1.简介
三维（3D）域交换是齐聚其中两个或多个相同的蛋白质单体交换其结构域（贝内特等。1994年
). 自从引入域交换概念以来（Bennett等。1994年)，许多研究已经建立了一些可以控制结构域交换的结构元件，包括蛋白质铰链环中的脯氨酸或缬氨酸残基（伯格多尔等。, 19971998年; 卢梭等。, 2001; 库尔曼等。, 2001; 米勒等。, 2010; Shingate&Sowdhamini，2012年)，铰链环的长度（绿色等。, 1995; 默里等。1998年; 皮科内等。, 2005)和二硫键的形成（Yang等。, 1999; 巴里恩托斯等。, 2002, 2004; 可耐斯等。, 2001). 在这些元素中，二硫键提供了一种特别有用的方法来调节结构域交换，因为它们可以像氰卵磷脂-N（Yang等。, 1999; 巴里恩托斯等。, 2002)也可以从人类朊蛋白（Knaus等。, 2001). 此外，为了理解域交换的能量基础（Cho等。, 2005; 杨等。, 2004). 事实上，没有理由认为蛋白质应该支持结构域交换；此外，即使在平衡状态下（Cho），域摆动结构也不能确保蛋白质处于最稳定的结构等。, 2005). 然而，单体蛋白质的拓扑结构足以预测和确定蛋白质是否会形成域摇摆复合物（Yang等。, 2004). 一些研究概述了设计域摇摆复合物（Picone）的蛋白质特异性方法等。, 2005; 奥利科夫斯卡等。, 2011; 库尔曼等。, 2001; 里斯等。, 2014; 卢梭等。, 2001; 皮卡等。, 2013; 默里等。1998年); 在某些情况下，基于结构的蛋白质折叠模型揭示了结构域交换的机制（Mascarenhas&Gosavi，2016, 2017). 引入分子内二硫键从理论上可以影响能量景观，改变折叠的结构域交换机制（Cho等。, 2005). 将“杠杆”蛋白融合到诱导二硫键交联的目标蛋白的内部位置也会导致结构域交换（Ha等。, 2012, 2015). 在本研究中，我们在谷胱甘肽-1的结构和机理研究中遇到了无法解释的畴荡配合物的晶体结构oremlandii梭菌（菌株OhILAs；cGrx1）及其与来自同一生物体的蛋氨酸亚砜还原酶A的复合物（cMsrA）。具体来说，我们确定了cGrx1的二硫醇和单硫醇版本（分别为d-cGrx1和m-cGrx1）以及m-cGrx1与cMsrA的络合物的结构，其中m-cGrx1的结构显示了两种可选的域wapped构型。cGrx1和cMsrA都是含有催化硒半胱氨酸（Kim）的天然硒蛋白等。, 2009)cGrx1被认为是cMsrA（Kim）的还原剂等。, 2015; 李等。, 2015). 巯基二硫醚氧化还原酶cGrx1在维持细胞氧化还原平衡中起作用，并含有U（或C）PX（X）活性部位的C基序。一般来说，第一个半胱氨酸，即CP的催化半胱氨酸X（X）C基序，攻击目标酶的半胱氨酸残基并被氧化。第二个半胱氨酸被称为分解半胱氨酸，然后与氧化催化半胱氨酸形成分子内二硫键（Kim&Gladyshev，2007）; 博希·穆勒等。, 2008; 李等。, 2015)随后被还原剂谷胱甘肽（GSH）还原。尽管有这些相对成熟的步骤，但分解半胱氨酸的突变导致分子间二硫键，导致结构域交换。核磁共振（NMR）光谱和氢/氘交换（HDX）证实了溶液中的结构域交换质谱法（MS）。因此，通过蛋白质工程，我们可以利用CPX（X）C基序及其半胱氨酸突变控制蛋白齐聚通过引入替代域交换。
2.实验程序
2.1. 克隆、蛋白表达和纯化
cMsrA如前所述进行表达和纯化（Kim等。, 2009). 如前所述生成硫醇和二硫醇cGrx1（Kim等。, 2011). cMsrA和cGrx1的催化硒代半胱氨酸被半胱氨酸取代。柱纯化蛋白浓缩至最终浓度约15 mg ml−1以牛血清白蛋白为标准，通过Bradford分析测定。m-cGrx1–cMsrA复合物用Superdex 75 HiLoad 16/60柱（GE Healthcare）在培养5 m后纯化M（M）蛋氨酸亚砜在4°C下放置2 h。将柱状纯化蛋白复合物浓缩至最终浓度约20 mg ml−1.
2.2. 结晶和数据收集
通过使用Hampton Research（Crystal Screen、Index、SaltRx、PEG/Ion、PEGRx、Crystal Screen Cryo和Crystal Sreen Lite）和Anatrace（MCSG Crystalization Suite MCSG-1–4）的各种筛选试剂盒，采用坐滴蒸汽扩散法在20°C下进行初始结晶筛选。然后使用24孔VDX板（汉普顿研究所），通过吊滴蒸汽扩散法依次优化结晶条件。通过将1µl浓缩蛋白溶液与等体积的储液罐溶液混合来设置每滴，并与500µl储液罐液进行平衡。使用由0.1组成的储层溶液获得了d-cGrx1、畴移m-cGrx1-和cGrx1-cMsrA复合体的晶体，适用于X射线衍射数据采集M（M）磷酸钠/柠檬酸pH 4.2，0.2M（M）硫酸锂，20%聚乙二醇1000，0.1M（M）HEPES pH值7.5，20%聚乙二醇400，8%聚乙二醇8000，0.1M（M）磷酸钠/柠檬酸，pH 4.2，0.4M（M）磷酸钾（二元酸）/1.6M（M）磷酸钠（一元）。
2.3. 结构确定
将每个晶体转移到含有25%甘油的储存溶液中，然后在液氮中冷却以进行低温保护。在浦项加速器实验室的光束线BL11C上收集了X射线衍射数据。同步辐射X射线的波长为1.000欧，最高分辨率为2.8欧。使用1.0°振荡收集所有衍射图像，1s曝光范围为0°至360°，并使用香港（HKL）-2000年包装（Otwinowski&Minor，1997). 通过分子置换法确定结构，使用相位器（麦考伊等。, 2007)，模型构建由自动编译基于解决方案/RESOLVE（解决）在凤凰套件（Liebschner等。, 2019).库特（埃姆斯利等。, 2010)和菲律宾精制中的工具凤凰用于精细化。结构统计精炼如表1所示.
| | d-cGrx1型 | m-cGrx1–cMsrA复合物(β3互换） | m-cGrx1型(β1掉期） | | 波长（Å） | 1 | 1 | 1 | | 分辨率范围（Ω） | 37.07–2.806 (2.907–2.806) | 29.84–2.799 (2.899–2.799) | 30.85–2.804 (2.904–2.804) | | “空间”组 | C类121 | 对三221 | 对三1 | | 一,b条,c（c）(Å) | 93.420, 61.105, 93.940 | 153.424, 153.424, 67.898 | 67.547, 67.547, 72.616 | | α,β,γ(°) | 90, 104.237, 90 | 90, 90, 120 | 90, 90, 120 | | 总反射 | 70031 (5110) | 177562 (12154) | 61774（3729） | | 独特的反射 | 12447 (1182) | 22857（2237） | 9052 (891) | | 多重性 | 5.6 (4.2) | 7.8 (5.4) | 6.8 (4.2) | | 完整性（%） | 97.81 (93.66) | 99.69（99.38） | 99.49 (99.11) | | 平均值我/σ(我) | 43.84 (15.55) | 14.02 (3.52) | 24.68 (4.34) | | 威尔逊B类系数（Ω2) | 55.61 | 36.96 | 51.16 | | R（右）合并 | 0.04989 (0.1157) | 0.1532 (0.4495) | 0.09959 (0.402) | | R（右）测量 | 0.05437（0.1299） | 0.1635 (0.4969) | 0.1069 (0.4587) | | R（右）下午。 | 0.02127 (0.0574) | 0.05578 (0.2062) | 0.03773 (0.215) | | 科科斯群岛1/2 | 0.998 (0.987) | 0.992 (0.229) | 0.997 (0.264) | | 抄送* | 1.000 (0.997) | 0.998 (0.61) | 0.999 (0.646) | | 优化中使用的反射 | 12443（1181） | 22857 (2237) | 9050 (891) | | 反射用于R（右）自由的 | 1245 (118) | 2012 (200) | 895 (92) | | R（右）工作 | 0.2191 (0.2719) | 0.2116 (0.3162) | 0.2249 (0.2998) | | R（右）自由的 | 0.2753（0.2955） | 0.2454 (0.3428) | 0.2793 (0.3595) | | CC（工作） | 0.921 (0.857) | 0.940 (0.473) | 0.942 (0.476) | | CC（免费） | 0.873 (0.753) | 0.912 (0.443) | 0.923 (0.324) | | 非H原子数量 | 2918 | 2746 | 2312 | | 蛋白质残留物数量 | 369 | 344 | 292 | | R.m.s.d.，粘结长度（Ω） | 0.003 | 0.003 | 0.005 | | R.m.s.d.，角度（°） | 0.56 | 0.61 | 1.09 | | 拉马钱德兰青睐（%） | 97.5 | 93.2 | 93.3 | | 允许Ramachandran（%） | 2.5 | 5.9 | 6.7 | | Ramachandran异常值（%） | 0 | 0.89 | 0 | | 旋转器异常值（%） | 0 | 0 | 0.4 | | 冲撞得分 | 3.94 | 6.26 | 9.09 | | 平均B类系数（Ω2) | 67.42 | 45.45 | 51.84 | | |
2.4. 异核单量子相关（HSQC）核磁共振实验
使用配备LEAP PAL自动取样器（美国LEAP Technologies）的HDX Manager（美国Waters）进行氢-氘交换。40 µM（M）在10 m内制备d-cGrx1和m-cGrx1M（M）磷酸钾pH值7.0，5 mM（M）添加TCEP用于还原条件样品。用15体积氘化缓冲液（10 m）标记样品M（M）磷酸钾，D2O pD 7.0），并孵育不同时间点：0.33、10、60和240分钟。用等体积的预冷猝灭缓冲液（100 mM（M）磷酸钾，0.1M（M）TCEP，0.4M（M）胍–0°C时pH值为2.66的HCl）。蛋白质在酶固定胃蛋白酶柱（Waters，USA）上消化肽类捕获在预柱（2.1×5 mm，ACQUITY BEH VanGuard）上，并使用C18柱（1×100 mm，ACQUITY BEH，1.7µm；Waters，USA），添加0.1%甲酸的乙腈（5–95%）线性梯度。多肽使用SYNAPT G2-Si进行分析质谱仪使用IMS（Waters，美国）。消化的肽类在未经稀释的样本中发现ProteinLynx全球服务器3.0（美国沃特斯）。为了处理HDX-MS数据，通过使用DynamX公司3.0（美国沃特斯）。
2.5. 热位移分析
将d-cGrx1和m-cGrx1蛋白稀释至0.5 mg ml−1缓冲器中（20 mM（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）NaCl）。加载样品，然后在0.5°C的温度下从25°C加热至85°C，min−1使用圆二色分光光度计（美国俄克拉荷马州俄克拉何马市Jasco）记录222 nm处的圆二色吸收度，并进行归一化，以计算每个蛋白质的熔化温度。
3.结果和讨论
我们确定了三种晶体结构：d-cGrx1和畴摆动结构（命名为β1-掉期和β3-交换）和m-cGrx1–cMsrA复合体[图1(一)，表1]. d-cGrx1的结构表明，在CPHC基序上形成了分子内二硫键，并且它作为二聚体存在于非对称单元。m-cGrx1是通过将解析半胱氨酸突变为丝氨酸（C16S）而产生的，它形成了两种不同的结构域交换构象，一种是在其底物cMsrA存在的情况下(β3-交换）和另一个在过氧化氢存在下(β1掉期）。与其他谷胱甘肽类似，cGrx1由三种α-螺旋线和四个β-薄片，共同构成硫氧还蛋白（Trx）褶皱（Martin，1995)[图1(一)和1(天)，表1]. 我们的结构表明，催化和分解半胱氨酸残基（分别为Cys13和Cys16）形成了二硫键。这与之前对cGrx2的研究一致，该研究表明保守的CPYC基序在氧化条件下形成二硫键（Lee等。, 2014). 先前对cGrx1催化机理的研究表明，它可以以1:2的比例（Kim）直接还原氧化的cMsrA等。, 2015; 李等。, 2015). 在我们的结构中，cMsrA和cGrx1形成了一个异六聚体，其中m-cGrx1-四聚体与每个cMsrA[图1(b条)和1(c（c）)，表1]. m-cGrx1四聚体由两个二硫二聚体（亚单位实验室和光盘)，其中的亚单位A类和C类保持正常三级构造，而其他两个亚单位(即亚基B类和D类)形成了域摆动结构（图2). 这个β特别是3域交换是通过交换形成的β三，β4和α3个。令人惊讶的是，cGrx1的结合界面并不接近cMsrA的活性位点半胱氨酸，这表明这种结合与其活性无关，除非在催化之前发生了重大的结构变化。总的来说，我们的晶体结构表明cGrx1形成不同的二聚体，其特征是不同类型的分子间相互作用。d-cGrx1通过非共价相互作用形成二聚体，包括几个氢键。相反，m-cGrx1四聚体通过二硫键形成二聚体（图2). 在四聚体中β3交换结构表明，通过解开位于α2螺旋和β3张纸，用于分离β1和β3[图2(b条)和2(c（c）)]。尽管如此，除了铰链环和催化半胱氨酸（Cys13）外，这两个域摆动的m-cGrx1分子与其他两个m-cGrx1分子以及d-cGrx1分子保持着相同的整体结构。尤其是催化Cys13在d-cGrx1和β3-swap结构。d-cGrx1的Cys13与其分解的半胱氨酸形成二硫键，该键指向内侧，而β3-交换结构向外延伸，与另一cGrx1形成二硫键[图2(天)].
![[图1]](lz5041fig1thm.gif)
| 图1
d-cGrx1、m-cGrx1和m-cGrx1–cMsrA复合体的结构。(一)d-cGrx1以青色显示（左），m-cGrx的域摆动结构以洋红显示(β3-掉期；中间）和橙色(β1-掉期；右侧）。(b条)异六聚体状态包含两个cMsrA分子和四个cGrx1分子：cMsr a呈绿色，cGrx 1的一个域摆动二聚体呈蓝色和紫色，cGr x 1的二硫二聚体为米色。cMsrA的催化袋（CP）用黄色圆圈表示。(c（c）)单硫醇cGrx1–cMsrA络合物的杂六聚体示意图。cGrx1和cMsrA之间的接口标记在半透明的框中，二硫化物桥显示为红线。(天)单体d-cGrx1由三个组成α-螺旋线(α1,α2和α3） 和四个β-板材(β1,β2,β3和β4). d-cGrx1的N端和C端分别标记为N和C。Cys13和Cys16形成一个二硫键，用棒子表示。 |
![[图2]](lz5041fig2thm.gif)
| 图2
β3 m-cGrx1的域摆动结构。(一)m-cGrx1的整体四聚体结构。m-cGrx1的二硫二聚体以米色显示（亚单位A类和C类)m-cGrx1的域摆动二聚体显示为紫色和蓝色（亚单位B类和D类). 红色箭头表示亚单位之间的分子间二硫键A类和B类(b条)域摇摆m-cGrx1单体交换β三，β4和α3相互连接，并通过铰链环连接。(c（c）)β3域摆动的m-cGrx1结构（蓝色）表明第三系结构与d-cGrx1（米色）相比，铰链环处于α2和β3. (天)域wapped m-cGrx1和d-cGrx1催化半胱氨酸（Cys13）的比较。重叠的域摆动m-cGrx1（蓝色）和d-cGrx1-（米色）表明催化半胱氨酸（Cys13）的取向不同。二硫二聚体m-cGrx1以灰色显示。答2F类o（o）−F类c（c）电子密度图显示在二硫键上。域摆动的m-cGrx1（蓝色）和二硫二聚体m-cGrx1形成二硫键桥。第2个F类o（o）−F类c（c）电子密度图显示为2.0σ. |
为了验证观察到的结构域交换，我们进行了核磁共振波谱分析。基于我们之前对m-cGrx1（Lee）的3D核磁共振分析等。, 2012)，d-cGrx1和m-cGrx1均标记有15N，我们测量了他们的2D[1H、，15N] -HSQC光谱（图3). 而HSQC光谱15无论是否存在二硫苏糖醇（DTT），N-m-cGrx1都是相同的15N-d-cGrx1在有DTT和无DTT的光谱中表现出多峰位移（对比图3(c（c）)和3(天)]。这表明d-cGrx1中形成的分子内二硫键诱导了与还原cGrx1不同的构象。接下来，两者15在室温下，将N标记的cGrx1s与cMsrA和蛋氨酸亚砜（Met-O）孵育1 h，并收集每个混合物的HSQC光谱。The overall peaks of15N-d-cGrx1不变[补充图S1(一)]. 另一方面15N-m-cGrx1根据cMsrA/Met-O以剂量依赖性方式改变[补充图S1(b条)]. 更重要的是，添加DTT后，HSQC光谱恢复为（还原）m-cGrx1单独的光谱[补充图S1(c（c）)]表明m-cGrx1在溶液中与cMsrA形成低聚物或络合物，由分子间二硫键的形成触发。这些结果以及Grx1单独的结果表明，（氧化的）m-cGrx1与cMsrA络合的构象不同于d-cGrx1和还原的m-cGrx1，支持X射线晶体学观察到的畴摆动构象(补充图S1).
![[图3]](lz5041fig3thm.gif)
| 图3
二维[1H时，15N] -在Bruker Avance 800 MHz核磁共振波谱仪上记录的298 K下d-cGrx1和m-cGrx1的HSQC光谱。(一)d-cGrx1。(b条)m-cGrx1。(c（c）, 天)二维[1H、，15N] -cGrx1有无DTT的HSQC光谱。(c（c）)在没有DTT的情况下，d-cGrx1显示为蓝色，在有DTT（5 m）的情况下显示为d-cGrx1M（M）)以红色显示(天)在没有DTT的情况下，m-cGrx1显示为蓝色，在有DTT（5 m）的情况下显示为m-cGrx1M（M）)以红色显示。 |
在溶液中，m-cGrx1可以不含cMsrA的多元形式存在（图3)这可能是域摆动结构(β1-交换）（图4，表1). HSQC核磁共振波谱也支持溶液中畴摆动结构的形成(补充图S2). 就像β3交换配置β1-交换构型形成了一个四聚体，其中两个单体进行了结构域交换，而另两个保持不变[图4(一)]。然而，与β3互换结构β通过交换β1股，通过部分展开α1螺旋在各自的域交换伙伴中[图4(b条)和4(c（c）)]。由于这种结构域交换，单体通过不同于在β3互换结构。根据我们的结构，至少有两种m-cGrx1的域摆动构型含有二硫键。一种蛋白质，即m-cGrx1，采用两种可选的域摆动构象？我们希望答案与α1个螺旋。在cMsrA–cGrx1六聚体中，m-cGrx1通过两个不同的接口（接口A类和B类分别），这两者都涉及α1个螺旋[图1(c（c）)和补充图S3(一)]. 在这些接口上α1螺旋参与与cMsrA的相互作用。然而，在四聚体m-cGrx1-only构象中，形成完整的α1螺旋因与来自域交换伙伴的扩展环残基的相互作用而受阻[补充图S3(b条)]. 例如，展开区域的Asn11、Thr12、Cys13和His15α1与其他单体的His15、Phe66、Val53和Met51相互作用。的Glu25和Asn26α1还与Lys43和Lys46形成氢键α分别来自其他单体的2个螺旋[补充图S3(b条)]. 最后，His15的羰基O原子和C16S的侧链在域摇摆单体之间发生氢键相互作用[补充图S3(b条)]。
![[图4]](lz5041fig4thm.gif)
| 图4
β1 m-cGrx1的域摆动结构。(一)结构域交换的m-cGrx1分子（亚基B类和C类)以红色和橙色以及二硫化物二聚体m-cGrx1分子（亚单位A类和D类)以灰色和黑色显示。红色箭头表示亚单位之间的分子间二硫键A类和C类(b条)铰链环位于β1和α1. (c（c）)d-cGrx1和β1个域交换的m-cGrx1。这个β1 domain-swapped m-cGrx1（橙色）表明三级构造与d-cGrx1（米色）相比未缠绕，铰链环位于α1和β1α1个螺旋部分展开。 |
我们在还原和氧化条件下对d-cGrx1和m-cGrx1进行了HDX实验。在HDX实验中，我们获得了d-cGrx1和m-cGrx195%以上的序列覆盖率，只有少数例外（图5,补充图S4和第5章). HDX研究比较了d-cGrx1和m-cGrx1，结果表明，与d-cGrx相比，m-cGrx的氘吸收显著增加，尤其是在β-薄板(β1,β3） 和α-螺旋形的(α1,α3） 区域（图5和补充图S5). m-cGrx1中氘水平的增加是由于一个开放的、可溶剂进入的动力学结构。在用三（2-羧乙基）膦（TCEP）处理以模拟还原形式后，氘吸收在β-薄板(β1,β3） 和α-螺旋线(α1,α3） d-cGrx中的区域而非m-cGrx[图5(c（c）)和补充图S5]表明d-cGrx1的CPHC基序中二硫键的减少使三级结构。然而，经TCEP治疗后，m-cGrx1的氘摄取量降低[图5(c（c）)和补充图S5]. m-cGrx1的二硫二聚化可能降低了其动态结构，包括结构域交换。之间的结构变化β1和β在域摇摆m-cGrx1的两种晶体结构中都经常观察到3个，β3互换和β1-交换，表明二硫键对cGrx1的结构域交换构型至关重要[图5(b条)和5(c（c）)]。m-cGrx1中氧化形式的5–17肽的氘摄取量低于其他条件下的摄取量，这表明蛋白质-蛋白质相互作用受到结构域交换的调节。域交换的六聚体cMsrA–m-cGrx1是第一个报道的具有异齐聚体域交换的结构。到目前为止，硫醇只有两种域摆动结构氧化还原酶已报道，即硫氧还蛋白（Trx）金黄色葡萄球菌（加西亚-皮诺等。, 2009)和NrdH-氧化还原蛋白产氨棒杆菌（Stehr&Lindqvist，2004年). 然而，从这些结构来看，尚不清楚哪些因素，例如特定残基的突变，能够实现结构域交换。这与m-cGrx1的情况不同，其中域交换是由分子间二硫键的形成触发的，而不是由于铰链环干扰蛋白质的单体构象。这一发现得到了证实，包括结构域交换在内的构象变化只有在催化半胱氨酸残基被氧化时才能检测到。此外，d-cGrx1中没有域交换配置。综上所述，这些结果表明m-cGrx1的域wapped构型独立于铰链环序列，是由于二硫键的改变而改变整个蛋白质的自由能结构而形成的。对d-cGrx1和m-cGrx1热稳定性的比较也揭示了结构稳定性与分子内二硫键的发生之间的关系(补充图S6). 热去折叠转变的CD光谱数据表明，d-cGrx1比m-cGrx1更稳定(补充表S1). d-cGrx1的热展开特征是焓47.35 kcal-mol的变化−1在熔化温度（69.12°C）下，而m-cGrx1为50.34 kcal mol−1熔化温度（53.42°C）。总之，使用HDX我们证明了分子间二硫键对于域交换和维持三级构造cGrx1。域交换已通过2D在解决方案中验证[1H、，15N] -HSQC核磁共振波谱。总之，本研究表明，m-cGrx1的单一突变可以诱导多个域跳跃构象，从而形成交替的分子间二硫键。我们相信，这些发现为我们更好地理解域翻转机制提供了帮助，并为蛋白质工程提供了新的范例。
![[图5]](lz5041fig5thm.gif)
| 图5
氘对d-cGrx1和m-cGrx1的吸收。(一)d-cGrx1和m-cGrx1的单体结构根据相对氘化水平的差异着色。红色或蓝色阴影分别反映了TCEP存在和不存在时较高或较低的氘吸收。(b条,c（c）)选定的吸力曲线肽类d-cGrx1和m-cGrx1。计算每个肽的相对氘摄取量、时间点和条件，并绘制标记时间。误差条表示跨时间点和复制观察到的平均标准偏差。 |
致谢
我们感谢大韩民国PAL的BL11C光束线、日本Photon工厂的BL-1A光束线和日本SPring-8的BL44XU光束线的工作人员，感谢他们在X射线数据采集方面的出色设施和协助。我们还感谢韩国大田韩国基础科学研究所使用圆二向色分光光度计。
资金筹措信息
这项工作得到了韩国科学部资助的国家研究基金会项目拨款（2018R1A44A1022589、2020R1A2C2005670和2019R1I1A1A01056）的支持。
参考文献
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