1.简介
X射线显微镜(XRM)可以在全场(FF-XRM)或扫描模式(STXM)下进行(Eichert,2015; 利德,2017年). 在全视野模式下,整个视野立即被照亮,而在扫描模式下,样品由聚焦光束扫描,每个点的信号由面积检测器记录。这使得STXM比FF-XRM更耗时,但其优点是可以同时执行多种对比模式,如吸收对比度、差分相位对比度和暗场对比度(Hornberger等。, 2008). 此外,入射光束在样品上的小焦点允许样品中激发原子发射的荧光辐射与有限的空间位置相关联。发射的荧光信号可以通过硅裂谷探测器(SDD)收集,从而确定样品的元素组成。这里介绍的STXM-XRF设置的一个独特功能是使用四通道SDD,其扁平设计能够实现非常大的立体探测角度(见图1和图2)。
另一方面,FF-XRM不适用于荧光显微镜,而相位恢复是可行的,但需要使用其他光学元件,如Zernicke光学元件(Holt等。, 2013). 这是一项复杂的任务,因为这些光学元件(也称为相位环)必须适用于每个样品,并且对准和相位匹配可能具有挑战性。虽然FF-XRM可以在同步加速器设施和实验室中进行,但扫描XRM依赖于高激发强度,以避免很长的测量时间,因此只能在同步加速器设备中使用。
在软能量和软能量范围内建立FF-XRM的同步加速器设施有:ALBA、ALS、Astrid、BESSY、Elettra、NSRL和Ritsumeikan。STXM测量可以在ALS、BESSY、CLS、Diamond、Elettra、Photon Factory、SLS、SSRF和SSRL进行(Obst&Schmid,2014). 可在CLS、Diamond和Elettra(TwinMic)发现STXM与荧光检测(STXM-XRF)结合使用。CLS和Diamond使用对于荧光信号具有相当小的检测角度的常规SDD。Elettra的TwinMic装置包括一个由八个常规SDD组成的探测器系统,这些SDD围绕样品圆形排列。一个具有更大立体探测角度的新系统也在开发中,计划很快投入使用(Giannoncelli等。, 2016; 布丰等。, 2018).
柔软柔和的能量范围特别适合生命科学的应用,因为它为较轻的元素提供了更高的灵敏度。由于在研究生物基质时荧光较低,因此高探测器效率(通过大立体角实现)对于避免长时间测量和辐射损伤是必不可少的。
我们的新型AnImaX(X射线分析成像)终端已在PETRA III(DESY,汉堡)的高亮度光束线P04上进行了测试,具有集成的四通道荧光探测器,具有高达1.1斯特拉的大立体探测角,因此可以将STXM与荧光显微镜结合起来。AnImaX显微镜被设计为一个灵活的终端,适用于各种光束线。可以在一天内使用测试图形进行校准和首次分辨率测试,并且可以在FF-XRM和STXM-XRF之间快速切换[类似于Elettra(Kaulich)的TwinMic等。, 2003)]. 然而,这项工作的重点将是STXM-XRF模式的特性和应用。
为了将荧光显微镜模式发展为分析成像,即对于荧光信号的定量评估检测极限一些选定元素的(LOD)已通过测量薄层样品(Hönicke等。, 2018). 这些样品的层厚在纳米范围内,是为此专门设计和生产的,并且具有非常均匀的横向分布。
进行了关于荧光显微镜的首次原理验证实验,以确定棕色脂肪组织(BAT)中的铁分布。为了应对冷暴露,BAT通过一种称为适应性产热的过程产生热量,以在寒冷环境中保持体温(Heeren&Scheja,2018). 因此,BAT对富含能源的燃料有很高的需求,我们使用BAT激活来可视化对脂蛋白用超顺磁性氧化铁纳米粒子(Bruns等。, 2009).
由于辐射损伤通常是生物样品的一个严重问题,我们将提供不同生物医学相关基质中的辐射剂量估算。结合我们的实验结果,这些考虑证明了样品低温环境的必要性。
2.扫描透射X射线显微镜
由于其灵活的设计,所提出的扫描透射X射线显微镜具有X射线荧光检测(STXM-XRF)与不同的波束线兼容。由于扫描模式下显微镜的分辨率取决于照明点的大小,因此在样品上实现较小的X射线焦点非常重要。为此,我们的STXM-XRF配备了一个波带片(ZP)光学元件、一个中央止动器和一个订单分拣孔(OSA)(图1). 对于每个扫描点,传输的信号由CCD面积检测器捕获,以便可以利用其他对比模式,例如差分相位对比。
| 图1 STXM设置的草图。 |
此外,在装置中安装了一个四通道SDD探测器,以便通过记录荧光进行同步XRF测量发射光谱每个扫描点。探测器由四个独立的SDD组成,这些SDD围绕一个中心孔排列,激发光束通过该中心孔聚焦到样品上。这种几何形状代表了AnImaX端站的一个独特特征,因为它导致检测器和样品之间的距离很小,从而导致检测角度很大(图2).
| 图2 从顶部进入四通道SDD的STXM设置图。对于1keV,给出了荧光粉、样品和ZP之间的距离。 |
2.1. AnImaX端站
AnImaX终端在两个方面都很灵活。首先,它允许在全场传输(FF-XRM)和STXM-XRF模式之间快速切换。其次,它可以很容易地适应、连接和传输到各种波束线,而无需特殊设备。对于有经验的用户来说,可以在大约12小时内将端站连接到波束线并将STXM-XRF对准波束。
在图1中实验装置的轮廓描述了光学元件的排列。图2显示了真空室内设置的详细图纸,以及激励能量1keV。光束由外径为333µm、外区宽度为45 nm、中心光阑直径为160µm的菲涅耳ZP聚焦。在大约三分之二焦距处,直径为150µm的圆形针孔用作OSA,以抑制不需要的衍射级数。四通道SDD从顶部安装,并配有三维手动操纵器。这使我们能够精确地将四通道SDD(来自Bruker Nano GmbH的XFlash 5060F)与光轴(位于x个和年方向)并调整其与样本的距离(操纵器位于z(z)方向)。操纵器提供了较大的设置范围,因此可以使用年操纵器(上下)。
样品安装在压电扫描仪上,理论定位精度为0.1 nm,总范围为100µm×100µm。扫描仪本身安装在一个粗定位台上,该台可以通过压电元件在63mm范围内移动x个方向(与光轴水平)年方向(垂直于光轴),精度为3nm。样品架上最多可以放置八个样品,用户可以在样品之间快速切换。
放在样品后面的荧光屏(P43)被透射的X射线激发并发射可见光。由于波带板中央挡块和OSA的组合,照明具有空心圆锥体的形状,从而在荧光屏上形成特征环形强度分布。荧光屏发出的可见光辐射由光学消色差透镜(直径12.5 mm,(f)=15mm),并由位于配备物镜(Olympus,(f)=75 mm–150 mm,F/4.0)。尽管价格很低探测效率在该光学系统中,四通道SDD的采集时间限制了总扫描时间。
对于STXM-XRF映射,样品在垂直于光轴的平面上进行扫描。这可以一步一步进行,每次测量时样品位置固定,也可以在测量过程中样品连续移动。实时扫描可以根据时间或位置进行控制。对于时间控制测量,扫描位置和步长是根据采集时间和速度计算的,而位置控制测量需要来自扫描仪的编码器信号,以便在样本到达某个位置时开始每次测量。本文给出的结果是在时间控制模式下获得的。
成功进行STXM-XRF测量的主要挑战之一是扫描仪和探测器的正确同步,以进行透射和荧光测量。扫描仪与探测器同步的微小不匹配可能导致耗时的测量无法使用。此外,为了将样品的形态(通过透射测量获得)与样品中的元素分布(通过荧光检测获得)进行比较,有必要使探测器彼此同步。
STXM-XRF中的时间控制扫描基于晶体管-晶体管逻辑(TTL)。在每条线的起点,扫描仪向传输CCD发送信号。然后,CCD以规定的采集时间采集规定数量的图像,并等待下一个信号。对于CCD的采集时间,为SDD提供恒定的TTL信号。由于电子连接(~ns)和CCD的响应时间(2–6µs)和SDD(~1–2¦Μs),时间延迟在<10µs的范围内。
如图3所示在没有任何人工制品的情况下,对西门子恒星测试图案(最小结构:50 nm)进行了时间控制的飞行扫描,这表明扫描仪和CCD的同步工作正常。Siemens恒星由100 nm Si顶部的~150 nm厚W层组成三N个4窗口。图3显示使用录制的图像激励能量仅在传输模式下为720 eV。对其他几个样品测试了CCD探测器与四通道SDD的同步,例如用于生物医学应用,这将在下文中讨论。
| 图3 在飞行模式下采集的测试图案的传输信号。 |
由于西门子星形图案显示了连续的结构尺寸范围,即空间频率,它是一个非常适合的测试对象,不仅可以确定显微镜的空间分辨率极限,还可以确定其对比度传递函数(CTF)。根据物体的频谱,成像系统可以被视为将空间频率从物体传输到成像平面的系统。图3的西门子明星图像用于计算沿球面图案的不同径向位置的对比度。每个半径对应一个特定的空间频率,对比度传递随着空间频率的增加而减小。在图4中给出了生成的CTF。根据Smith(1997))对比度传递减少到10%对应于瑞利分辨率极限,即两个物体点之间的最小距离,它们在相应的图像中仍然可以被区分。在我们的案例中,CTF在5.1µm的空间频率下达到10%−1,对应于98.5 nm的半间距分辨率。此结果与图案的视觉感知一致,其中尺寸小于100 nm的最小结构仍然可以识别。
| 图4 用图3中的西门子星形图案计算对比度传递函数(CTF)CTF达到0.1的空间频率对应于瑞利分辨率极限,并通过图中所示的指数拟合函数确定。 |
2.2. XRF:四通道SDD
四通道SDD由四个独立的kidney形状的SDD单元组成,这些单元围绕一个中心针孔排列,激励光束通过该针孔被引导至样品(图2,右侧)。每个SDD单元的有效面积约为15 mm2,总有效面积为60 mm2.
激发辐射通过中心针孔到达样品,荧光辐射呈后向散射几何(图2,左侧)。这种几何形状与中心针孔和平面设计相结合,使检测器能够定位在靠近样品的位置,从而达到非常高的检测立体角。
为了保护硅芯片免受光电子的影响,它配备了0.5µm厚的聚酯薄膜窗口。由于窗口相对较薄阈值能量假设在距样品最佳距离处,平均入射角为45.5°时,通过Mylar窗口的传输率为~15%,则四通道SDD的传输率降至140 eV。高达~3keV的电子被困在Mylar窗口中。
与CCD相比,四通道SDD的读出时间不是限制因素。理论上,读出时间可以设置为接近响应时间(~1–2µs),但太短,无法收集有意义的XRF光谱。可以根据四通道SDD的最大吞吐量估计合理的最小采集时间。假设荧光强度接近最大吞吐量(~2×106光子−1根据制造商的说法)和XRF光谱中至少500–1000个事件,最小采集时间将为0.5 ms。这与由CCD(2 ms,无箱)和荧光屏(1 ms衰减时间)组成的传输检测系统的采集时间范围相同。然而,对于具有样品不均匀性的实际应用,采集时间至少需要5 ms。对于元素图强烈依赖良好计数统计的定量评估,建议使用更高的采集时间。
为了缩短测量时间,四通道SDD在实时流模式下运行,其中多通道分析仪的每个事件都根据入射光子的顺序传输到PC。在测量过程中,此实时流被转换为每个测量点的光谱,以便对这些光谱中预先选择的感兴趣区域(ROI)进行求和。ROI,即扫描线完成后,将绘制感兴趣的元素。因此,将获得每个选定元素的特殊映射,显示其在样本中的出现和分布。
更精确的光谱评估需要对特征线进行反褶积、背景剥离并考虑探测器效应(逃逸峰、堆积、灵敏度等),并且必须在实验后进行。众所周知的实验条件,再加上对光谱的仔细拟合和使用基本参数(FP)方法,原则上可以实现定量成像。然而,需要考虑非均匀样品中大立体角检测的荧光辐射吸收效应,并对实际定量提出挑战。
2.2.1. 检测立体角大-最佳检测器位置
由于其环形形状(见图2,右),检测立体角作为距离的函数d日可以使用圆形探测器的公式来确定样品的浓度(Zaluzec,2014). 对于环,立体角只是外半径整圈的立体角之差第页o个和内半径第页我,
因素(f)秒∈[0;1]描述了光束路径中障碍物对有效面积的减少,例如探测器表面的稳定网格。
此函数的全局最大值为Ω(d日)=1.1斯特拉德,距离为d日选择=2.42 mm,其中d日选择是四通道SDD(不是活性晶体)安装到样品表面的距离。由于设置的几何形状非常紧凑,在校准过程中无法估计到四通道SDD有源晶体的距离。的价值d日选择在±范围内略有变化Δd日在计算值周围,以便在以下范围内d日最小值=1.81毫米和d日最小值=3.28 mm,立体检测角度仍超过95%[Ω(d日)=1.05斯特拉德]。因此,最好将探测器放置在距离样品表面的这段距离内。
为了验证这些计算得出的假设,使用同质样本(表1)使用激励能量对于不同的样品到探测器距离,收集了1.5keV和XRF的光谱。结果如图5所示,其中以每秒计数为单位的强度(能量范围为0.253–1.341 keV)已绘制为样品表面和四通道SDD安装件之间距离的函数。通过调整上述距离集获得拟合曲线(灰色),最大探测立体角与最大探测强度相关。
元素/成分 | 质量沉积(ng mm−2) | 1 keV(eV)激发的具有相应吸收边的显著荧光线† | 铅 | 84.9 ± 12.3 | | 洛杉矶 | 121.4 ± 14.5 | M(M)5–N个6,7 (836);M(M)4–N个6 (853);M(M)4,5–N个6,7 (647.2) | 钯 | 23.3 ± 4.5 | M(M)4,5–N个2,3 (284.8) | 钼 | 8.6 ± 0.9 | M(M)4,5–N个2,3 (193.5) | 铜 | 22.2±3.3 | L(左)3–M(M)5 (927.7);L(左)2–M(M)4 (947.3) | 铁 | 433.9 ± 5.9 | L(左)3–M(M)5 (704.8);L(左)2–M(M)4 (717.9) | 硅三N个4 | 基底 | 硅:L(左)1–M(M)2 (147.7) | | | 编号:K(K)–L(左)2 (392.4);K(K)–L(左)1 (372.6) | | †IUPAC符号;来自ELAM数据库的能量(ELAM等。, 2002). |
| 图5 测量和模拟强度的距离相关性(四通道SDD到样本)。 |
3.实验
实验主要在PETRA III(Viefhaus)的可变偏振XUV光束线P04上进行等。, 2013). P04是目前世界上软X射线范围内最明亮的光束线之一;来源光辉是1020 光子−1 毫米−2 磁共振成像−2 (0.1%带宽)−1(100毫安)−1和分辨率在250–3000 eV的整个能量范围内超过10000。为了满足我们的要求,我们选择了ZP上具有5 mm(h)×2 mm(v)光束尺寸的准平行光束。
目前可通过STXM-XRF设置实现的能量范围为700 eV至3000 eV。由于四通道SDD位于样品和波带板之间,因此不可能进一步减小样品–ZP距离以获得较低的能量。因此,当前ZP无法获得低于700 eV的能量。一种不同类型的聚焦ZP可以将能量范围扩大到波束线的极限,而波束线目前略低于CK(K)-边缘为~250 eV。
这个通量由于缺乏校准的二极管,没有直接测量样品上的电流。然而,借助于一个有充分记录的XRF校准样品(Hönicke等。, 2018),假设最大检测立体角为1.1斯特拉德光子通量在样本上估计为我0≃ 3 × 109 光子−1.考虑到波束面积与ZP有效面积的比值以及ZP的传输通量在预期范围内。
3.2. 生物医学应用
成像是生物和生物医学研究的重要工具,而光学显微镜是世界各地实验室公认的方法。然而,显微镜的空间分辨率受到探测辐射波长的限制,这对应于可见光显微镜的最小约200 nm(不考虑新的超分辨率技术)。因此,需要具有更高空间分辨率的方法。尽管电子显微镜可以在埃范围内提供非常高的空间分辨率,深度信息只能以大量样品制备为代价获得。X射线显微镜,由于其相对较高穿透深度,这是一种很有前途的方法,尤其是与荧光检测相结合时。
3.3. 辐射损伤-吸收剂量估算
如前一节所示,生物样品中的辐射损伤可以在每像素50–150毫秒的极短测量时间内观察到。估算辐射损伤的第一个指标是吸收剂量D类根据应用情况,观察到以下辐射损伤迹象:D类= 104 未固定水合生物样品的Gy(Schneider,1998),用于D类= 105 蛔虫血细胞的Gy(Fayard等。, 2009)和D类≃ 107 福尔马林固定细胞的Gy(Giannoncelli等。, 2015). 吸收剂量定义为吸收能量的比率ΔE类=我A类小时ν和质量米,
哪里我A类是吸收的光子数小时υ是光子能量。我A类可以根据化学成分、密度计算ρ以及厚度d日样品的质量。质量可以通过假设矩形照明(体积≃100 nm×100 nm×d日)和样品密度ρ.
表4显示了用于剂量估算的经验公式和密度,以及5µm和10µm厚样品的计算吸收剂量和100 ms采集时间的结果。表4中的结果证明对于所有示例,吸收剂量均在5.5×10之间5 Gy和9.5×105 Gy。如上所述,这些值是已经发生辐射损伤的值。
应用程序 | 基本公式 | 密度(g cm−3) | 的剂量d日=5µm,t吨=100毫秒(×105 吉) | 的剂量d日=10µm,t吨=100毫秒(×105 吉) | 脂肪 | C类57H(H)104O(运行)6 | 0.94 | 6.6 | 8.9 | 骨骼 | O(运行)1702H(H)429P(P)372钙620N个34C类134 | 1.70 | 5.5 | 5.6 | 水 | H(H)2O(运行) | 1 | 8.4 | 9.4 | 蛋白质类 | C类94H(H)139N个24O(运行)31S公司 | 1.35 | 6.1 | 7 | | |
这些考虑表明低温大气在生命科学中应用的必要性。在低温条件下,辐射损伤大大减少,仅在吸收剂量在10范围内时才会发生8–109 Gy(施耐德,1998). 因此,低温大气可以更好地进行统计,因此必须进行定量分析。
4.结论
AnImaX终端是一种柔性X射线显微镜,可以在全视野和扫描模式下操作。由于我们在扫描模式下启用了每像素几毫秒的采集时间的实时绘图,因此可以实现剂量敏感样品的非常省时的绘图,这对于生物样品的研究非常有利。此外,能量色散检测器(四通道SDD)提供了额外的元素信息。
四通道SDD探测器的实现,特别适合我们的设置,是提供相关成像和研究生物样品中结构和功能信息之间联系的重要步骤。由于其高达1.1斯特拉德的大立体探测角,采集时间不到100毫秒已成为可能。借助定义明确的参考样品,可以指定不同采集时间的La、Cu和Fe的LOD。因此,我们可以确定LOD为1 ng mm−2La需要500ms、Cu需要20ms、Fe需要50ms的采集时间。这个例子表明,通过这种设置,结合高亮度光源,即使是具有非常低灵敏度荧光线的微量元素,例如M(M)-行,可以检测到。
AnImaX在生命科学中的生物医学应用潜力通过对冷激活小鼠与对照小鼠富含SPIO-脂蛋白的BAT的初步测量得到证明。我们能够以50毫秒的极短采集时间测量这些生物计量学中的微量元素,这在这个能量范围内是前所未有的。因此,AnImaX为各种研究领域开辟了可能性,如纳米颗粒毒性的研究、药物载体的开发或食品生产过程。
然而,即使这些短的测量时间也会造成辐射损伤。因此,AnImaX很快将配备一个冷冻层析成像站。低温环境可显著降低辐射损伤,旋转阶段将允许我们首先进行FF-XRM层析成像,然后进行实验,以建立STXM模式下的层析测量。低温环境促进的更长测量时间也将有助于进一步发展我们用于大立体角检测的定量方法。
为了进一步扩大AnImaX装置的研究领域,需要获得700 eV以下的能量范围。将测试不同的方法,如不同类型的聚焦ZP或OSA的另一个安装点。
资金筹措信息
我们感谢BMBF为AnImaX联合项目(批准号:05 K2016)和之前的联合项目(FlexIX–X射线柔性成像;批准号:05K2013)提供资金。我们还感谢AXO DRESDEN GmbH提供XRF校准样品。
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