Biophysical and structural study of La Crosse virus endonuclease inhibition for the development of new antiviral options

FERACCI, M.; Hernandez, S.; Garlatti, L.; Mondielli, C.; Vincentelli, R.; Canard, B.; Reguera, J.; Ferron, F.; Alvarez, K.

doi:10.1107/S205225252400304X

研究论文\（第5em段）

IUCrJ大学

第11卷| 第3部分| 2024年5月| 第374-383页

国际标准编号：2052-2525

https://doi.org/10.1107/S0252252400304X

生物学|医学

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La Crosse病毒核酸内切酶抑制的生物物理学和结构研究，以开发新的抗病毒药物

^一马赛Aix-Marseille大学，生物大分子建筑与功能（AFMB）–UMR7257 CNRS–案例932，163 Avenue de Luminy，13288 Marseille-CEDEX 09，France，^b条里尔大学；INSERM，UMR-S 1172，里尔神经科学和认知研究中心，59000里尔，法国，^cOmegaChem，Lévis，480 Rue Perreault，魁北克G6W 7V6，加拿大，^d日埃沃特（法国）SAS，居里校区，195 Route d’Espagne，31036 Toulouse，France，and^{e（电子）}欧洲病毒生物信息中心，Leutragraben 1，07743 Jena，Germany
^*通信电子邮件：karine.alvarez@univ-amu.fr

中国科学院刘志杰主编(收到日期：2023年12月13日； 2024年4月8日接受； 2024年4月24日在线)

大型布尼亚病毒目该序列包括多个病毒家族，它们有一个分段的双义RNA基因组和一个从合成病毒开始的细胞质生命周期mRNA。转录的启动是所有成员共同的，它依赖于负责cap摄取的内切酶活性。在La Crosse病毒（一种正布尼亚病毒）中，先前已经证明，吸帽核酸内切酶位于L蛋白的N末端结构域。正丁香病毒通过节肢动物传播，并在牛中引起疾病。然而，加利福尼亚脑炎病毒、拉克罗斯病毒和詹姆斯敦峡谷病毒是可导致人类脑炎的北美物种。没有疫苗或抗病毒药物。在本研究中，三种已知的流感病毒核酸内切酶抑制剂（DPBA、L-742001和baloxavir）被重新用于La Crosse病毒核酸内切酶。通过荧光共振评估其抑制作用能量传递然后通过差示扫描荧光法和微尺度热泳法评估它们的结合模式。最后，在L-742001和巴洛沙韦的配合物中获得了两种晶体结构，为抑制的结构决定因素提供了途径，并为进一步开发布尼亚病毒目核酸内切酶抑制剂。

关键词： 布尼亚病毒目;正布尼亚病毒;核酸内切酶抑制剂;拉克罗斯病毒;金属螯合剂.

PDB参考：拉克罗斯病毒L蛋白的N末端核酸内切酶结构域，与化合物L-742001，7oa4复合;与巴洛沙韦复合物，7plr

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1.简介

正布尼亚病毒属于包虫病毒科，一个家庭布尼亚病毒目藏有几种致命病原体的目。这些病毒形成一个血清学和遗传学相关的群体；它们是节肢动物传播的，其中一些已被证明会导致人类的神经侵袭性疾病，主要发生在儿童身上。拉克罗斯病毒（LACV）是儿童中最常见的神经侵袭性虫媒病毒感染（Boutzoukas等。, 2023 )在美国（瓦希等。, 2021 )并作为其他神经侵袭性原布尼亚病毒的研究模型，例如美国和加拿大的詹姆斯敦峡谷原布尼亚病毒（JCV）和雪鞋兔原布尼亚毒（SSHV）（Evans&Peterson，2021年 )Tahyna orthobunyavirus（TAHV），广泛分布于欧洲、非洲和亚洲；Inkoo orthobunyanvirus（INKV），发现于斯堪的纳维亚半岛（卢旺德）等。, 2017 ; 瓦帕拉蒂等。, 1996 ). 其他感染动物的正布尼亚病毒包括Schmallenberg病毒（SBV）和阿克巴恩病毒，严重影响反刍动物（Wernike&Beer，2017）; 亚纳斯等。, 2020 ). 新发现的Cristoli orthobunya病毒的报告以及Umbre orthobunya virus作为致命脑炎病原体的出现（罗德里格斯等。, 2020 ; 佩罗等。, 2021 )强调监测正布尼亚病毒对人类健康和活动影响的重要性和必要性。虽然已经开发出针对几种感染动物的正丁香病毒的疫苗，包括SBV（Wernike）等。, 2022 )，感染人类的人没有可用的疫苗或治疗方法。随着气候变化推动疾病传播的节肢动物进入新的领域（McDermott，2022）)很明显，除其他虫媒病毒外，正布尼亚病毒构成严重威胁，迫切需要在疫苗和抗病毒药物开发方面采取新的治疗策略。

布尼亚病毒目展示了一个独特的基因组结构，其特征是分段的双义负单链RNA基因组。病毒RNA（vRNA）片段与一种称为核糖核蛋白（RNP）复合物的特殊复制复合物密切相关。RNP复合体在保护和处理vRNA中起着关键作用。在结构上，RNP复合物由包裹vRNA的核蛋白聚合物组成，并与单个大（L）蛋白结合。L蛋白作为主要效应器，通过在其N末端包含核酸内切酶（Endonase，EndoN）活性和RNA-依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，展示了其多功能性。属于该目的病毒具有从病毒合成开始的细胞质生命周期信使RNA（vmRNA）。他们使用一种称为cap-snatching的特殊机制来启动vmRNA的转录，该过程由多功能L蛋白执行。在cap-satching过程中，RdRp使用由EndoN对宿主mRNA进行内切核裂解得到的短帽引物来启动vmRNA的合成。

确定的不同Endon的原子结构表明它们具有保守的PD…D/Ex个活性中心中的K催化基序和结合二价金属离子（Mn²⁺或镁²⁺)对于催化活性。因此，金属依赖性内切酶（Horst等。, 2019 ; 克雷平等。, 2010 )切割宿主信使核糖核酸的5′-端帽结构以产生病毒聚合酶的引物。反应遵循双金属离子催化机制（Morin等。, 2010 ; 斯泰兹和斯泰兹，1993年 ). 该结构域及其相当保守的区域所承载的关键功能使EndoN成为抗病毒药物开发的合适靶点（Saez-Ayala等。, 2018 , 2019 )以及通过金属离子锚定到活性部位的EndoN抑制剂可以有效地阻断酶活性并阻止病毒转录（DuBois等。, 2012 ; Ferron公司等。, 2012 ).

1979年出现了用金属相关抑制剂靶向金属酶的抗病毒药物的概念，并已被证明是药物设计的一个重要策略（Rogolino等。, 2012 ). baloxavir作为螯合性病毒内毒素抑制剂的研究进展（Jones等。, 2016 ; 诺西等。, 2018 )是治疗流感病毒（FLUV）感染的成功案例之一。Baloxavir marboxil于2018年在日本和美国被批准用于治疗FLUAV和FLUBV，并以Xofluza的名义商业化。第一类FLUV EndoN抑制剂（番茄红素等。, 1994 ; 黑斯廷斯等。, 1996 )是4-取代-2,4-二氧代丁酸，携带芳香支架和螯合二酮酸（DKA）基序，包括γ-烯醇化酮α-酮和羧酸部分，能够螯合二价金属离子（Mg²⁺或Mn²⁺). 在DKA系列中，2,4-二氧代-4-苯基丁酸（DPBA；苯基-DKA；番茄红素等。, 1994; 黑斯廷斯等。, 1996; 科瓦林斯基等。, 2012 ; 杜波依斯等。, 2012; 雷格拉等。, 2010 )已被广泛研究，L-742001（哌啶基-DKA；黑斯廷斯等。, 1996; 科瓦林斯基等。, 2012; 杜波依斯等。, 2012)已在动物模型和基于细胞的抗病毒试验中被确定为一种有效的抑制剂（黑斯廷斯等。, 1996). 金属螯合作用FLUV-EndoN活性位点中的DPBA和L-742001已被破译（科瓦林斯基等。, 2012; 杜波依斯等。, 2012; 雷格拉等。, 2010)，表明金属锚定的强度和负责诱导fit模式配体结合的活性位点的可塑性。相反，巴洛沙韦被描述为一种紧密结合抑制剂（Omoto等。, 2018 ; 托德等。, 2021 )部分解释了其抗流感的高效性（琼斯等。, 2016; 诺西等。, 2018).

DPBA、苯基-DKA类似物、L-742001和哌啶基-DKA相似物的效力延伸至淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV；Reguera等。, 2016 ; 萨伊兹·阿亚拉等。, 2018, 2019)、LACV（雷圭拉等。, 2016; 费尔南德斯·加西亚等。, 2020 )安第斯山脉正汉坦病毒（ANDV；Fernández-García等。, 2020)裂谷热病毒等。, 2020)，艾比湖病毒（EBIV）；匡等。, 2022 )和Toscana病毒（TOSV；Jones等。, 2019 ). 在以往的结构研究中，DPBA与LCMV EndoN（Saez-Ayala等。, 2018; PDB条目5升)，LACV EndoN（雷圭拉等。, 2010; PDB条目2xi7型)和TOSV EndoN（琼斯等。, 2019; PDB条目6个工作周5)L-742001与LCMV EndoN（Saez-Ayala）复合物等。, 2018; PDB条目5吨)显示了它们的诱导fit配体结合模式。如FLUV-EndoN所观察到的，堆叠不完善和缺乏极性相互作用是剩余柔韧性和次优效力的部分原因。尽管如此，一些化合物显示出了良好的抑制作用（Fernández-García等。, 2020)特别是我们设计的哌啶基-DKA类似物，用于增强LCMV EndoN活性位点表面（保守区域）假定已识别的亚基中的疏水相互作用（Mondielli，2018 ).

因为两者之间的同源性布尼亚病毒目和FLUV-EndoN结构域，以及苯-DKA和哌啶基-DKA在EndoN活性位点中的类似结合行为，我们决定将巴洛沙韦重新用于布尼亚病毒目EndoN（LACV），并与DPBA和L-742001进行比较，探索其潜力。通过了解它们的结合模式，我们旨在为设计靶向内皮素的更有效抑制剂提供结构关键信息布尼亚病毒目订单。

2.材料和方法

2.1. 蛋白质表达和纯化

用编码N末端183个残基的LACV EndoN（UniProt登录码A5HC98）cDNA在大肠杆菌添加34µ的Terrific Broth培养基中的pLysS菌株细胞M（M）氯霉素和50µM（M）用0.2m诱导后，卡那霉素在18°C下过夜M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖。细胞被裂解缓冲液（20 m）中冰上的超声波破坏M（M）Tris–HCl pH值7.6，150 mM（M）氯化钠，10米M（M）咪唑，2.5米M（M） β-巯基乙醇）。将可溶性部分的蛋白质装入5 ml镍树脂中，用10 m的裂解缓冲液洗涤五次M（M）咪唑和5次50 m的裂解缓冲液M（M）咪唑，用四体积400m的裂解缓冲液洗脱M（M）咪唑。用烟草蚀刻病毒蛋白酶在4°C的透析缓冲液（20 m）中隔夜切割洗脱蛋白的组氨酸标签M（M）Tris–HCl pH值7.6，50 mM（M）氯化钠，2.5米M（M） β-巯基乙醇）。在进行阴离子交换纯化步骤之前，进行第二次亲和层析步骤以去除未分离的蛋白质。将蛋白质加载到色谱柱上（Cytiva RESOURCE Q，6 ml），用20体积的透析缓冲液洗涤，并用NaCl至1的浓度梯度洗脱M（M）将洗脱的蛋白质浓缩并加载到Cytiva HiLoad 16/600 Superdex 75 pg柱上，柱高20 mM（M）HEPES pH 7.6，150 mM（M）氯化钠，2.5米M（M） β-巯基乙醇用于最后的纯化步骤。将蛋白质浓缩至5–15 mg ml⁻¹取决于其用途。

2.2. 化合物和基质的表征

2,4-二氧-4-苯基丁酸（DPBA）和(Z轴)-4-{1-苄基-4-[（4-氯苯基）甲基]-哌啶-4-基}-2-羟基-4-氧杂-2-烯酸（L-742001）由C.Mondielli博士合成（Mondielly，2018）). (R（右）)-12-((S公司)-7,8-二氟-6,11-二氢二苯并[b，e]噻吩-11-基）-7-羟基-3,4,12,12a-四氢-1H-[1,4]恶嗪[3,4-c]吡啶[2,1-f][1,2,4]三嗪-6,8-双酮（巴洛沙韦）购自MedChemTronica（瑞典）。19-mer RNA 5′-AUU UUU UU UUA AUA UUU C-3′包含5′荧光探针（6-FAM）和3′猝灭剂（BHQ1），购自Microsynth AG（瑞士）。

2.2.1、。体外核酸内切酶荧光共振能量传递（FRET）分析

安在体外用核酸内切酶法研究DPBA、L-742001和巴洛沙韦对LACV-EndoN的抑制作用。使用20µl样品在20 m内进行反应M（M）Tris pH值7.6，150 mM（M）氯化钠，0.01%吐温20，1 mM（M）DTT，补充1mM（M）新制备的氯化锰₂.浓度为50 n的19-mer RNAM（M）缓蚀剂的梯度浓度（0.004至100µM（M）)在25°C的反应缓冲液中预先培养。添加LACV EndoN（预先与1mM（M）氯化锰₂并在25°C下预培养5分钟），最终浓度为0.25µM（M）在25°C的PHERAstar FSX微孔板阅读器（德国BMG Labtech）中，使用465 nm的波长进行激发，520 nm的波长用于发射，随后进行RNA切割荧光。

2.2.2. 差示扫描荧光法（DSF）

在蛋白质浓度为5µM（M）在由20 m组成的缓冲器中M（M）Tris–HCl pH值7.6，150 mM（M）氯化钠，2.5米M（M） β-补充0.5 m的巯基乙醇M（M）新制备的氯化锰₂。化合物浓度固定为50µM（M）（5%二甲基亚砜）。在96 well薄壁PCR板中，向17µl缓冲液中添加1µl抑制剂，然后添加2µl蛋白质。最后，添加2µl荧光染料SYPRO Orange（Thermo Fisher，目录号4461146）（最终浓度的五倍）。使用相同的方案进行控制，不使用MnCl₂.熔化温度(吨_米)给出的值是三个独立实验的平均值和标准偏差。

2.2.3. 微尺度热泳（MST）

MST实验在Monolith NT.115仪器（NanoTemper Technologies）上进行。使用蛋白质标记试剂盒red NHS（NanoTemper Technologies），用红色荧光染料NT-647标记LACV EndoN蛋白。标记蛋白质的浓度保持不变（50或100 nM（M）)，而配体浓度是变化的。从100、50或5µ开始的系列稀释系列M（M）对于DPBA，L-742001和巴洛沙韦分别产生了16种不同的浓度。实验在10米范围内进行M（M）HEPES缓冲液pH 7.4，150 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT，0.05%(w个/v（v）)吐温20，补充0.5 mM（M）新制备的氯化锰₂最终样品含有5%DMSO以确保化合物的溶解性。将样品加载到标准处理的MST级玻璃毛细管（MO-K022，NanoTemper Technologies）中。培养5分钟后，用70%的LED功率和20%的红外激光功率测量MST。在没有MnCl的情况下，按照相同的方案进行控制₂.K（K）_d日使用纳米回火测定值MO.亲和力分析软件版本2.2.4和是三个独立实验的平均值和标准偏差。

2.3. 结晶、数据收集和结构测定

2.3.1. 结晶

所有晶体均按照之前描述的方案（Reguera）在24孔Linbro板中生长等。, 2010). L-742001–LACV EndoN和baloxavir–LACV-EndoN复合物的数据集是在补充了5 m的储层缓冲液中浸泡自然晶体48 h后获得的M（M）氯化锰₂和1米M（M）L-742001或巴洛沙韦（5%二甲基亚砜）。晶体在补充了5 m的储层缓冲液中的液氮中闪蒸冷却M（M）氯化锰₂，1米M（M）L-742001或巴洛沙韦（5%二甲基亚砜）和30%甘油。

2.3.2. 数据收集和结构确定

LACV EndoN与L-742001或baloxavir复合体的数据集是在法国基夫-苏尔-伊维特SOLEIL同步加速器的PROXIMA-1和PROXIMA-2光束线上收集的。从图像处理到模型的所有数据集精细化，使用中央对手方清算所4套房（Agire等。, 2023 ). 使用夏2/刻度盘包装（Beilsten Edmands等。, 2020 ; 2010年冬季 ; 冬季等。, 2018 ). LACV EndoN与L-742001复合物的相使用相位器（麦考伊等。, 2007 )使用PDB条目2xi7型作为模型。结构处理和精炼使用执行库特和REFMAC公司分别为5（埃姆斯利等。, 2010 ; 穆尔舒多夫等。, 2011 ). 在每条链的活性部位观察到两个额外的密度，对应于锰离子。添加这些和之后精细化，形状良好的额外密度证实了L-742001存在于四种蛋白质分子的活性部位。添加这四个分子后库特,精炼已执行。按照相同的工作流程，使用之前求解的结构获得了LACV EndoN与baloxavir复合物的结构。在四个分子的活性位点中观察到两个锰离子的额外密度非对称单元，在添加这些和之后精炼巴洛沙韦有四个额外的密度，但只建造了三个。最后一个密度（不太确定）显示出可能的低入住率，从Tyr49到Phe55的路段有两个备选位置。数据收集和细化统计如表1所示。结构分析使用PyMOL公司（版本2.5.5；薛定谔）和LigPlot（照明绘图）（华莱士等。, 1995 ; Laskowski和Swindels，2011年 ).

表1
数据收集和细化统计与离子和L-742001或巴洛沙韦络合的LACV EndoN结构域

括号中的值用于外壳。

	LACV EndoN与L-742001复合	LACV EndoN与巴洛沙韦复合
PDB代码	7个月	7倍
衍射光源	SOLEIL前置器-2	SOLEIL前置器-1
波长（Ω）	0.97563	0.97856
分辨率范围（Ω）	108.071–2.900 (2.975–2.900)	108.026–2.640 (2.709–2.640)
“空间”组	P（P）6₁22	P（P）6₁22
一,b条,c(Å)	124.79, 124.79, 295.74	124.74, 124.74, 295.25
α,β,γ(°)	90, 90, 120	90, 90, 120
不对称单元中的分子	4	4
反射总数	1231383 (126223)	1625854 (154013)
独特反射次数	31157 (3027)	40799 (3985)
完整性（%）	99.94（99.80）	99.95 (100.00)
多重性	27.8 (27.09)	39.8 (39.10)
〈我/σ(我)〉	13.2 (2.2)	20.1 (2.2)
总体B类Wilson图中的因子（λ²)	52.78	52.83
R（右）_下午。	0.022（0.089）	0.025（0.190）
科科斯群岛_1/2	0.999 (0.980)	0.999（0.912）
反射次数，工作集	31073 (2145)	38758 (2821)
反射次数，测试集	1542 (116)	2041 (145)
最终R（右）_晶体	0.197 (0.295)	0.214 (0.312)
最终R（右）_自由的	0.239 (0.351)	0.254 (0.337)
非H原子数量
总计	6386	6391
蛋白质	6142	6198
配体	142	130
水	102	63
R.m.s.偏差
粘结长度（Ω）	0.013	0.013
角度（°）	1.63	1.62
平均B类因子（λ²)
总体	56.56	59.52
蛋白质	56.63	59.24
配体	64.12	76.97
溶剂	41.96	51.73
拉马钱德兰阴谋
最受欢迎（%）	96.29	97.80
允许（%）	3.43	2.06

3.结果和讨论

3.1. DPBA、L-742001和巴洛沙韦对LACV EndoN抑制作用的评价

DPBA、L-742001和巴洛沙韦是三种已知的FLUV EndoN活性抑制剂，位于聚合酶酸性（PA）亚基（PA-N）的N末端_特; 科瓦林斯基等。, 2012; 歌曲等。, 2016 ; 大本等。, 2018). 自2018年以来，巴洛沙韦一直是FDA批准的用于治疗无并发症流感的药物，其前药形式为巴洛沙维-马博西（O'Hanlon&Shaw，2019）). 这些抑制剂的金属离子螯合基序允许它们与PA-N结合_特活动站点。已在LACV、LCMV、TOSV和EBIV EndoN（Reguera）中记录了DPBA和L-742001通过其DKA部分的相互作用等。, 2010; 萨伊兹·阿亚拉等。, 2018; 琼斯等。, 2019; 况等。, 2022).

3.1.1. DPBA、L-742001和巴洛沙韦在在体外LACV核酸内切酶活性测定

在核酸内切酶FRET测定中测试了三种配体对LACV EndoN的抑制效力，结果总结在表2中在添加0.25µM（M）LACV内吞。在FRET抑制试验中，催化复合物的三个伙伴（蛋白质、离子和底物RNA）的引入顺序是决定性的。该反应是通过将预先与离子孵育的蛋白质添加到含有底物RNA、离子和配体的混合物中来触发的。考虑到底物RNA、游离离子和配体之间的竞争，该试验的设计可能会限制对巴洛沙韦与酶结合效率的完整评估。如FLUV所述，巴洛沙韦是一种具有缓慢解离的紧密结合抑制剂，通过阻止RNA底物（Omoto等。, 2018; 托德等。, 2021). 在当前的生化分析中，RNA底物和配体之间的相互作用对金属相关配体的结合是不利的。然而，DPBA、L-742001和巴洛沙韦表现出显著的亚微摩尔抑制效果，表明IC₅₀值为0.99、0.65和0.34µM（M）分别是。有趣的是，其抑制程度相当，L-742001和巴洛沙韦的效率分别是DPBA的1.5倍和3倍。抑制值的这种出乎意料的一致性突显了这些化合物在面临挑战的生化环境时的显著效力。

表2
DPBA、L-742001和baloxavir对抗LACV EndoN的生化和生物物理决定因素

	抑制	稳定性	密切关系
化合物	集成电路₅₀(µM（M）)	Δ吨_米（摄氏度）	K（K）_d日(µM（M）)
DPBA公司	0.99 ± 0.06	+6.98 ± 0.25	1.35 ± 0.25
L-742001型	0.65 ± 0.03	+11.23 ± 0.15	0.614±0.098
巴洛沙韦	0.34 ± 0.02	+12.72 ± 0.18	0.019 ± 0.006

3.1.2. 用DSF评估热稳定性

DSF用于通过测量热稳定性（热熔化转变吨_米)由荧光染料（SYPRO Orange）在变性。任何辅因子的添加(即金属离子）或与蛋白质相互作用的化合物导致其修饰吨_米DSF用于评估DPBA、L-742001和巴洛沙韦与LACV EndoN的相互作用；结果如图1所示表2中总结了。如果没有离子，LACV EndoN具有吨_米49°C。增加0.5m后M（M）氯化锰₂，其吨_米增加约7°C，显示出金属离子的强大稳定作用。在添加DPBA、L-742001和巴洛沙韦后，由于配体结合，观察到额外的热熔解转变分别增加了～7、～11和～13°C。在没有金属离子的情况下，在存在配体的情况下没有观察到蛋白质的稳定，这突出表明了与LACV EndoN之间没有相互作用。正如Reguera及其同事在LACV EndoN–DPBA复合物的晶体结构中观察到的那样，DPBA的结合只能通过DKA基序（Reguera等。, 2010). 通过Mn1和Mn2离子的这种相互作用足以产生一个有效的蛋白质稳定基序（Reguera等。, 2010). 与DPBA相比，在L-742001（+4°C）或baloxavir（+6°C。我们假设，与DPBA不同，DPBA太小，无法与LACV EndoN活性位点的氨基酸建立接触，L-742001和baloxavir为建立接触提供了更有利的结构特征。L-742001两翼的灵活性和baloxavir的紧凑性，尽管其大小不同，可能是它们在相当平坦的LACV EndoN活性位点结合的重要因素。

图1
(一)DSF实验表明，在锰存在或不存在的情况下，不同配体对LACV EndoN的稳定作用。这些值报告为Δ吨_米以含锰的LACV EndoN为基线(吨_米≃56°C）。(c)所研究配体的结构。

3.1.3. 用MST评估结合亲和力

MST利用蛋白质在配体存在下的热泳运动来确定结合亲和力。MST被用作正交法来评估离解常数(K（K）_d日)用于LACV EndoN的DPBA、L-742001和baloxavir；结果如图2所示并总结在表2中LACV EndoN对这三种配体具有很高的亲和力。对于DPBAK（K）_d日值为1.35µM（M）测量结果与FLUV PA-N报告的范围相似_特（4.5微米M（M）; 杜波依斯等。, 2012)和LCMV EndoN（5.4µM（M）; 萨伊兹·阿亚拉等。, 2018, 2019). L-742001和巴洛沙韦的亲和力提高了两倍和68倍(K（K）_d日0.6和0.019µM（M））。正如预期的那样，在没有金属离子的情况下，结合完全丧失，这再次表明它是由金属离子介导的螯合作用。令人惊讶的是，与热稳定性数据相比，虽然DPBA和baloxavir之间的亲和力差异非常显著（68倍），但DPBA和L-742001之间的亲和力差异要小得多（两倍），这表明baloxavir的结合模式更加稳健。无论如何，我们已经在这里表明，配体结合主要通过金属离子捕获效率介导在活性位点，从而驱动化合物的调节（表2).

图2
离解常数的测定(K（K）_d日)含DPBA的LACV EndoN(一)，L-742001(b条)和巴洛沙韦(c).K（K）_d日在存在或不存在锰的情况下测量配体²⁺离子(n个= 3).

3.2. LACV EndoN复合物结构

为了解释L-742001和巴洛沙韦结合和抑制LACV EndoN的结构基础，我们使用Reguera描述的结晶条件进行了浸泡实验等。(2010). LACV EndoN的结构很少，无论是载脂蛋白还是与配体的复合物。Reguera获得的等。(2010)与锰离子和DPBA的络合物突出了DKA金属螯合剂通过酮-烯醇和羧酸部分的结合模式。

3.2.1. L-742001–LACV EndoN复合物

抑制剂浸泡步骤中使用的LACV EndoN晶体在5 m的存在下生长M（M）氯化锰₂将天然晶体浸泡在由5m组成的溶液中M（M）氯化锰₂和1米M（M）L-742001使用5%二甲基亚砜（最终浓度）48小时。收集的数据集以2.9º的分辨率进行处理空间组 P（P）6₁22，结构被改进为R（右）因素和R（右）_自由的分别为0.20和0.24，平均值为B类56º的因数²[图3(一)]. 两个锰离子Mn1和Mn2显示完全占据，平均B类43和49Å的因子²分别存在于非对称单元。Mn1由His34、Asp79和Asp92的侧链和Tyr93主链的羧基配位，而Mn2由Asp52和Asp79的侧链以及两个结构水分子配位。L-742001的DKA部分完成了两个锰离子的八面体配位[图3(c)].

图3
(一,b条,c)晶体结构LACV EndoN与L-742001复合物。(一)静电的表示表面电位LACV EndoN；这种化合物被表示为棍子。锰²⁺离子表示为紫色球体。(b条)安F类_o（o）−F类_c配体对应的OMIT图（1.5σ). (c)催化位点的扩大显示了配体对水、离子和催化残基的配位。(d日)H1N1流感病毒PA-N催化位点的扩大_特与L-742001复合（PDB条目4瓦克和5立方厘米).

L-742001结构可分解为三个部分：上述DKA金属相关部分，机翼由第页-氯苄基和由哌啶基组成的第二翼N个-被苄基取代。这个第页-氯苄基通过电位叠加被锁定在DKA和His34和Met31侧链之间。DKA和第页-配体的氯苄基在四个分子的活性部位采用相同的构象。

这个F类_o（o）−F类_c所有四种分子的苄基-哌啶基翅膀的图谱都很模糊[图3(b条)]这是因为苄基环可能会旋转，而苄基环不会与活性中心的残留物直接接触，并且主要暴露于溶剂中。没有蛋白质残基干扰苄基围绕C-N键轴的旋转[图3(c)].

与L-742001–H1N1流感病毒PA-N相比_特复合物[图3(d日)]正如预期的那样，DKA基序的位置与两种病毒之间完全保守的离子分布系统类似。另一方面，FLUAV PA-N的活性位点_特它的体积较小，受约束程度更高，似乎可以在至少两个位置容纳该建筑群。其中一个与LACV EndoN中的非常相似，由第页-His41和Ile38之间的氯苄基，另一个由苄基部分与柔性Tyr24的堆叠介导，而柔性Tyl24在LACV EndoN活性位点中不存在。

这些结果表明，尽管LACV EndoN和FLUAV PA-N的结构相同_特，不可能基于FLUAV模型进行直接优化，而LACV EndoN获得的复合物为高效药物设计提供了更可靠的数据。

3.2.2. Baloxavir–LACV EndoN复合物

LACV EndoN–baloxavir复合物的晶体是在5 m的存在下，按照与L-742001复合物相同的程序获得的M（M）氯化锰₂晶体衍射至2.2º分辨率，并在2.64º分辨率下进行处理空间组 P（P）6₁22，在非对称单元。然后将结构细化为R（右）因素和R（右）_自由的分别为0.21和0.25，平均值为B类系数59º²[图4(一)]. 首字母精炼在分子置换步骤后发现四个F类_o（o）−F类_c每个分子活性部位的额外密度。如预期，两个双核Mn²⁺中心和巴洛沙韦表现出明显的电子密度[图4(b条)]. 巴洛沙韦结构可分解为两个连接的三环支架、一个包含羟基吡啶三嗪二酮基序的金属相关支架和一个包含二苯并噻吩部分的特异性支架。Mn1存在于所有四个分子的活性部位，并由His34、Asp79和Asp92的侧链和Tyr93主链的羧基协调。其强大的协调性体现在平均水平B类系数52º²而第二种锰Mn2的平均值为B类系数80Ω².放置了三个巴洛沙韦分子（链A类,C类和D类). 这个F类_o（o）−F类_c链密度B类质量较低，无法正确定位巴洛沙韦。这是由含有催化Asp52残基的Tyr49–Phe55环的双重构象和B类Mn2系数。一种构象允许Asp52的侧链与锰离子Mn2配位，另一种构像以开放形式将其从活性中心移开。这个螯合作用正如L-742001螯合DKA基序所观察到的那样，巴洛沙韦通过结合Mn1和Mn2的羟基吡啶三嗪二酮基序的三个共面O原子发生；每个金属离子与蛋白质催化残留物和水合壳表现出八面体配位[图4(c)]. 这个螯合作用配体的特异性基序在三个分子的活性位点上采用相同的构象。二苯并噻吩部分采用V形，并沿Met31侧链接触，H1N1 FLUAV PA-N中的Ile38_特[图4(d日)].

图4
(一,b条,c)晶体结构LACV EndoN与巴洛沙韦复合物。(一)静电的表示表面电位LACV EndoN；该化合物表示为棒状物。锰²⁺离子表示为紫色球体。(b条)安F类_o（o）−F类_c配体对应的OMIT图（1.5σ). (c)催化位点的扩大显示了配体对水、离子和催化残基的配位。(d日)H1N1流感病毒PA-N催化位点的扩大_特与巴洛沙韦复合（PDB进入第6页，共6页).

这个螯合作用和特异性基序在这两种蛋白质中的位置相似，尽管没有螺旋的N末端α2在LACV EndoN活性位点携带Tyr24，负责将巴洛沙韦锁定到H1N1流感病毒PA-N中_特活动站点。

3.2.3. Drug设计策略

本研究证明，金属螯合剂L-742001和巴洛沙韦对低于微摩尔范围的LACV EndoN活性具有抑制作用。这一结果得到了生物物理数据和两种晶体结构的支持。我们可以假设配体在LACV EndoN的活性位点与RNA底物竞争并通过金属结合螯合作用以及特定的氨基酸相互作用。设计开放腔抑制剂的挑战，例如布尼亚病毒目EndoN存在于这样一个事实，即只有一个非常小的锚定点来确保抑制剂正确地呈现给其靶点。在开口袋中使用螯合剂应更多地考虑其亲和力（锚定性能），而不是螯合方面（如果螯合剂太强，离子就会耗尽，失去作用）。除了螯合/锚定基序外，合理扩展分子以实现对常见的EndoN结构特征的特异性，例如保守的氨基末端α-应考虑螺旋线。由于布尼亚病毒目EndoN活性位点负责配体填充模式，我们建议设计体积优化的抑制剂，由于构象的增加，该抑制剂应具有更有利的结合自由能熵绑定后。

由于结构和LigPlot（照明绘图）分析表明，图5中提出了一些关键的优化改善LACV EndoN配体结合的有效药物设计策略是进一步渗透到已确定的小口袋中，形成有利的疏水相互作用。L-742001类似物的设计[图5(一)和5(c)]，面朝His75的苄基环应替换为小的烷基在中R（右）₂加固位置π-堆叠交互，并且应该在R（右）₁延伸与Ile76和Leu112相互作用的位置，形成一个小的疏水性空腔。仍有空间扩展第页-带有乙烯基链的氯苄基臂，用于靶向Met31，引入小分子烷基在中R（右）_三面对His34并在R（右）₄增加与Leu30和Arg33的相互作用。寻找更多隐藏的相互作用将是有效的，尤其是朝口袋内部折叠以瞄准Leu30和Arg33。

图5
LigPlot（照明绘图）并提出了配体L-742001和巴洛沙韦的结构修饰。(一)和(b条)显示Lig图分别与L-742001和巴洛沙韦形成复合物的LACV-EndoN的表示。(c)和(d日)分别代表L-742001和巴洛沙韦的拟议修改。

巴洛沙韦类似物的设计[图5(b条)和5(d日)]，我们推测修改苄基噻吩侧的位置R（右）₁,R（右）₂和R（右）_三是一个合理的策略。这个R（右）₁面对His34的位置应替换为small烷基加强π-叠加相互作用R（右）₂position提供了引入较大基团和芳香环的可能性，以靶向与Leu30和Arg33的相互作用R（右）_三对于与Leu30和Val27的掩埋相互作用，仍有更多的扩展空间。

4.结论

我们报道了LACV EndoN与两个二价金属离子（Mn）配合物的两种晶体结构²⁺)和L-742001或巴洛沙韦配体。这些结构以及生物物理和生物化学数据提供了有力证据，证明这两种配体在LACV EndoN活性位点与RNA底物竞争并结合通过金属螯合作用以及特定的氨基酸相互作用。基于这些结果，以及布尼亚病毒目EndoN活性位点负责配体填充模式，我们建议设计笨重的优化抑制剂。尽管存在开放活性位点的挑战，但本研究证明了通过螯合基序锚定分子的可能性，以及配体结合结构的知识对指导设计优化的抗肿瘤抑制剂的重要性布尼亚病毒属内切酶结构域。

支持信息

3D视图

PDB参考：拉克罗斯病毒L蛋白的N末端核酸内切酶结构域，与化合物L-742001，7oa4复合;与巴洛沙韦复合物，7plr

致谢

作者感谢索莱尔公司提供同步电子辐射设施，并感谢PROXIMA-1和PROXIMA-2光束线的工作人员在使用光束线方面提供的帮助。

资金筹措信息

已确认下列资金：代芬斯创新局（批准号ASTR-0010-01）；国家税务局（grant PaNuVi）；Recherche Médicale基金会（批准号：DCM20181039531）；梅迪特雷埃感染基金会（grant Infectiopole Sud）；法国综合结构生物学基础设施项目（批准号：ANR-10-INBS-0005）；国家教育部，国家教育局。

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IUCrJ大学

第11卷| 第3部分| 2024年5月| 第374-383页

国际标准编号：2052-2525

https://doi.org/10.107/S205225252400304X

生物学|医学

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