2.1、。道德声明

马的尸体四肢是从当地一家屠宰场和一家马兽医诊所获得的。在研究中，没有一只动物被安乐死。

2.2. 光束线设置

IMBL的示意图如图1所示(一). 在这项工作中，摆动器磁场设置为3特斯拉，过滤22毫米石墨和2.8毫米铝。我们第一部分工作中使用的X射线探测器是一种名为“Ruby”的间接闪烁光学相机设备。Ruby使用25µm厚的Gadox P43（Gd2O2S:Tb）屏幕将入射X射线场转换为光（霍尔等。, 2013). 屏幕由科学CMOS传感器通过设置为45°的镀银镜子观看。这种设计效率适中，但避免了对敏感传感器电子元件的辐射损坏。Ruby使用商用微距镜头作为集光器，焦距可变，可将图像像素大小设置为6至25µm。对于我们的实验，像素大小为12.0µm，相应的检测器视野为30.7 mm（H）×25.9 mm（V）。为了完整地成像标本的宽度，在两个360°旋转的过程中收集投影图像，其中心被25 mm的水平偏移量隔开。为了覆盖垂直感兴趣区域，在每个CT切片之间垂直移动标本，收集四个CT切片。

图1 IMBL的布局(一)使用（1）X射线源，62极，4.2特斯拉超导摇摆器（Häusermann等。, 2010); （2） 光束定义狭缝；（3） 滤光片，用于去除低能X射线并减少单色器的热负荷；（4） 双晶劳厄型单色器；（5） 次生裂缝；（6） 清理缝隙、成像快门和电离室监测光束强度；（7） 一条90米长的波束传输线，连接至IMBL卫星大楼，带附件3B（见正文）；（8） 预取样清理缝；（9） 多轴CT载物台；（10）红宝石成像探测器。IMBL长145米，最大采样到探测器距离为8米(b条)该单色仪用于在澳大利亚同步加速器IMBL获取sCT图像。

这项工作中的所有扫描包括样品图像集前后的背景（无样品的光束）和暗场（无光束的探测器噪声）成像。然后使用100个背景和100个暗场图像的中位数校正每个样本投影。

在每个投影图像集的开始和结束时，捕获一系列校准图像。在光束中没有样品和光束关闭的情况下，分别拍摄了100张平场和暗场图像。这些图像的平均值用于校准照明和效率方面的系统像素-像素差异。校准后，投影图像像素值是通过样本的真实光线透射。

IMBL允许使用双晶Laue型单色仪对光束能量进行简单调谐[图1(b条); 史蒂文森等。, 2017]. 在这个实验中，我们使用的能量在55到80keV之间，对于大多数数据集来说，有利于55keV。这种能量平衡了对空间分辨率、穿透力和传播距离的竞争需求。

为了利用X射线束相干性进行相位控制成像，探测器和样品被隔开6.0 m。这样做的效果是，在组织密度边界处折射的X射线在传播过程中受到干扰，然后再撞击探测器。这会产生带有轻微边缘增强的原始图像。通过测量这些干涉条纹，我们可以使用均匀传输强度方程（TIE-Hom）来计算X射线通过样品（Paganin等。, 2002). 这增加了投影图像的对比度分辨率，但代价是空间分辨率略有降低。TIE-Hom假设样本中只有一种材料。虽然在这种情况下不太现实，但这种近似方法产生了宝贵的相位控制优点，并大大简化了图像采集协议。

原始投影图像数据的初始处理由内部进行IMBL-拼接软件（Maksimenko，2018). 应用标准平场和暗场校正，缝合垂直图像。随后使用CSIRO进行重建和相位恢复XTRACT公司程序（Gureyev等。, 2011). 在使用滤波反投影（FBP）重建三维体之前，先应用TIE-Hom相位恢复算法。TIE-Hom算法中使用的一个关键参数是伪材料的实部和虚部之间的比率折射率。在我们的处理过程中，发现值100是最佳值。输出是TIFF图像堆栈的形式。图像格式是真正的32位浮点。每个体素值为计算的X射线衰减系数在这个射束能量下。

2.3。尸体肢体的描述和准备

在肢体灌注（新鲜）当天，从当地一家屠宰场获得了九具马尸体肢体。此外，本研究还包括四条之前冷冻过的马肢（冷冻）。其中两条冷冻肢体是从一匹因严重急性椎板炎而被安乐死的马身上获得的；这些是由当地的马兽医诊所提供的。

新鲜肢体准备灌注血管造影剂和体外灌注系统，如下节所述（第一天）。在每个新鲜尸体肢体的胎锁（掌骨或跖指骨）关节处，将一根14-gauge Mila导管插入手指外侧动脉和内侧动脉，并用2号涤纶（尼龙）缝合线固定。在灌注之前和灌注之后，直到CT和sCT成像，新鲜肢体被保存在+4°C的冰箱中。冷冻肢体储存在−20°C的冰箱中。表1总结了每个尸体肢体的准备信息以及从每个肢体获得的数据.

2.4.体外血管造影剂的血管灌注系统

这个体外灌注系统由RMD Engineering Inc.（加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通）建造，用于在循环加载和卸载肢体时输送血管造影剂。它是之前描述的系统的修改版本（Patan等。, 2009). RMD工程制造的悬臂压力机有一个10:1的杠杆臂，杠杆的枢轴距离垂直旋转安装孔60毫米。力臂长度为～600 mm，杠杆臂末端附有刻度，以指示施加在四肢和蹄上的力。使用45MPHP2型蠕动泵输送灌流液，排出液流经Hydor ETH 300型立式液体加热器和压力控制阀。压力由标准0至3 psi（0和155 mmHg）压力表监测。如上所述，输出端连接到插入手指动脉的导管上。泵以固定的30转/分开启⁻¹压力监测范围为5至80 mmHg，而灌注液的输送速度为25 ml min⁻¹直到500毫升通过手指灌注。在灌注期间，245 N被循环到杠杆臂上，从而在肢体上产生约2.45 kN的合力，并以每分钟约30次的速度恢复到0。

新鲜尸体肢体从平蹄底部切至切除肢体顶部，全长约280 mm。然后钻出骨骼中心，并尽可能垂直于骨骼穿线，以接受M12×1.75 mm×60 mm的螺柱。螺柱插入肢体至～30 mmmm深，然后将螺柱拧入垂直旋转接头。将垂直转环插入悬臂，然后插入转环固定螺栓，以将组件固定在悬臂压机中（图2).

图2 将马的尸体脚插入悬臂压力机，以便在体外血管造影灌注。

在输注造影剂之前，用500毫升肝素化0.9%氯化钠（5000国际单位肝素升⁻¹). 使用的血管造影剂是BriteVu（美国犹他州斯嘉丽成像公司），这是一种商业化的基于钡的化合物，专门用于死后血管成像（Clark&Badea，2021）; 谢等。, 2019). 将一具尸体肢体注入商业碘伏（澳大利亚新南威尔士州GE Healthcare Visipaque），这是兽医成像中常用的对比剂。九条新鲜肢体中的八条灌注造影剂（七条灌注BriteVu，一条灌注Visipaque），一条肢体保持未灌注状态，以便对新鲜未灌注肢体进行成像比较。按照制造商的说明制备造影剂，并通过每只肢体的指动脉注入500 ml。

2.5. 常规CT

在第三天，使用位于蒙纳士生物医学成像研究平台（IMBL旁边）的32层西门子Somatom GoUp临床CT机进行常规CT（cCT）。所有13具尸体脚（9只新鲜，4只冰冻）都进行了成像。目的是比较cCT和sCT的分辨率，并评估新鲜足部在死后灌注后血管造影剂的分布。切片准直为0.6 mm，重叠，图像重建分辨率为0.3 mm。X射线源为80 kVp，管电流为95 mA。扫描持续时间为120 s。使用HR60 S3内核设置重建扫描。图像收集在DICOM文件中。结果用于帮助确定哪些脚应该进行sCT成像，以便更有效地利用可用的IMBL束流时间。

2.6. 同步加速器CT

在第四天和第五天对IMBL进行这些比较性sCT扫描。在对每个尸体足进行成像之前，为了便于在光束内定位，在巴氏（近端指间）关节上方锯下每个新鲜的肢体。所有尸体脚在梁内的位置相同，如图3所示.

图3 澳大利亚同步加速器IMBL的sCT成像期间，马尸体脚#3和#5的定位。

同步加速器CT扫描在IMBL的Hutch 3B进行（Häusermann等。, 2010). 随着距离增加传播相位对比度，在距离探测器6米处对每个蹄进行扫描。在这部分工作中，探测器被改为滨松C9252-DK14平板设备，具有100µm像素，视野为126 mm，以覆盖单个图像中的蹄宽度。我们以每幅图像0.059秒的速度收集了3600张360°的图像。

收集sCT数据集时，蹄从旋转中心移位，然后在预处理中翻转和缝合，以每0.1°获得一张完整图像。如前所述，扫描包括样本前后的背景和暗场图像成像、图像集以及使用100帧中值对后者进行校正。图像收集在TIF文件中，并在上查看斐济（Abràmoff）等。, 2004)软件。它们被转换为本出版物的JPG文件。扫描完成后，所有脚都被冻结在−80°C。用于长时间扫描（小时）的脚被处理掉。

2.7. 组织学

完成了四只马蹄的组织学评估，之前它们被冻结在−80°C。如前所述，墨尔本大学兽医病理学系进行了蹄切片，以便对椎板进行组织学评估（Pollitt，1996). 组织学切片包括无对比的正常蹄、有对比的正常足和有椎板炎的蹄（表1). 这些脚与在同步电子CT成像中用于排除辐射引起的组织变化的脚不同。

3.1、。常规CT

3号和5号马蹄片的BriteVu对比度分布最好，被选作sCT扫描。总的来说，BriteVu提供了比Visipaque更好的死后血管对比度。在灌注系统的帮助下，BriteVu造影剂可以输送到薄层毛细血管水平（图5). 毛细血管的充盈适度不对称。

图5 用cCT拍下5号蹄子。薄层毛细血管内可见BriteVu对比（箭头所示）。毛细血管的填充是适度不对称的。

3.2、。同步加速器CT

表3总结了从每个马尸体脚上采集的样本特征和图像13具尸体足中有7具接受了CT成像。数量受到每次扫描持续时间和可用的总光束时间（两天）的限制。感兴趣的区域是位于蹄骨和蹄囊之间的椎板。蹄#9的初始成像（表2)结果表明，55 keV的能量和距离探测器6 m的样品距离使薄层的分辨率达到最佳。因此，这些参数用于所有后续的sCT扫描。短扫描代表蹄的一个部分（一个完整的旋转）。所有七只脚都进行了短扫描，将脚放在舞台上和光束内的位置相同（图3). 对5号蹄（新鲜，BriteVu）和13号蹄（冰冻，椎板炎）从脚底到冠状带的整个蹄进行成像。

图6显示了9号蹄的sCT成像过程中获取的图像。然而，无法看到单独的次级薄片；上的深色条纹外表面每一初级片层中的一个代表次级片层。当比较传统CT和同步加速器CT时，sCT的优越空间分辨率使薄层可视化（图7).

图6 没有对比的正常马的蹄子#9。初级板层是指状突起伸入蹄囊。单个次级片层不可见；然而，每个初级片层外表面的暗带代表次级片层。

图7 与BriteVu对比的普通马的蹄#5。比较cCT和同步加速器上获得的图像。sCT的空间分辨率更高，可以可视化叶片。

图8显示了对新鲜蹄和冷冻蹄（蹄#9和蹄#10）进行成像时图像质量的比较蹄#10上的片层存在适度的变形和伸长；然而，它们保持适度平行。图9显示了薄片血管内BriteVu对比度的分布。

图8 比较9号蹄、新鲜标本（左）和10号蹄、冷冻标本（右）的图像，无对比。蹄子#10上的薄片有中度变形和伸长，但它们保持适度平行。

图9 正常马的5号蹄。BriteVu对比度分布在薄层血管内。

3.3. 一匹患有椎板炎的马的尸体足部影像学研究

3.3.1. 射线照片

在巴拉拉特马诊所安乐死之前，对这匹马（一匹5岁的吉普赛科布母马）的右（蹄#12）和左（蹄#13）前脚进行了侧位X线摄影，因为严重的椎板炎对治疗无效。层粘连炎的可疑原因是内分泌（高胰岛素血症相关的层粘连炎是由马代谢综合征中胰岛素失调引起的）；没有提供明确的诊断。两个前脚的X线照片显示，患有椎板炎的马可能会出现严重的结构变化，包括蹄骨从蹄背壁旋转，蹄骨向脚底下沉的证据，而右前脚的变化更为严重（图10和11). 图12进一步显示血清在蹄壁（箭头）内积聚，这是椎板炎马的特征性发现。A类横截面图4显示了蹄#12的组织学变化以及从同一蹄获得的叶片组织学变化的示例椎板炎的典型组织学变化包括板层的伸长和变薄。

图10 安乐死前，从患有严重椎板炎的马身上获得的右前脚（RF，蹄#12）的X光片，有蹄囊内踏板骨旋转的证据（红色箭头）。照片由巴拉拉特马诊所拍摄，并在获得他们的许可后提供给这里。

图11 安乐死前，从患有严重椎板炎的马身上获得的左前脚（LF，蹄#13）的X光片，有脚蹬骨（黄色箭头）在蹄囊内下沉的证据。照片由巴拉拉特马诊所拍摄，并在获得他们的许可后提供给这里。

图12 患有椎板炎的马的左前脚（LF，蹄#13）的侧内侧X线照片。远端指骨已经旋转，不再与背蹄壁平行（箭头所示）。蹄壁（箭头）内有血清积聚，这是患有椎板炎的马的特征性发现。

3.3.2. 常规和同步加速器CT

传统的CT不能提供足够的分辨率来评估椎板。在一只受椎板炎影响的蹄的sCT中（图13和14)片层不再平行。一些薄片变短，其他薄片变厚和变形。较暗的区域可能代表血清积聚的区域。这些变化与患有椎板炎的马的组织学结果一致。

图13 椎板炎马的蹄子#13，全视图，无对比。此蹄（左前）与图11中的马来自同一匹马和12.薄片不再平行。一些板层缩短，其他板层加厚和变形。

图14 椎板炎马的蹄子#13，放大视图，没有对比。此蹄（左前）与图11中的马来自同一匹马和12.薄片不再平行。一些板层缩短，其他板层加厚和变形。较暗的区域可能代表血清积聚的区域。