2.1. 样品制备

离体伯明翰大学医院NHS基金会信托基金会（University Hospital Birmingham NHS Foundation Trust）对接受翻修手术的患者进行了手术，并将其与商业纯钛骨锚定听力植入物相结合，从患者身上获取了植入物周围发炎皮肤和/或皮下软组织的组织切片。伦理批准由英国国家研究伦理服务局提供（批准号15/NW/0079）。将组织块石蜡包埋，在3µm处切片，并安装在超纯熔融石英显微镜载玻片上（<10 p.p.b.Ti；Spectrosil 2000，Heraeus Quarzglas GmbH&Co.，德国哈瑙）。从动物[（12-16周龄）雄性C57BL/6 J小鼠（美国马萨诸塞州巴尔港Jackson Laboratories，Bar Harbour，ME）]中收集含有Ti的小鼠脾脏的类似制备切片（福尔马林固定石蜡包埋），并暴露于无菌腹腔炎症模型[巯基乙醇酸盐和TiO₂纳米颗粒（<50 nm）]。将含有4%巯基乙醇酸盐（Sigma，70157，Oakville，ON，Canada）的生理盐水和晚上10点悬浮TiO注入小鼠腹腔₂（Sigma，637253）纳米粒子，然后将小鼠放置8小时后再进行牺牲。阿尔伯塔大学健康科学动物福利委员会批准了动物研究。从小鼠中提取脾脏并立即固定在中性缓冲福尔马林中（10%；Sigma，HT501128，Oakville，ON，Canada），嵌入石蜡中，并将3µm切片安装在200 nm氮化硅膜上（NX5300D，Norcada，Edmonton，加拿大）。

2.2. XRF测量

XRF于离体金刚石光源（DLS）微焦点光束线I18（Mosselmans）的植入周围组织切片等。, 2009). 使用Si（111）双晶单色仪选择5.7 keV的入射单色X射线束，并通过KB反射镜系统聚焦至～3µm×3µm。使用每点100 ms的辐照时间，并使用两个四元件涡旋硅漂移探测器记录荧光信号，该探测器与样品呈45°角（与入射X射线呈90°角）。采用了一种动态采集方法，垂直和水平步长为3µm。使用校准的二极管和薄膜参考材料（AXO，Dresden，Germany）收集数据，用于通量测量并计算用于量化的几何参数。使用以下方法对数据进行批量定量拟合PyMCA公司（版本5.1.3；Solé等。, 2007)它使用基本参数算法，将数据作为质量分数（卢梭和波文，1998年; 汤姆森，2007).

在欧洲同步辐射设施（ESRF）（Salomé）X射线显微镜光束线ID21上对小鼠组织进行X射线荧光成像等。, 2013). 与DLS的测量类似，使用固定出口双Si（111）晶体单色仪产生5.1 keV的入射能量，并通过KB反射镜系统聚焦至～1µm×1µm。使用100ms辐照时间，荧光信号由XFLASH 5100硅漂移检测器检测。还以光栅模式实时采集测量值，垂直和水平步长为0.5µm。数据分析于PyMCA公司，以计数的形式定性输出数据。

3.1. 防束人工制品

从每种组织类型中选择一张地图，以突出显示光束传播人工制品的存在。图1(一)和2(一)分别显示了从ID21和I18获取的Ti XRF图，图1(b条)和2(b条)是相应地图中的部分，以强调这些文物的存在。

图1 (一)在ID21、ESRF（实验编号：L2713）记录的小鼠脾脏上的Ti XRF图谱。比例尺表示计数的数量。(b条)从插入的白框突出显示的区域拍摄的人工制品的展开图像。荧光强度以任意单位在线性尺度上表示。

图2 (一)Ti XRF贴图打开离体取自骨锚定植入物附近区域的人类软组织，记录于I18，DLS（实验编号：nt-16838）。彩色条表示质量分数。(b条)由插入的白框突出显示的区域中的人工制品的扩展图像。

这些人工制品是由邻近区域的光束激励引起的，在这两种情况下，水平方向上的人工制品都较大。当在一个孤立的特征上观察时，这些人工制品包含一个垂直和水平延伸的交叉状图案。当一组特征距离很近时，伪影尾部可能会合并在一起，从而在高强度粒子群周围发出升高的信号。在图1中的ID21数据内，人工制品不对称，左侧贡献较大；图3中的水平线扫描解释了这一点应注意，如果地图中的某些特征小于像素大小，这可能会带来更大的复杂性，因为数据是实时测量的。这可能会影响测量特征的大小，因为像素外围的亚像素大小的粒子可能会在多个像素中产生信号；然而，计算的浓度不会受到影响。为了纠正这一点，可以使用步进测量，但由于测量时间显著增加，这对于较大的地图是不切实际的。也可以使用更高分辨率的X射线束，但这取决于仪器，并且会牺牲被询问样品的面积。

图3 来自ID21的有线扫描。水平(一)和垂直(b条)线扫描（黑点）完成，拟合四个高斯轮廓（虚线），拟合的总和显示为一条蓝色实线。使用150 nm的步长，并在透射几何中测量强度。

3.2. 线扫描测量

在ID21处记录水平和垂直导线扫描，以计算束流大小。这些扫描如图3所示以多高斯拟合完成。

结果拟合被分割成代表x个和年用于XRF图的步长（0.5µm）和归一化通量通过积分高斯方程的总和计算每个截面的强度。图4以图形方式突出显示具有相应规范化贡献值的分段。

图4 水平和垂直分段线扫描的适合性（500 nm）。归一化贡献由拟合方程积分生成，并列出(一–我).

从图4中可以明显看出很大一部分入射光子出现在距离最大值2.5µm远的中心区域（红色）之外，导致外围区域的激发。在这种特殊情况下，为了提高空间分辨率，地图被过采样了两倍，这增加了标称像素外激发的样本量。

在存在高度集中的感兴趣异质元素的样品中，即使光束中心不在特征上，光束的尾部也可以激发这些区域。这种外围激励在信号中占主导地位，产生假阳性结果。因此，在高浓度颗粒周围区域，Ti的浓度似乎很低，但情况可能并非如此。这些人工制品的存在严重影响了XRF定性和定量成像的准确性。从定性的角度来看，人造物可能导致对特征大小的不准确测量，以及对所观察到的元素分布的不正确推理。它将显著影响将元素分布与潜在样本特征关联起来的任何尝试(例如组织的细胞组成），因为位置的不确定性，和/或与同时记录的其他元素的相关性。人工制品将导致覆盖率过高估计，影响平均浓度计算，而分布式光束剖面将导致不准确的单像素量化。应该注意的是，这些人工制品只会出现在具有特定特征的样本中。首先，样品必须均匀分布，否则伪影将均匀地出现在整个图像中，并使用参考材料进行数学计算（假设测量之间有足够的光束稳定性）。样品也必须具有较大的浓度分布；高浓度特征在处理时会生成人工制品，但由于地图中的低浓度特征会丢失，因此不能应用阈值来删除它们。无法应用简单的背景减法或最小阈值，因为地图中有许多区域包含的像素强度低于那些由人工制品造成的像素强度。最小阈值的效果如图S1所示辅助信息低浓度特征与高强度粒子同等重要，因此开发了两种不同的数学校正方法来消除观测到的人工制品。

3.3. 光束传递校正

光束传递校正是图像反褶积的一种形式，通常用于各种显微镜方法中，以消除图像伪影（斯威德洛等。, 1997; 兰泰里等。, 1994)但据我们所知，从未应用于XRF图像。记录的图像是存在的对象的组合，这些对象与测量设备固有的点扩散函数（PSF）相乘。许多图像反褶积方法需要预先存在的PSF知识来反转图像，以更有效地表示当前对象（Swedlow，2007; Shaw&Rawlins，1991年; Shaevitz&Fletcher，2007年). 在这种情况下，可以将光束轮廓视为PSF，理论上，通过准确了解光束传播贡献，可以将XRF图像反褶积为更准确的数据。由于每个SR-XRF光束轮廓都包含不同的X射线分布，并且根据测量目标变化很大，因此反褶积方法必须是通用的，才能广泛使用。现有的反褶积方法，如图片J图书馆可能有助于减少在XRF图像中观察到的人工制品（Sage等。, 2017). 然而，他们并不认为单个像素的量化是基于100%的通量存在。由于这不成立，一旦进行适当的纠正，就需要进行重要的重新规范化步骤；这将确保更准确的单像素量化。

校正背后的原理是使用光束轮廓（如线扫描所记录的那样）计算周围像素的准确贡献（归因于光束尾部），并相应地校正每个像素。由于金属丝扫描提供了穿过光束中心的水平和垂直剖面，因此对二维剖面进行了几何计算。图5将显示一个原理图，其中高亮显示了梁的轮廓。假设象限是用圆形轮廓计算的。这允许为每个垂直和水平对生成比例因子，例如，VU1和HR1的比例因子为一（0.532），VU2和HR2为b条（0.468），和均用于评估单个像素（HR1，VU1）（如图5所示). 由于像素与水平分量和垂直分量的距离相等，因此每个分量的贡献相等。然而，如果像素更接近垂直分量，则应用加权因子，以便从垂直测量中分配的贡献比水平测量和反之亦然。根据贡献器（垂直或水平）和每个象限像素之间的距离计算因子。

图5 象限中每个像素使用不同的比例因子。比例因数列于辅助信息.

根据水平和垂直导线扫描计算二维贡献后，应用迭代过程，从地图中的最小值到最大值进行校正。波束保护校正过程如图6所示需要注意的是，由于地图外的亮度值未知，因此地图周围的8像素边界未进行校正。因此，此区域是从最终图像中裁剪的。

图6 流程图详细说明了波束传递文件校正所涉及的过程。

图7显示了ID21处询问的小鼠组织的XRF图，经过波束校正迭代处理。很明显，人工制品大大减少，远离高浓度特征的低强度像素仍然存在。此外，考虑到分散纳米颗粒的初始暴露，颗粒的大小和分布现在更接近其预期值。图S2辅助信息显示了光束轮廓校正前后的地图的一小部分，其中包含显示了强度的粒子簇。

图7 XRF图的结果如图1所示进行波束保护校正后：(一)修正前和(b条)修正后。彩色条表示计数。

3.4. 自适应减法

波束传递校正方法依赖于具有高质量的二维波束剖面，而研究人员可能无法获得该剖面，因此开发了一种替代方法。产生了一种自适应减法方法，该方法能够仅使用图像数据进行校正；当光束轮廓未知时，这有助于进行回顾性分析和消除伪影。

此校正依赖于受周围像素值影响的减法。与波束保护校正方法类似，每个像素在地图内进行评估，并分配适当的基线校正。在校正期间，评估了包含最高像素值的水平和垂直剖面，该像素值覆盖了地图的整个宽度和长度。随后用三次样条函数拟合轮廓。由于基线的变化是不可预测的，如果不仔细研究每个拟合项，那么使用数学函数是不合适的。数据集中的多项式函数（例如这些函数）往往会在背景定位点之间发生不可预测的振荡，从而导致拟合不良。三次样条曲线为可变情景下的此类基线校正提供了一种稳健的方法峰值宽度，背景强度和过程的大变化，计算时间短（Yi等。, 2015). 带有三次样条背景函数的单个水平剖面示例如图8所示.

图8 具有三次样条背景功能的水平剖面。对数刻度用于Y（Y）轴以突出显示强度的细微变化。

从原始数据中减去背景函数。由于每个像素在水平和垂直方向上校正了两次，因此在校正后的地图中只使用原始数据减去背景的最小值。得到的校正图如图9所示。自适应阈值后图像伪影大大减少，低浓度像素（先前高亮显示）仍然存在。背景函数减法的前提是外围激励会使大强度特征周围的区域升高。因此，给定区域的函数强度取决于相邻值。与100p.p.m.粒子相邻的背景值与10000p.p.m粒子可能相差几个数量级，不能适当用于校正这两种强度。

图9 显示自适应减法的Ti-XRF图(一)修正前和(b条)修正后。彩色条表示质量分数，以对数刻度显示。

根据自适应阈值，当应用减法时，浓度低于原始值。被视为人工制品的像素显著减少；减法的大小取决于贡献Ti特征的浓度。空背景像素（远离任何特征或人工制品）减少了1–3%（主要由噪声造成），磨损颗粒周围的像素减少了<0.5%，磨损颗粒减少了<0.01%。校正后，平均浓度和覆盖率的准确性有所提高，这可以归因于人工制品的减少。最大浓度降低<0.01%；这种可忽略不计的变化在量化误差范围内。然而，没有进行后续的重新规范化，以说明只有一小部分通量位于中央像素内。尽管该方法显著改善了定性成像，但对于定量分析而言，束流文件归一化被认为更加准确。

这两种校正方法都有优点。光束轮廓校正方法应产生准确的定量结果；然而，校正的质量取决于波束保护测量。导线扫描生成的轮廓在其末端有一定的局限性，因为透射探测器通常比用于测量地图的荧光探测器灵敏度低。当用X射线束接近导线时，与传输离子室相关的噪声限制了光束边缘光子的检测。图3中曲线边缘的面积和4可能不为零，但传输检测器可能没有足够的灵敏度来检测细微变化。因此，这限制了基于测量光束轮廓灵敏度的校正。此外，轮廓是基于光束为圆形的假设生成的，因此使用适当敏感的相机对光束进行成像可以避免这种假设。用户通常无法获得足够高质量的光束轮廓；在这种情况下，自适应次牵引拟合方法提供了一种快速的方法，可以显著改善定性数据。因此，这是一个用于回顾性分析的有用工具。对于未来的SR-XRF显微镜，建议用户获得光束轮廓，以便进行准确的定量测量。

为了比较这两种方法，使用自适应亚牵引校正方法处理了在ID21获得的数据，其中可以进行导线扫描，结果如图10所示。原始图像中出现的人工制品显著减少，同时保持低浓度特征。每种校正方法的输出之间存在差异，这有几个原因。自适应减法中的高质量背景拟合对于生成适当的校正至关重要。与波束文件归一化相比，包含大量噪声和特征与背景之间的低统计分辨力的图像数据对自适应相减的影响更大。因此，自适应减法校正图9中的I18数据很好（背景和特征之间的四个数量级），而ID21数据也没有得到校正（因为背景和特征只有两个数量级的数据）。如前所述，波束传递校正包括一个重新规范化步骤，因此校正的幅度将比自适应减法更接近实际值。然而，波束传递校正依赖于X射线剖面的准确表示；与该测量相关联的误差也可以解释两种校正方法之间的一些差异。

图10 在ID21记录的Ti XRF图。(一)原始Ti XRF贴图。(b条)光束轮廓校正后。(c（c）)自适应减法之后。彩色条表示计数数量，以对数刻度显示。

这些校正方法通过解决完全均匀、二元、平方函数光束轮廓的假设，提高了定量XRF显微镜的精度。然而，这些系统中仍然存在其他复杂情况/假设，包括在校正荧光衰减时假设单一矩阵（Kanniesser，2003; Sitko&Zawisza，2012年). 重要的是要考虑降低量化精度的所有方面，而不仅仅是光束轮廓。减少衰减误差影响的一个基本方法是通过制作薄片来优化样品制备（Szczerbowska-Boruchowska，2012）). 这限制了因局部密度差异而在整个样品中观察到的荧光衰减范围（Bewer，2015).