次运行是围绕180°旋转70°，因此它在ω=145°和215°。前两次跑步是通过以下方式收集的ω-使用扫描κ-和φ-轴设置为0。要重新定向晶体以访问更多数据κ-然后将轴旋转180°，将晶体移动到χ角度为48°。第三次跑步也是在ω=−35°和35°，第四次采集介于ω=145°和215°。当κ-轴仍为180°φ-轴也设置为180°，将晶体移动到χ角度为−48°。最后两次跑步也是ω=−35°和35°，第四次采集介于ω=145°和215°。不幸的是κ-或φ-迷你的轴-κ测角仪会导致样品中心丢失-必须重新校准，使晶体返回旋转中心ω-轴。在随后的对齐过程中，发现没有必要更改相机焦点的值。这个x个-调整轴，使晶体聚焦于ω=0°，然后ω=180°，且x个-轴移动到这两个值的中心点，这表示晶体处于旋转中心并处于焦点。

帧步长为0.1°，在六次运行的每一次70°楔形中收集700帧。在以下情况下L（左）-苏氨酸的总收集时间为14秒，因此帧时间为0.02秒。之所以选择这种较短的曝光时间，是因为样品衍射强烈，并且发现这是收集强衍射斑点的最佳曝光时间，而不会导致检测器过载。所选择的步长为L（左）-苏氨酸，足以提供可靠的结构解决方案精细化，同时缩短收集时间。此外，精细切片有助于最小化背景，同时允许在多个图像上更好地集成单个反射。

使用将.h5文件转换为.cbf文件艾格2cbf(https://asuserwiki.atlassian.net/wiki/spaces/UO/pages/1543602177/处理+DAC+数据++CrysalisPro)并在中进行处理CrystalsPro公司。由于κ和ϕ运行2和3、运行4和5之间的设置需要重新输入，数据被集成到三组两个运行（1和2、3和4、5和6）中，然后合并后集成。精炼使用菲尼克斯定义（黄嘌呤等人。, 2012)蛋白质数据库（PDB）（伯曼等人。, 2000)条目2yvb公司作为起始模型，并使用手动重建库特（埃姆斯利等人。, 2010).精炼各向异性的B类-因素被限定为七个平移-平动-螺钉组（由菲尼克斯定义). 结构系数和最终模型坐标存放在PDB（ID8f2克). 环境结构L（左）-苏氨酸用货架XT（谢尔德里克，2015年)结构求解程序及其使用Olex2型（多洛曼诺夫等人。, 2009)作为图形界面，采用本征相位解方法。使用2018/3版的ShelXL（货架XL）在上使用全矩阵最小二乘最小化F类²H原子的位置是用几何方法计算的，并使用骑行模型进行了细化，但羟基和甲基H原子除外，其中在代表可能氢位置位置的圆圈周围计算了不同的电子密度合成。一旦发现，羟基和甲基氢原子被约束和精炼，直到它们聚合（所谓的AFIX 147和137约束）。来自同一样品的高压实验室和同步加速器数据L（左）-苏氨酸从环境-压力坐标中提取，使用Olex2 1.5，并使用与上述相同的程序进行改进。由于数据集的完整性降低，热相似性约束被应用于所有非H原子。

4.结果和讨论

结晶数据L（左）-表2总结了在实验室衍射仪和同步加速器上收集的环境压力下、0.15 GPa下的苏氨酸以及在同步加速器上采集的tHEWL（0.44 GPa）和在中给出支持信息表S1至S4.晶体数据L（左）-内部收集的苏氨酸和MX1上收集的苏氨酸具有毫不奇怪的可比性；然而，在MX1上收集的数据速度快678倍（14秒比9504秒）。同一晶体的单位-细胞参数L（左）-实验室来源和MX1收集的0.15 GPa苏氨酸差异小于0.2%，且数据完整性和细化统计（表2)，表明在MX1上收集的高压数据的可靠性。数据也与同一晶体一致L（左）-苏氨酸在环境条件下的特征，以及其先前发表的结构（佐丹奴等人。, 2019). 只需要对热参数进行约束，尽管我们怀疑这可能不是大分子系统的情况。然而，连通性和精细结构几乎是相同的，如图3中的结构叠加所示.

表2 选择性细化统计对于L（左）-利用实验室和同步加速器数据收集苏氨酸和tHEWL 可比较的实验室和同步加速器数据仅适用于L（左）-苏氨酸。   L（左）-苏氨酸 t高度 X射线源 协同-S 协同-S MX1型 LTHREO21型† MX1型 3年（LYM）‡ 四重负荷§ 压力（GPa） 环境 0.15 0.15 环境 0.44 0.1 0.0001 完整性（%） 100 51.2 44.7 100 63.2 不适用 不适用 分辨率 0.73 0.80 0.76 不适用 2.10 2 1.54 我/σ 26.7 31.9 54.6 不适用 7 不适用 不适用 R（右）1(%) 3.95 4.04 4.04 2.60 21.7 14.9 15 数据采集时间（s） 2337 9504 14 不适用 70 不适用 不适用 “空间”组 P（P）212121 P（P）212121 P（P）212121 P（P）212121 P（P）4三212 P（P）4三212 P（P）4三212 一（Å） 5.1456 (2) 5.1419 (2) 5.1498 (5) 5.1481（1） 79.045 78.69 79.197 b条（Å） 7.7415 (4) 7.7217 (4) 7.7304 (5) 7.7426 (1) 79.045 78.69 79.197 c（c）（Å） 13.6223 (6) 13.613 (5) 13.602 (6) 13.6138 (2) 37.865 38 37.9 五(Å三) 542.64 (4) 540.5 (2) 541.4 (3) 542.642 (15) 236585 235300 237715 †CSD参考=LTHREO21（佐丹奴等人。, 2019). PDB参考=3莱姆（昆德罗和理查兹，1987年). §PDB参考=4世界（山田等人。, 2015).

图3 连接和结构L（左）-0.15 GPa的苏氨酸使用(一)澳大利亚同步加速器的MX1光束线和(b条)晶体结构的叠加L（左）-来自实验室X射线源（橙色）和MX1光束线（浅蓝色）的0.15 GPa苏氨酸（为清晰起见，去掉H）。在0.44 GPa（当前研究-蓝色）下测定的溶菌酶和在0.1 MPa（PDB）下测定溶菌酶结构的叠加4世界[山田等人。(2015)–橙色]}如所示(c（c）). 颜色方案(一)为：C–灰色；O–红色；N——蓝色；H–白色。椭圆体的绘制概率为50%。

这个晶体结构 精炼tHEWL在0.44 GPa时的结构也与之前公布的0.1 MPa时的结构一致（山田等人。, 2015)以及0.1 GPa（Kundrot&Richards，1987）)尽管压力发生了变化，但它们的单位-细胞参数相差不到0.6%。还获得了可比的分辨率，平均值为我/σ(我)分辨率为2.10º时低于2.0，而低压结构的分辨率为2.00º和1.54º。图3显示了0.44 GPa和0.1 MPa下tHEWL的叠加显示出几乎相同的结构。

随后高压蛋白数据的详细信息由Fourme于2002年发表等人。(2002)尽管最近的研究表明，为了开发乳品行业的新加工技术，有压力成为探索乳蛋白稳定性的有用工具（奥尔森等人。, 2022). 在这里，高压装置已被证明适用于蛋白质，但还需要进一步的工作，以收集压力下蛋白质晶体的更好数据，这是一个成熟的探索领域。虽然受到可用同步辐射X射线能量的限制，但MX1上的设置是高通量高压单晶衍射的理想选择，并且可以说是世界上最快的静态高压单晶衍射设置。

5.结论和观点

在这里，我们在MX1光束线上为澳大利亚同步加速器的用户提供了一种新的高压单晶衍射装置，用于收集分子和蛋白质晶体结构。在光束线上设计并实现了一种定制的微型金刚石压砧单元（MMB单元），可实现快速可靠静态压力波束线重构最少的数据采集。在两个样品上收集的数据，一个小分子(L（左）-苏氨酸）和蛋白质（tHEWL）显示了光束线收集高压单晶数据的有效性。令人印象深刻的是，在一个单晶样品上收集了等效数据L（左）-苏氨酸的速度是实验室来源的679倍，而在tHEWL上收集的数据显示出使用MX1光束线收集高压单晶衍射数据的前景。

6.相关文献

以下参考文献未在论文正文中引用，已在支持信息：Karplus&Diederichs（2015年); 彼得森等人。(2021).