1.简介
致病性革兰氏阴性菌进化出许多逃避人类免疫系统的机制，并对宿主衍生抗菌药物和传统抗生素产生广泛耐药性。其中一种机制是用磷酸乙醇胺（PEA）或4-氨基-阿拉伯糖残基取代带负电的磷酸脂A头部基团。脂质A磷酸乙醇胺转移酶（EptA）将PEA从磷脂酰乙醇胺转移到脂质A的1和4′位置[图1![[链接]](../../../../../../logos/arrows/iucrj_arr.gif)
(一)]（考克斯等。, 2003)。这种修饰使细菌表面带更少的负电荷（Anaya-López等。, 2013; 佩舍尔，2002年)并排斥阳离子抗菌剂的结合肽类从而产生阻力（约翰等。, 2012; 特朗布利等。, 2015)。EptA存在于许多临床相关的革兰氏阴性菌中（Huang等。, 2018)鉴于其在减少先天性免疫反应，这种酶已经成为开发潜在抑制剂的靶点，作为治疗多药耐药细菌感染的治疗剂（卡勒等。, 2018)。为此，为了更好地理解底物结合和酶催化的分子机制，通过X射线晶体学（Anandan等。, 2017).
![[图1]](jt5059fig1thm.gif)
| 图1
EptA的催化反应和结构。(一)EptA催化的反应。(b条)来自的EptA的二级结构表示脑膜炎双球菌（PDB条目5fgn公司)。N端跨膜结构域用深蓝色表示，C端可溶性结构域用红色表示。连接跨膜结构区和可溶性结构域的桥接螺旋用淡蓝色表示。蛋白质中的色氨酸残基被描绘成青色小球和棒状物。 |
这个晶体结构EptA显示了一个具有跨膜结构域和周质可溶性结构域的蛋白质折叠，该结构域由一个广泛的环和一个桥接螺旋连接[图1(b条)]（阿南丹等。, 2017)。该结构还揭示了四面体配位的Zn2+接近催化剂的离子亲核剂，Thr280和一个界限n个-十二烷基-β-D类-麦芽糖苷（DDM）分子位于活性位点附近的可溶性和跨膜结构域之间。
在不含脂质A的情况下，酶从磷脂酰乙醇胺中分离PEA的能力（Anandan等。, 2017)以及在晶体结构这表明，两种大小不同的脂质底物可能会依次进入活性位点，从而引发乒乓球催化机制（Wanty等。, 2013)。结构中结合的DDM分子似乎将可溶性结构域定位在相对靠近跨膜结构域的位置，从而将酶锁定在可能模拟EptA磷脂酰乙醇胺结合状态的构象中。在这种构象中，结合位点的大小不足以容纳大的脂质a底物。这进一步表明，该酶可能采用交替构象来将磷酸乙醇胺从活性位点Thr280转移到脂质A头部。为了建立EptA采用不同构象的能力，酶也在n个-十二烷基磷胆碱（DPC）洗涤剂胶束，在结构和离子性质上与DDM不同。这种方法使得研究其他膜蛋白的构象灵活性成为可能，例如月桂酰二甲胺中的磷酸化酶激活基因P（PagP）-N个-氧化物（LDAO）胶束和DPC胶束（Hwang等。2004年).
DPC是一种两性离子洗涤剂，含有磷胆碱头部基团，在膜磷脂和十二烷基烷基尾部中非常普遍。尽管DPC因其强烈的洗涤剂、破坏和扭曲蛋白质结构（Chipot等。, 2018)它还提供了对诸如磷酸转运蛋白Pho89（Sengottaiyan等。, 2013)和钾通道KcsA（Imai等。, 2012)。DPC对蛋白质的影响高度依赖于大分子的特定结构和折叠。因此，在对此类研究进行任何构象研究和解释之前，必须评估DPC胶束中的蛋白质结构完整性。
EptA在DDM和DPC胶束中保持其二级和三级结构完整性，如下所示圆二色性和热位移分析（Anandan等。, 2017)。EptA在DDM胶束和DPC胶束中的有限蛋白水解和固有荧光实验表明，该酶在不同的洗涤剂胶束（Anandan等。, 2017)。此外，生物信息学 分子动力学双棕榈酰双层酶的模拟-锡-甘菊-3-磷酸乙醇胺脂类表明可溶性结构域相对于跨膜结构域（Anandan等。, 2017)。在这个模拟中，观察到可溶性结构域“翻滚”膜表面，产生与在晶体结构。这个分子动力学这项研究为使用不同的实验生物物理方法研究酶的构象灵活性提供了动力。
由于缺乏晶体形成，迄今为止，用结晶学方法研究DPC胶束中EptA的结构一直具有挑战性。小角度X射线散射（SAXS）是一种强大的技术，特别适用于构象柔性系统（Receveur-Brechot&Durand，2012）)尤其是当部分结构信息可用时。此外，将SAXS耦合到内联分离技术，例如尺寸排除色谱法（SEC）极大地提高了蛋白质：洗涤剂复合物（PDC）等复杂系统测量的实用性（Mertens&Svergun，2010)。该方法可以将PDC从游离洗涤剂胶束中分离出来，从而提供溶解系统成分的散射信息（Ryan等。, 2018)。在从头算刚体建模方法结合原子坐标下散射曲线的精确计算，可以提供可靠的模型，以深入了解溶液中蛋白质的结构构象（Koutsioubas，2017; 库齐乌巴斯等。, 2013)。重要的是，这些建模方法可用于描述蛋白质的结构和功能，具有很大的灵活性，其中系统交替状态的信息很难或甚至不可能通过更高分辨率的方法获得。通过晶体学获得的结构模型中捕获的快照构象状态可用于混合方法，以使用SAXS和其他方法的数据进一步探测分子构象。在本研究中，我们使用SEC-SAXS和固有荧光猝灭研究了EptA在DDM胶束和DPC胶束中的构象状态。色氨酸残基被取代的酶突变体的固有荧光猝灭实验使我们能够进一步探测EptA的可溶性和跨膜结构域的局部环境，作为洗涤剂环境的函数。
SEC-SAXS研究成功地反褶积了EptA洗涤剂复合体的散射数据，使用两种独立的方法模拟了蛋白质周围的洗涤剂电晕，并比较了不同洗涤剂环境中生成的模型。荧光研究确定了负责构象变化的酶的特定结构区域，该结构区域将域间柔韧性定位于连接可溶性和跨膜域的桥接螺旋，并表明这种柔韧性在酶的催化功能中起着关键作用。这种多方面的生物物理方法不仅提供了有关EptA构象灵活性的独特信息，而且有助于研究其他膜蛋白，以了解构象灵活性对功能的作用。
2.方法
2.1. EptA色氨酸突变体质粒的构建
EptA色氨酸突变体是通过重叠延伸的两轮剪接获得的聚合酶链反应（SOE PCR），其中126、148和207位的色氨酸残基被苯丙氨酸取代。在第一轮SOE PCR中，从野生型中扩增出带有W126F和W207F突变的单独片段电子产品认证使用含有这些突变的引物。在第二轮SOE PCR中，这些片段被用作模板，重叠的互补端允许退火和形成整个基因，将片段“缝合”在一起以创建一个单一突变结构（W126F）和一个双突变结构（W126F/W207F）。重复这两步过程引入W148F突变，以W126F突变为模板制备双突变体（W126F/W148F），以W26F/W207F双突变体为模板制得三突变体（W126F/W207/W148F）。表S1支持信息列出了每轮SOE PCR中使用的引物。将突变体克隆到pET28a（+）载体的NcoI和BamHI位点。每个构建的突变质粒都通过菌落PCR和限制性内切酶消化以及DNA测序进行了验证。
对于中的表达式脑膜炎奈瑟菌细胞，使用限制性内切酶XbaI和SalI并克隆到neisserial的XbaI与SaI位点穿梭矢量。该载体由pYT250（Tzeng等。, 2002)连接到低拷贝质粒pHSG576中，该质粒含有一个氯霉素抗性标记和两个不同的复制来源（竹下等。, 1987)，在两者中启用复制大肠杆菌和内塞里亚物种。它还包含一个ompR公司启动子驱动下游基因表达和合成产生的多克隆位点。克隆PCR和限制性内切酶消化证实了这两个突变体的成功克隆。
2.2. 多粘菌素B敏感性测定
多粘菌素B敏感性通过E-strip测试确定。自然转化后（Janik等。1976年)穿梭载体转化为NMB菌株Δ电子产品认证，在添加了0.4%的淋球菌基琼脂上隔夜生长(w个/v（v）)D类-葡萄糖溶液和0.68mM（M）使用无菌环收集每个菌株的硝酸铁（III），并接种在5 ml GC肉汤中[1.5%(w个/v（v）)特殊蛋白胨、0.4%磷酸二钾、0.1%磷酸二氢钾和0.5%氯化钠]。肉汤悬浮液在60℃离心克2分钟，去除结块并标准化为外径560第0.4页。然后将标准悬浮液以100µl的体积分散在GCGF板上。将GCGF板晾干10分钟，然后将多粘菌素B E条（BioMérieux）放置在板的中心。然后在37°C和5%CO下培养GCGF板过夜2并报道了抑制区。
2.3. 蛋白质表达和纯化
用于SEC-MALS和SEC-SAXS实验的EptA使用Anandan工作中详述的pTrc99A表达载体表达等。(2017)。使用如上所述设计的pET28a（+）表达载体表达用于色氨酸荧光实验的突变体。所有蛋白质均在DDM胶束和DPC胶束中纯化，详见Anandan的工作等。(2017)。包含WT的向量电子产品认证带有C-末端六组氨酸标签的基因在大肠杆菌菌株BL21（DE3）pLysS，而突变体在大肠杆菌BL21（DE3）罗塞塔2。有教养的大肠杆菌通过离心收获细胞（1290克在4°C下1小时），并在50 m内溶解M（M）pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，含300mM（M）氯化钠和1 mM（M）PMSF使用乳化C5高压均质机（Avestin乳化C5）。通过超速离心（185 511）从裂解液中分离膜克在4°C下保持1小时）。通过将裂解液与1%的洗涤剂（DDM或DPC）在50 m内孵育4 h，将EptA溶解并从膜中分离M（M）pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，含300mM（M）氯化钠，10米M（M）咪唑和1 mM（M）PMSF后进行超速离心（185 511克在4°C下持续1小时）。
金属螯合色谱法和尺寸排除色谱法用于EptA纯化。将超速离心获得的上清液应用于预先平衡的HisTrap粗提物螯合亲和柱（GE Healthcare）和结合缓冲液[50 mM（M）磷酸钠pH7.5300 mM（M）氯化钠，20 mM（M）咪唑和3×CMC洗涤剂（0.023%DDM或0.14%DPC）]。然后用洗脱缓冲液【50 m】洗脱结合蛋白M（M）磷酸钠pH7.5300 mM（M）氯化钠，500 mM（M）咪唑和3×CMC清洁剂（0.023%DDM或0.14%DPC）]，使用Au KTApurifier FPLC系统（GE Healthcare）。将对应于EptA的峰值汇集，将缓冲液交换为50 mM（M）磷酸钠pH 7.5，150 mM（M）使用PD-10脱盐柱（GE Healthcare）的氯化钠和3×CMC洗涤剂（0.023%DDM或0.14%DPC），并应用于尺寸排除色谱法立柱（Superdex 200 10/30，GE Healthcare）与50 m平衡M（M）HEPES pH 7.0，100 mM（M）NaCl和3×CMC洗涤剂（0.023%的DDM或0.14%的DPC）。使用离心过滤装置（Vivaspin 20 MWCO 100 000，GE Healthcare for DDM纯化的EptA和Vivaspin20 MWCO50 000，GE healthcares for DPC纯化的EttA）将洗脱峰中的部分EptA浓缩至7或2 mg ml−1分别用于SEC-SAXS工作和荧光工作的蛋白质，由280 nm处的吸光度和计算出的摩尔消光系数（73 980M（M）−1 厘米−1用于WT EptA，62 980M（M）−1 厘米−1对于双突变体和57 480M（M）−1 厘米−1对于三重突变体）。
2.4.圆二色性光谱偏振法
在缓冲液交换至20m后，确认WT和突变型EptA的折叠状态M（M）磷酸钠，pH 7.0，3×CMC洗涤剂（0.023%DDM或0.14%DPC），带有5 ml HisTrap脱盐柱，使用Au KTApurifier FPLC系统，并稀释至0.1 mg ml浓度−1.在20°C下，在圆二色性（CD）分光光度计（Jasco J-720），使用1 mm路径长度的石英试管。在190–260 nm波长范围内，每1 nm收集一次数据，每次积分时间为1s，并进行三次累积。CD光谱收集为三份，并针对缓冲基线进行校正，使用Savitzky–Golay滤波器提高信噪比，使用最小卷积宽度（五个数据点）的光谱分析软件（适用于Windows 95/NT的1.53.07版本，Jasco Corp.）。
2.5. SEC-MALS数据收集和分析
使用10/300GL Superdex 200色谱柱（GE Healthcare）与Viscotek TDA四检测器阵列（Malvern）耦合，对DDM和DPC胶束中的EptA进行SEC-MALS分析。SEC-MALS系统与50 m平衡M（M）HEPES pH 7.0，100 mM（M）NaCl和3×CMC清洁剂（0.023%DDM或0.14%DPC），以获得所有探测器的平坦基线。然后根据100µl的1 mg ml校准仪器−150m制备牛血清白蛋白M（M）HEPES pH 7.0，100 mM（M）NaCl和3×CMC各自的洗涤剂（0.023%DDM或0.14%DPC）。通过注射100µl浓度为1 mg ml的蛋白质来分析DDM胶束和DPC胶束中纯化的EptA的完整性−1进入SEC-MALS系统并以0.3 ml min的速度流动样品−1.伟世达OmniSEC公司使用软件进行数据收集和分析。多探测器共聚物该方法用于蛋白质的分析和分子量测定：洗涤剂复合物（PDC）和从柱上洗脱的胶束（波洛克等。, 2012)。PDC和洗涤剂胶束的峰值限值由人工确定n个/天c（c）蛋白质值（0.185 ml g−1)和洗涤剂（0.1608毫升g−1对于DDM和0.1398 ml g−1用于DPC）的分子质量计算。
2.6. SEC-SAXS数据收集和分析
内联SEC-SAXS是在澳大利亚同步加速器的SAXS/WAXS束线上进行的。蛋白质样品经过尺寸排除色谱法使用连接至岛津HPLC系统的S200 10/300增加柱（GE Healthcare），并通过SAXS共流池（Kirby）内的毛细管等。, 2016; 赖安等。, 2018)。柱用50 m预平衡M（M）HEPES pH 7.0，100 mM（M）氯化钠、0.1%叠氮化钠和合适的洗涤剂浓度（DDM的4×CMC或DPC的3×CMC）。50µl 7.0毫克毫升−1在DDM胶束或7.0 mg ml中纯化的EptA−1将在DPC胶束中纯化的EptA注入色谱柱并在0.2和0.4 ml min洗脱−1分别是。SAXS数据是使用能量为12 kEV的X射线和通量第3.1×10页12 光子−1由于数据是在两个不同的场合收集的，因此在2.5 m处的Dectris PILATUS 1M探测器上收集DPC SAXS数据中的EptA（提供q个使用Dectris PILATUS 2M探测器在2 m处收集DDM SAXS数据中的0.005–0.3μl）和EptA（提供q个范围0.01–0.5º）。连续采集帧并每隔5秒进行整合。表S2中给出了SAXS数据采集和数据缩减统计数据以及用于数据分析的软件的详细信息。程序分散式列车由澳大利亚同步加速器开发的2.82用于将二维散射模式减少为一维剖面，然后使用ATSAS公司3.0实验后数据分析软件套件（Franke等。, 2017)。输出的综合误差分散式列车有两个标准误差，必须除以二才能满足标准定义χ2准确反映适合的标准（Ryan等。, 2018).克洛米克斯（Panjkovich&Svergun，2018年)然后用PDC洗脱峰值帧减去缓冲帧（帧～100–155），生成SAXS曲线，以进行进一步分析。这个回转半径(R（右）克)通过蛋白质洗脱峰测量框架，其痕量来自SAXS/WAXS管道，该管道基于自动记录器，但对低噪音更敏感q个范围。选择DDM胶束中EptA的框为391到409，DPC胶束中的EptA框为364到389进行分析。普里默斯（科纳列夫等。, 2003)用于绘制和检查克洛米克斯-生成SAXS曲线，汽车用于生成我（0）和R（右）克,数据编号用于生成P（P）(第页)功能（Franke等。, 2017)、和数据通信管理平台（弗兰克等。, 2017; 佩图霍夫等。, 2012)用于比较散射曲线的相似性。无量纲Kratky图是根据Durand的工作计算的等。(2010)使用吉尼亚分析确定的值，以及P（P）(第页)函数由散射曲线通过间接变换方法计算GNOM公司（斯维尔贡，1992年)。分子量根据我0使用Mylonas&Svergun（2007）的方法)，带有部分比容使用PDC的重量平均成分计算马尔斯数据，a部分比容对于根据序列计算的EptA，使用护根物（惠顿等。, 2008)以及引用的DDM和DPC的部分特定卷Anatrace公司(https://www.anatrace.com)。根据成分和元素组成计算溶剂和PDC的电子密度。PDC的浓度由在线紫外吸收测量值计算得出，PDC的A280 nm消光系数由以下公式计算得出PROTPARAM公司.
2.7. 模型建筑
2.7.1.纪念碑和达迪莫多
纪念碑（2.2版）（Perez&Koutsioubas，2015年)用于生成蛋白质：洗涤剂复合物的混合模型，具有EptA（PDB入口）的高分辨率结构5fgn公司; 阿南丹等。, 2017)用于模拟蛋白质组分和围绕EptA跨膜区域的洗涤剂电晕（DDM或DPC），模拟为虚拟原子。这个晶体结构在N末端缺少前八个残基，在C末端缺少六组氨酸标签。这个晶体结构缺少上述残留物时，使用PyMOL公司软件遵循纪念碑包装，使得跨膜结构域平行于z（z）轴。结构相对于xy公司调整了飞机（Perez&Koutsioubas，2015)使得形成EptA的芳香带的芳香残基（Anandan等。, 2017)垂直于z（z）轴。纪念碑通过采样五个几何参数，即`一'（洗涤剂圆环的高度）`b条'[大圆环的横截面(b.e公司)和未成年人(b条/e（电子）)轴]`t吨'（亲水外壳的厚度）`e（电子）'（椭圆度）和`ω'（日冕围绕z（z）轴）以拟合实验SAXS曲线。电晕的内部疏水区和外部亲水区是通过相应洗涤剂的电子密度来确定的。用于模拟DDM电晕的电子密度为0.277 e Au−3对于疏水部分和0.520 e Au−3对于DDM分子的亲水部分，而用于模拟DPC电晕的电子密度为0.277 e Au−3憎水部分和0.490 e Au−3亲水部分（利弗特等。2007年)。该程序计算参数值以生成最符合实验曲线的模型。生成的模型和SAXS实验数据之间的一致性由χ2价值产生于CRYSOL公司（斯维尔贡等。, 1995)（表1).
| 结构参数 | DDM胶束中的EptA | DPC胶束中的EptA | | Gunier分析 | | 我（0）（厘米−1) | 0.013±1.9×10−4 | 0.0052 ± 3.3 × 10−5 | | R（右）克(Å) | 41.96 ± 0.71 | 45.78 ± 0.40 | | 新加坡特别行政区克限制 | 0.60 ± 1.30 | 0.40 ± 1.35 | | P（P）(第页)分析 | | | | 我（0）（厘米−1) | 0.013 ± 0.9 × 10−4 | 0.0052 ± 2.8 × 10−5 | | R（右）克从P（P）(第页) (Å) | 41.45 ± 0.01 | 48.14 ± 0.01 | | D类最大值(Å) | 128.9 | 171.06 | | 秒范围（Ω−1) | 0.01–0.2 | 0.005–0.21 | | | | | | 分子量估算 | | SEC-SAXS（kDa） | 200.25至218.51 | 125.51至136.37 | | 截面尺寸（kDa） | 160 ± 8.0 | 109 ± 3.4 | | | | | | 原子建模和模型拟合结果 | | 纪念碑（洗涤剂圆环尺寸） | | 高度(一) (Å) | 31 | 24.7 | | 横截面（Ω） | | | 主轴(b条.e（电子）) | 34.7 | 32.9 | | 短轴(b条/e（电子）) | 15.4 | 16.3 | | 椭圆度 | 1.5 | 1.42 | | 亲水层厚度(t吨)（Å） | 4.8 | 3.7 | | 日冕旋转角z（z）轴线(ω)（°） | 110 | 0 | | χ2 | 1.259 | 6.943 | | | | | | 达迪莫多 | | 生成的模型数量 | 不适用 | 5 | | χ25种型号的范围 | 不适用 | 1.05至1.07 | | MPBuilder（MPBuilder）（洗涤剂电晕尺寸） | | 使用添加的洗涤剂分子数量PACKMOL公司常规 | 225 | 160 | | 双层高度（Ω） | 45 | 44 | | 横截面（Ω） | | | 主轴 | 64 | 47 | | 短轴 | 37.5 | 40 | | 椭圆度 | 1.7 | 1.2 | | | | | | 珊瑚 | | 柔性残留物 | 1–7, 211–230, 544–550 | 1–7, 211–230, 544–550 | | 秒建模范围（Ω−1) | 0.01–0.32 | 0.006–0.288 | | χ2,P（P）价值 | 1.18, 0.00 | 1.84, 0.16 | | | | | | EOM公司 | | 柔性残留物 | 1–7, 211–230, 544–550 | 1–71211–230544–550 | | 秒建模范围（Å−1) | 0.01–0.10 | 0.01–0.10 | | χ2,P（P）价值 | 0.26, 0.20 | 0.99, 0.85 | | |
为了改进SAXS数据指导下的建模，并优化EptA可溶性和跨膜结构域的相对定位，该项目达迪莫多（埃夫拉德等。, 2011)已使用。这个纪念碑生成的模型用作达迪莫多 遗传算法。可溶性和跨膜结构域保持刚性，而连接两个结构域的区域，即桥接螺旋和扩展环区域，被定义为程序的柔性区域。
2.8. 固有色氨酸荧光测量
使用EnSpire多模平板阅读器（Perkin Elmer）监测固有荧光。样品激发在295nm（100次闪光；<8nm带宽）下进行，以选择性激发色氨酸残基，并以1nm的间隔测量315至405nm的发射光谱。12µ的蛋白质样品M（M）浓度为50 mM（M）HEPES pH 7.0，50米M（M）通过添加4M（M）碘化钾也含有0.2米M（M）硫代硫酸钠防止三碘化物（I三−)。未淬火样品保持不变离子强度包括等量的氯化钾。对于变性蛋白质的固有荧光，样品中还含有4M（M）盐酸胍作为变性剂和0.2M（M） β-巯基乙醇在整个实验过程中保持还原条件。所有样品在UV Star半面积微孔板（Greiner Bio One）中于20°C下孵育15分钟。从三个重复的蛋白质孔记录光谱，并通过从三个相同体积的重复无蛋白孔中减去测量值以及等效的盐和缓冲液成分进行校正。
淬火实验获得的数据拟合到方程（1）为了确定Stern–Volmer常数(K（K）SV公司)，其中[I−]对应于碘化物浓度：
非抑制到猝灭蛋白质的相对荧光强度(F类0/F类)通过将KCl存在下的最大蛋白质荧光发射除以KI当量浓度下的最大蛋白荧光发射，从三重光谱中获得。这校正了离子强度以及每次添加淬火盐或非淬火盐的样品体积(即。KI和KCl）。方程式（1）使用线性回归拟合淬火数据的线性区域GraphPad棱镜软件（适用于Windows的5.02版，GraphPad（图形板）软件公司）。
3.结果
3.1. 蛋白质的表征：洗涤剂复合体的SEC-MALS分析
用SEC-MALS对DDM胶束和DPC胶束中纯化的EptA进行分析，以确定该蛋白在不同的洗涤剂胶束中是单分散的，并适用于SAXS研究。图S1(一)和S1(b条)的支持信息显示了280 nm紫外吸收和折射率（RI）信号分别叠加在DDM胶束和DPC胶束中EptA的直角散射信号上。DDM胶束中的EptA在14.11 ml处洗脱，作为紫外吸收检测到的单峰，而RI信号在15.9 ml处显示另一个峰，对应于游离DDM胶粒。DDM胶束中的EptA在洗脱峰上有明显的曲率，表明可能存在动态平衡或浓度依赖性关联。虽然改变蛋白质/洗涤剂浓度比的初步SEC-SAXS实验是作为优化过程进行的（未提供数据），但[EptA]：[DDM]的电流比为7 mg ml−1：选择4×CMC进行最终SEC-SAXS分析，因为在此条件下样品表现得更均匀和不分散。DPC胶束中的EptA以14.41 ml洗脱，游离DPC胶粒以16.74 ml洗脱。虽然两个样品的PDC峰和洗涤剂胶束峰之间观察到了轻微重叠，但在进行数据分析之前，仔细设置了峰边界以将重叠降到最低。RI估计的EptA:DDM复合物的平均分子量（MWt）为160.3±8.0kDa，计算的EptA的MWt为58.31kDa。对于EptA:DPC复合物，平均MWt估计为109.0±3.4 kDa，而仅EptA的MWt则估计为62.85 kDa。DDM胶束中EptA的分子量估计值略低于理论值，根据PROTPARAM公司（Gasteiger公司等。, 2005)（61.40kDa），而DPC胶束中EptA的估计更接近理论值。根据这些结果，与蛋白质：洗涤剂复合体相关的DDM和DPC分子的平均数量估计分别为200和123。
4.讨论
EptA修饰脂质A所需的酶化学涉及两种脂质底物的结合：磷脂酰乙醇胺作为供体脂质，脂质A作为PEA部分的受体脂质。该酶首先将PEA部分从供体脂质转移到活性位点苏氨酸（Thr280），以生成与PEA结合的酶中间体，并释放出二酰基甘油。然后，脂质A必须与酶结合，以使PEA能够从酶中间体转移，从而制备最终修饰的脂质A产物。以前，我们的EptA晶体结构是从DDM胶束中纯化的重组酶中生长出来的，显示出一种封闭结构，能够在结合位点容纳DDM分子（Anandan等。, 2017)。该DDM分子的O3B与共价键合到EptA（Wanty等。, 2013)。对结构的进一步检查表明，酶联PEA分子可以位于Thr280和Glu114之间，位于膜结构域。事实上，谷氨酸侧链很好地与PEA的胺形成氢键（Anandan等。, 2017)。基于这些观察结果，我们假设结合的DDM分子模拟了酶的磷脂酰乙醇胺底物结合构象。然而，这种构象不能适应脂质A与PEA-结合的Thr280的结合，因此我们推测该蛋白质必须能够在溶液中采用不同的构象状态才能实现PEA转移。嵌入PE/PG系统中的EptA的分子动力学模拟表明，在六个模拟中的四个模拟中，酶的整体构象保持接近起始结构，尽管在两次模拟中，可溶性结构域从膜结构域中分离出来，并在膜表面滚动，与脂质极性头相互作用（Anandan等。, 2017)。这表明该蛋白能够采用不同的构象，目前的研究是通过SEC-SAXS和固有荧光溶液研究来验证EptA的灵活性。WT-EptA和突变形式的酶，其中选择性色氨酸残基被苯丙氨酸取代，分别在两个不同的洗涤剂系统中溶解和纯化，即DDM和DPC。
DDM和DPC洗涤剂分别含有一个12-碳酰基链和一个麦芽糖苷和磷酸胆碱头部基团。这些洗涤剂胶束中EptA的结构完整性通过CD分析、差示扫描荧光法和胰蛋白酶和糜蛋白酶（Anandan等。, 2017)。DDM和DPC胶束中WT蛋白的CD光谱显示出相似的轮廓，表明EptA的二级结构在两种洗涤剂胶束中都是保守的。此外，EptA:DDM和EptA:DPC都表现出不同的融化温度，这表明该酶保持稳定三级构造在这两个洗涤剂系统中（Anandan等。, 2017)。EptA:DDM和EptA:DPC同时抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶的消化，并在12小时内显示出明显的条带，进一步支持蛋白质在两种洗涤剂系统中仍然折叠。
鉴于EptA在用于本研究的洗涤剂胶束中保持其结构完整性，本文使用两种不同的生物物理方法得出的结果旨在探测酶的灵活性，提供了进一步的实验证据，表明酶是结构动态的。对于这些研究，首先进行MALS分析，以评估样本是否符合SAXS研究。然而，仔细的分析表明分子量存在差异，因此MALS数据主要用于确认每个胶束一个蛋白质分子的粗略化学计量，但不足以确认洗涤剂与蛋白质的比例，最有可能是由于MALS分析和SEC-SAXS分析之间的浓度变化。所有基于模型的分析都使用直接从SEC-SAXS实验中获得的分子量计算。这个吉尼亚阴谋SEC-SAXS数据显示，没有明显的聚集或展开迹象秒从Kratky图中可以明显看出，DPC中EPtA的灵活性增加。使用多种算法进行的进一步建模表明，基于晶体结构，这些模型紧密地重述了SAXS数据。有趣的是，使用各种算法对SAXS数据进行的分析已收敛到类似的模型，这些模型与膜环境中EptA的MD模拟结果吻合良好（Anandan等。, 2017).
使用不同的色氨酸突变，构象灵活性的来源可以定位于桥接螺旋，连接结构的可溶性结构域和跨膜结构域。这个K（K）SV公司从Stern–Volmer图中获得的常数反映了猝灭剂对色氨酸荧光团的可及性，并且随着空间位阻如果色氨酸残基位于埋藏的缝隙中或疏水蛋白核心内，则为猝灭-荧光碰撞（Lakowicz，2006）)。从Stern–Volmer分析中可以看出，EptA在DPC胶束中的构象灵活性较大，这与以下确定的模型一致EOM公司分析。总的来说，分析支持结构观察，即在每个洗涤剂环境中，蛋白质的可溶性域中的色氨酸残基比跨膜域中的要深，因为跨膜域色氨酸残留物仅存在于WT酶中。此外，结果提供了证据，证明EptA的构象柔性定位在桥接螺旋上，并且这种柔性使得两个域在螺旋暴露出更多溶剂时相互滚动。
这些研究的一个警告是，众所周知，DPC会在其他膜系统中引起不稳定效应，因此需要进一步研究这些结果，以确认我们观察到的开放和封闭构象的确切生理相关性。然而，研究结果确实对蛋白质的弹性性质提供了一些见解，有趣的是，它与之前的研究结果一致生物信息学表明具有柔性畴结构的实验（阿南丹等。, 2017)。这为EptA如何采用有助于结合不同底物、磷脂酰乙醇胺和脂质A的构象姿势，并使转移化学发生提供了一些见解。
我们认为这些运动是蛋白质进行其独特化学反应所必需的基本特征。桥接螺旋在结构中起着铰链区域的作用，使蛋白质能够打开，从而暴露可溶性结构域和锌2+酶中间体PEA-结合Thr280残基位置附近的离子结合位点。这种更开放的结构将提供一种酶状态，使较大的脂质A底物能够接触到PEA结合的酶中间产物。
因此，通过使用两种不同的基于溶液的研究以及定点突变，EptA的详细分子图正在出现，这有助于我们更好地理解酶化学，并将在未来的药物设计策略中有价值，以将酶的有效抑制剂作为治疗MDR细菌感染的新型治疗剂。此外，SEC-SAXS和从头算本研究中描述的刚体建模方法提供了一个基于方法学的框架，用于查询溶解在洗涤剂或纳米盘中的其他膜蛋白系统的溶液结构。
致谢
我们还感谢Shakel Mowlabocus博士在Trp突变DNA构建物设计中的协助，以及Susannah Piek博士和Emily Kibble女士在NMB设计中的帮助Δ电子产品认证菌株和多粘菌素敏感性测定所需的穿梭载体。
资金筹措信息
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会的拨款支持（拨款编号APP1003697；APP1078642授予AV和CMK）。我们感谢澳大利亚基础设施研究委员会（Australian Research Council for Infrastructure）的拨款支持（LE120100092授予AV）。我们感谢澳大利亚同步加速器访问SAXS/WAXS光束线。
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