2.1. 样品制备

本种的口足类螳螂虾从新加坡和斯德哥尔摩的水族馆供应商处收购。从新加坡获得的动物以与我们之前工作相同的方式用人工海水保存在水族馆中（Chua等。, 2023; 阿米尼等。, 2019). 从活的动物身上，在脱毛时收集到三个成熟的俱乐部（俱乐部1、俱乐部2和俱乐部6），另一个俱乐部在脱毛一周后收集到（俱乐部7）。从斯德哥尔摩水族馆供应商处获得的动物在抵达奥胡斯时被处死，用50%的乙醇保存一天，然后用70%的乙醇保存，随后从乙醇保存的标本中分离出它们的右棒（棒3-5）。

在同步辐射实验中，球杆首先嵌入环氧树脂中（EpoFix，Struers，Ballerup，丹麦），然后用低速锯使用金刚石切割轮（accutom-5，M1D15，Strueers，Balleup，丹麦）切割轴向截面。然后用SiC砂纸（Struers，Ballerup，Denmark）将切片抛光至100µm以下的厚度。

2.2. 实验室计算机断层扫描

使用奥胡斯X射线成像联盟（AXIA）基础设施（Wittig）进行实验室µCT等。, 2022). 在安装在塑料样品架上的ScancoµCT35（Scanco Medical，Brüttisellen，Switzerland）装置中对俱乐部1和俱乐部2进行扫描。使用55 kVp的能量、3.5µm的各向同性体素大小和2.4 s的积分时间对俱乐部进行扫描。

在Xradia 620 Versa（Zeiss，Oberkochen，德国）中对三只完整的动物进行了全面扫描。最小的动物（动物3，表1)安装在猎鹰管中，两只较大的动物（4只和5只）安装在定制的玻璃圆柱体中。将所有动物悬浮在70%乙醇和乙醇化琼脂凝胶立方体的混合物中进行稳定（Walsh等。, 2021). 较小的动物（动物3）以80 kVp的各向同性体素大小22µm进行扫描，较大的动物以140 kVp、42µm的各向异性体素大小进行扫描；对所有动物进行扫描，每帧曝光1s。对整个动物的扫描在空间分辨率和灰度分辨率上都有限制，因为外骨骼和球杆都需要可见，而口足类动物需要适应装有它们的罐子内的视野。因此，为了更好地解析球杆的特征，在提取后重新扫描正确的球杆。提取动物的右球杆（球杆3-5）并将其嵌入EpoFix（Struers，Ballerup，Denmark）中，然后用4.5µm的各向同性体素大小、80 kVp的能量和2.5至35 s的曝光时间进行扫描，具体取决于嵌入球杆的大小。

2.3. 同步辐射X射线实验

在德国电子同步加速器（DESY，汉堡，德国）PETRA-III的硬X射线微/纳米探针P06束线上进行了XRF和XRD实验，在MAXIV（MAXIV，隆德，瑞典）的DanMAX束线上也进行了XRD实验。

杆6和杆7的截面安装在两层Ultralene箔之间，并使用聚焦到500×380 nm（H×V）、能量为16.5 keV的铅笔束在P06处扫描样品。样品通过连续扫描进行扫描，步长为10×10µm，曝光10ms用于概览扫描，步长为500×500 nm，曝光100ms用于高分辨率扫描。XRD数据是使用EigerX 4M探测器（Dectris，Baden-Daettwil，Switzerland）收集的，样品到探测器的距离为141.1 mm，XRF数据是使用MAIA 384C探测器（Ryan等。, 2010). 没有从XRD数据中减去背景。

将俱乐部3–5的切片安装在Kapton胶带上，并在DanMAX上用聚焦到20×10µm（H×V）的铅笔束进行扫描，能量为35 keV，步长为10×10μm，每点曝光249 ms。使用Pilatus3X 2MCdTe探测器（瑞士巴登戴特维尔Dectris）收集XRD数据，样品到探测器的距离为518 mm(参见下文)然后在真空炉（美国加利福尼亚州里士满市MTI公司）中在373 K温度下进行2.5小时的热处理，以模拟干燥，并以每点44 ms的暴露时间重新扫描。使用1s的曝光时间测量Kapton背景信号，然后缩放并从所有衍射图中减去。

2.4. 数据处理

使用马特拉亚算法（Jensen等。, 2022)在MAX IV的多个波束线上实现，包括NanoMAX（Bjorling等。, 2021)和DanMAX（Jensen等。, 2022). 这就产生了可用于相组成分析的一维衍射图案。P06数据也被整合到方位分辨衍射数据（360方位角箱）中，用于方位分析。使用角高斯拟合（AGUF）方法（Jensen）分析矿物微晶和甲壳素的取向等。, 2022)它与先前用于小角度X射线散射（SAXS）数据（Törnquist）的方法不同，适合布拉格峰的方位强度分布等。2020年; 班格尔等。, 2010; 林纳塔勒等。, 1999; 弗拉兹尔等。, 1996). 对方解石（104）和（110）峰以及甲壳素（013）峰进行AGUF分析。为了进行相位识别，根据文献数据（Maslen等。, 1995)使用水银（麦克雷等。2020年). 为了从方位积分（1D）衍射图中确定相位的空间分布，Ap（002）峰；甲壳素（110）和（013）峰；使用了方解石（104）、（110）和（202）峰。XRF数据使用地理像素软件（Ryan等。, 2010, 1990)以获得俱乐部6和7的Ca含量图。使用以下工具可视化实验室µCT数据蜻蜓（ORS，加拿大蒙特利尔），适用于俱乐部1、2和3-5。

XRD数据是在光栅扫描模式下收集的。这使得可以对扫描的两个区域进行位置分辨方向分析。这是使用AGUF方法在逐峰基础上进行的（Jensen等。, 2022)这符合方位强度分布。我们注意到，一种不同的方向分析技术，也基于方位角散射角，以前曾被用于口足类动物的尾甲（Zhang等。, 2016); 该方法以全三维可视化，这对于扫描本研究中使用的尺寸是不可能的。对于方解石，用于定向测定的峰是（104）和（110）峰，它们共同覆盖了所有方向的微晶[图2(c（c）)]. 对于甲壳素，（013）峰用于定向分析，而（110）峰仅用于甲壳素的空间定位，因为它没有可见的平面内纹理[图2(c（c）)].

图2 动物3-5和俱乐部3-5的实验室µCT。(一)–(c（c）)完整动物的渲染。(d日)–(（f）)从中的数据对动物头部进行数字放大(一)–(c（c）). (克)–(我)从高分辨率测量中获得的3–5根棍棒的效果图，这些棍棒是从面板中的动物身上提取出来的(一)–(c（c）). (j个)–(k个)虚拟切分俱乐部3-5。动物的长度是(一), (d日), (克), (j个)11厘米；(b条), (e（电子）), (小时), (k个)13厘米；和(c（c）), (（f）), (我), (我)16厘米长。颜色渐变条显示了材料密度。

3.1. 实验室-µCT实验

用实验室µCT绘制的杆1和2的冲击区域表面表明，两个杆都因磨损而变得粗糙[图1(一)和1(b条)]. 有趣的是，穿过球杆中心的虚拟轴向横截面显示出两个球杆之间显著的形态差异[图1(c（c）)和1(d日)]. 在俱乐部1中，结构与之前研究中预期的结构相似（韦弗等。, 2012)具有流线型均匀的形态。相反，我们有时会观察到更大的形态重组。例如，这是在球杆2的侧面观察到的，那里存在X射线吸收率与撞击区域相似的大型结构，这表明局部矿化程度要高得多，周围是低X射线吸收率的区域，可能是没有材料的区域。俱乐部1和俱乐部2的虚拟3D渲染（从后面有一个切口）表明，该结构（如果存在）延伸至整个俱乐部，并遵循俱乐部曲率[图1(e（电子）)和1(（f）)]. 即使不存在这种形态偏差，杆侧的周期和条纹区域的密度也与冲击区域附近的周期区域的密度不同[图1(c（c）)和1(e（电子）)]. 尽管2号俱乐部显然进行了大规模重组，但3-5号俱乐部没有进行此类重组，如图2所示。

对动物全身3-5的实验室µCT研究如图2所示(一)–2(（f）)这清楚地说明了趾杆是口足类角质层中密度最大的物质。对提取的和环氧树脂嵌入的球棒进行了高分辨率实验室µCT研究[图2(克)–2(我)]. 从整个俱乐部的效果图中可以清楚地看到，撞击面和部分撞击区域（Chua等。, 2023; 黄等。2020年)由于使用引起的磨损，所有球杆都部分磨损[图2(克)–2(我)]. 很像俱乐部1[图1(c（c）)]，穿过这些杆的所有切片显示，杆侧的密度高于靠近冲击区域的周期区域[图2(j个)–2(我)]. 用4.5µm体素尺寸对手指杆进行实验室µCT扫描。令人惊讶的是，即使在这种分辨率下，通过球棒的虚拟切片也没有发现任何样品中存在类似方解石带的形态[图2(j个)–2(我)]. 因此，在俱乐部2中观察到的大规模重组似乎并不常见，因为在5µm以下分辨率扫描的五家俱乐部中，只有一家俱乐部显示了这一点。

3.2. 同步辐射XRD/XRF实验

获取俱乐部2侧面观察到的大重组区域的详细结构信息（图1)采用同步加速器亚微米扫描XRF/XRD（图3). 球杆侧面条纹和周期性区域中改变的微观结构的XRF图具有比冲击区域更高的Ca含量[图3(一)]. 相对于冲击区域，形态改变区域中较高的Ca含量表明，改性侧区域必须局部高度矿化。我们注意到，撞击研究表明，撞击区域是最强的生物材料之一（Stegbauer等。, 2021; 马库斯等。, 2017; 阿米尼等。, 2015; 织布工等。, 2012). 以更高分辨率扫描球杆侧面结构的区域表明，球杆侧面的钙含量在空间上高度不均匀，高浓度钙区域的条带散布在几乎没有钙的区域中[图2(b条)]. 这与使用俱乐部2上的断层扫描观察结果一致（图1)。

图3 俱乐部6切片的2D扫描XRD/XRF。(一)Ca概述K（K）XRF图（比例尺1 mm，颜色梯度条显示Ca含量）。以较高的面内分辨率扫描的区域1（左）和区域2（右）标有白色方框。(b条)高分辨率钙K（K）区域1的XRF图（比例尺20µm）。(c（c）)区域1（蓝色）的平均衍射图，以及方解石（黑色）的模型衍射图。插图显示甲壳素衍射峰。峰值以(香港特别行政区)用于进一步分析方解石[反射（104）、（110）和（202）]和甲壳素[反射（110）、（013）]的方向和空间分布。

俱乐部6区域1高分辨率地图的平均衍射图[图3(b条)]方解石的信号与甲壳素的信号相匹配[图3(c（c）)]. 这表明，改性侧区含有方解石微晶和相对弱散射的甲壳素。没有观察到其他晶相，也没有在靠近撞击区域的周期区域观察到与ACC或ACP对应的信号（数据未显示）。方解石和甲壳素在甲壳类动物的角质层中很常见，例如虾、龙虾和蓝蟹（Nekvapil等。2020年; 格本博尔等。, 2017; 昆克尔等。, 2012). 然而，以前还没有报道过方解石出现在口足类dactyl俱乐部中。相反，它们被描述为主要由几丁质、Ap、ACC和ACP（Amini等。, 2019; 织布工等。, 2012)。

对高分辨率区域进行的定向分析结果如图4所示其中，方向、投影方向度和衍射强度分别由每个像素的颜色、饱和度和值给出。投影方向度是投影中可见的方向度，即投射到探测器上的方位。扫描区域中存在两种不同的结构图案：在俱乐部6的区域1中，方解石微晶排列在稀疏的大型羽毛状结构中[图4(一)–4(d日)]. 在俱乐部6的区域2，存在一组致密的方解石带[图4(e（电子）)–4(小时)]. 在方解石羽毛和条带的中心，甲壳素具有较高的平面内（013）取向，其沿着方解石微晶形态的长方向取向[图4(c（c）)–4(克)]. 这里，还可以看到，俱乐部6的区域2中定向甲壳素带之间的距离小于区域1。在羽毛中，方解石（110）方向从中心方向的甲壳素线向外辐射[图4(b条)]. 在带结构中观察到类似的趋势，尽管程度较低[图4(（f）)]. 方解石（104）和（110）方位图的比较[图4(一), 4(b条), 4(e（电子）)和4(（f）)]表明方解石微晶是半连续取向的，遵循羽毛/带的大尺度结构。这表明方解石晶体是通过定向甲壳素组分的模板形成的；参见图4中甲壳素和方解石衍射信号的重叠图(d日)和4(小时). 从这些图谱中可以清楚地看出，未定向的甲壳素（110）峰与高定向的（013）甲壳素峰没有共定位，这表明存在两种甲壳素成分。

图4 方解石和甲壳素在俱乐部6侧面的分布和方向。(一)–(d日)区域1。(e（电子）)–(小时)区域2。(一), (e（电子）)方解石方向（104）。(b条), (（f）)方解石方向（110）。(c（c）), (克)甲壳素的取向（013）。中的插图(c（c）)显示了如何解释这些图形：色调-方向、饱和度-投影方向度（DoO），以及值-每个点的总峰值强度的自然对数。(d日), (小时)方解石和甲壳素的RGB相关性：红色-方解石（104）和（110），绿色-甲壳素（013），蓝色-甲壳质（110）。比例尺为20µm。

在第7俱乐部进行了类似的实验，该俱乐部在换羽7天后收获，并通过总览图进行了调查。Ap、Ca XRF和方解石（104）和（202）的相关图如支持信息从中可以清楚地看出，方解石形成于离撞击面最远的球杆后部附近。这表明方解石可以在俱乐部矿化过程的早期形成。因此，方解石的存在似乎不会对口足类的生活构成重大阻碍。球杆7的大部分由ACC和ACP组成，球杆侧面的条纹和周期性区域没有方解石微晶的迹象，方解石微晶只存在于球杆的背面。

为了确定动物3–5的球棒表面上是否未经修饰，从而推测为完全无定形，是否确实不存在结晶方解石，通过位置分辨XRD对球棒3–5薄片进行了研究。对于俱乐部3，未检测到方解石，这与µCT观察到的显微结构变化的缺乏一致。衍射图集可以分为含有大量Ap的子集和含有大量甲壳素的子集。这些分布在俱乐部中两个空间上不同的区域。

这些区域的平均衍射图表明，Ap位于撞击区域，而无定形散射和甲壳素衍射信号则来自所示的杆的周期区域和侧面区域[图5(一)]. 俱乐部4和俱乐部5的衍射图包含显示方解石衍射图案的小局部区域。含有方解石、Ap和几丁质区域的平均衍射图表明，Ap位于冲击区域，几丁质和无定形相位于周期和条纹区域，而含有方解液的区域位于杆4和5的侧面，如图5中的草图所示(b条)和5(d日). 与俱乐部2、6和7的大规模重组相比[图1(d日), 3(c（c）)和S1(b条)]与无定形背景相比，俱乐部4和俱乐部5中的方解石峰较小。

图5 球杆衍射图(一) 3, (b条) 4 (c（c）)和5。红色衍射图来自高Ap（002）含量的区域，黑色衍射图来自甲壳素（110）含量高的区域，蓝色衍射图显示方解石（104）和（202）含量高。蓝色勾号表示标准方解石（Maslen等。, 1995)，红色勾号表示标准Ap（Wilson等。, 1999). 每个面板中的草图显示了俱乐部内各阶段的大致定位。在(一)俱乐部3中未发现方解石，因此没有蓝色衍射图或蓝点。

由于用于对这些球棒进行成像的µCT的体素尺寸为4.5µm，并且在形态上未识别出方解石微晶，因此球棒中的晶体必须小于～9µm。XRD实验中使用的光束为20×10µm，样品厚度为100µm。与蓝色衍射图中较大的非晶峰相比，方解石衍射信号相对较小[图5(b条)和5(c（c）)]因此，与俱乐部1和俱乐部7中看似完全的转变相比，从非晶相到方解石的转变似乎是不完整的。棒材4和棒材5的大多数侧面很可能仍然弱散射ACC和ACP，与方解石峰相比，无定形峰的强度相对较高可以证明这一点（图5). 图5中的示意图总结了材料分布：撞击区有Ap，周期性和条纹状区域有几丁质，俱乐部4和5侧有小方解石颗粒，但俱乐部3中没有。基于所选衍射峰强度的不同相的合成图可以显示不同相的局部化（图6). 由于这些扫描中存在Ap，不同于俱乐部6区域1的扫描（图4)，由于Ap（002）和几丁质（013）峰重叠，因此仅使用几丁质110绘制几丁质分布图。地图显示Ap（002）为红色，甲壳素（110）为绿色，蓝色显示方解石（104）和（202）的混合物（图6). 在俱乐部3中，只有Ap和几丁质存在[图6(一)]. 观察到一些微小的蓝点是由不明污染物引起的，衍射峰与方解石（104）或方解石[202）重合，并不反映方解石。对于杆4[图6(b条)]和5[图6(c（c）)]，方解石颗粒明显分布在球杆两侧。一些区域覆盖数百微米。这种微观结构没有通过µCT进行空间分辨，这一事实表明，这些区域由多个较小的晶粒组成。

图6 俱乐部RGB相关图(一) 3, (b条)4和(c（c）)带有：红色–Ap（002）、绿色–甲壳素（110）和蓝色–方解石（104）和（202）。注意，方解石不存在于(一); 衍射图检查表明，蓝点是污染物，其衍射峰与（104）或（202）方解石峰重合。中的比例尺(一)为500µm，所有数字都相应缩放。蓝色和绿色通道的强度标度并不代表完整的信号标度，因为具有定向诱导非常强烈信号的孤立区域会使甲壳素和方解石结构几乎不可见。

在XRD实验中检测到方解石微晶，但在实验室-µCT实验中未检测到这一事实可能表明样品制备或样品干燥导致方解石晶体成核。为了检验这种可能性，将棒材3的切片在真空烘箱中加热至373 K达2.5小时，并通过位置分辨XRD重新检查。然后按照图4所示的相同方式对衍射图进行空间分离和5俱乐部侧面区域未形成方解石[图S2(一)]. 所需的样品操作导致样品破碎成几个较大的碎片，如图S2所示(一)因此只显示了完整区域的单个示例。然而，俱乐部的其余部分也没有显示方解石形成的迹象。富含Ap和甲壳素区域的平均衍射图也未显示任何方解石[图S2(b条)]. 因此，即使在373K下真空处理2.5小时后也没有发生结晶，这本应引起脱水。因此，俱乐部中的生物成因ACC和ACP相当稳定。因此，样品制备过程不太可能影响结构。

表1总结了对所检查俱乐部的观察结果综上所述，它们表明口足类趾杆的设计必须具有一定的灵活性。在多个标本的球棒侧面，我们发现了块状方解石结构的例子，小方解石微晶散布在无定形矿物中，或者根本没有方解石。当球杆侧面仅存在非晶相时，它们对干燥和磨损是稳定的。事实上，有很多稳定的ACC和ACP生物矿物的例子，包括石鳖牙齿、龙虾角质层和小龙虾的钙储存器官（Stegbauer等。, 2021; 法布里蒂乌斯等。, 2009; Luquet&Marin，2004年)因此，方解石微晶的结晶可能是通过设计实现的。

本研究中描述的俱乐部侧面区域的设计灵活性表明，俱乐部面临的机械挑战可以通过各种结构元素传播。反过来，我们推测，由结晶或非结晶矿物部分硬化的甲壳素板的存在可能足以承受机械载荷。然而，我们不能排除棒材侧面的无定形相结晶为方解石反映棒材老化的可能性。虽然第7俱乐部在换羽后仅1周内也观察到方解石晶体，但俱乐部年龄不能完全排除为该过程的一个因素。因此，另一种解释可能是，俱乐部两侧的无定形相只有在脱毛至新俱乐部完成的典型时间内才足以稳定结构，使其保持完好。在换羽过程中，形成了一种全新的杆结构，从而使无定形的侧面得到更新（蔡等。, 2023; 阿米尼等。, 2019). 因此，这可能反映出进化推动了解决方案的“足够好”而非最佳。