2.1. 样品制备

从Sigma–Aldrich（A3660）中获得马脾脏的脱铁蛋白，并将其透析至靶缓冲液{20 mM（M）HEPES[4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸]，150 mM（M）氯化钠pH值7}。大肠杆菌核糖体在50m内制备M（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）KAc（醋酸钾）和8 mM（M）醋酸镁₂（醋酸镁）。如前所述制备猪心室纤丝（Siemankowski&White，1984)并稀释至10µM（M）10米M（M）MOPS[3-(N个-吗啉基）丙基磺酸]pH 7，50 mM（M）KAc，3米M（M）氯化镁₂和1米M（M）使用前EGTA。用于印迹/喷雾实验的G-actin根据Peter Knight教授（个人通信）的协议聚合。对于吸墨剂/喷雾试验，30µM（M）将脱铁蛋白（24-mer）喷涂到用2µM（M）F-actin（3µl，4 s印迹时间）。对于脱铁蛋白和细丝的混合/喷涂实验，30µM（M）脱铁蛋白和10µM（M）使用细丝并以1:1的比例混合。对于肌动球蛋白分离实验，20µ的溶液M（M）24µ的细丝M（M）肌球蛋白Va（1IQ）S1（10m）M（M）MOPS pH值7，50 mM（M）KAc，3米M（M）氯化镁₂和1米M（M）将EGTA与含有0、0.016、0.16或1.6 m的缓冲液快速混合（1:1）M（M）ATP（使最终ATP浓度为0、8、80和800µM（M））。

2.2. 网格准备

在喷洒/插入冷冻格栅之前，对所有注射泵进行初始化，并对生成的喷雾进行目视检查。压缩N₂气体通过水鼓泡以增加喷雾室内的湿度，避免喷雾在飞行中蒸发。使用试验网格调整喷雾器的位置，以确保其对齐。Mark IV Vitrobot的聚苯乙烯泡沫塑料系统用于储存液态氮并储存液态乙烷。控制柱塞速度和N的阀门₂对流量进行调整，以提供通过喷嘴的所需流量和所需柱塞速度。用3×50µl ddH清洗插入式冷冻装置的管子和注射器₂O（纯化水），然后加入3×50µl相应的缓冲液，并装入33µl蛋白质溶液（阀门和喷雾器之间的死体积为25–35µl）。Cryo-EM格栅（Quantifol R2/1 Cu网格200–300或Quantifoil R1.2/1.3 Cu网格300）在Cressington 208碳涂层机中使用空气等离子体辉光放电90 s（10 mA/0.1 mbar气压），并在30 min内使用，以避免格栅的亲水恢复。为了准备网格，将握有网格的负压镊子安装在仪器的插入臂中，关闭仪器的环境室，使湿度达到≥80–90%。然后，将33µl蛋白质溶液装入100µl玻璃注射器（Kloehn）中。将乙烷杯置于目标位置，打开高压。使用软件控制系统控制流速和时间。通常，以8.3µl s的速度喷涂溶液⁻¹在浸入喷雾之前，保持3.5秒（以稳定喷雾）。向活塞施加0.5–2.5巴的压力，使格栅加速并在不到0.1 s（距离：4 cm）的时间内到达喷雾。格栅穿过喷雾，在剩余的3 cm处进一步加速至乙烷表面，并通过机械挡块终止，使格栅位于液态乙烷表面以下约1 cm处。

然后将格栅转化为液体N₂并保存至筛选。对于混合/喷雾技术，使用了两个注射器，每个注射器中有一个反应物，流速相应降低到4.2µl s⁻¹每个注射器的总流速相同。对于吸墨剂和喷雾技术，将3µl的第一个蛋白质样品放置在网格上，然后用两条Whatman 43滤纸将其吸墨剂4s.吸墨纸吸墨纸后，吸墨纸缩回，格栅穿过喷雾（在吸墨纸步骤中启动，以确保稳定）进入液态乙烷。完成所有实验后，用缓冲液和水清洗注射器和管子。

2.3. 数据收集和处理

所有的低温电子显微镜成像都是在FEI Titan Krios显微镜上进行的，该显微镜配备了以积分模式运行的Falcon III直接电子探测器（阿斯伯里生物结构实验室）。主要数据采集和处理参数列于支持信息中的表S1。所有处理均使用RELION公司2.1（基马尼乌斯等。, 2016)和RELION公司3β（齐瓦诺夫等。, 2018). 对于所有三个数据集，处理如下：使用RELION公司3实施运动Cor2（郑）等。, 2017)然后使用Gctf公司（张，2016). 对于脱铁蛋白和核糖体，自动颗粒挑选的参考依据是从少量手动选择的颗粒中获得的类别平均值。手动检查基于模板的自动拣选结果。然后，使用二维分类选择具有高分辨率信息的粒子，并将其向前推进以生成初始三维重建。经过两轮CTF精炼并得到贝叶斯粒子抛光的最终重构结果。提出的结构通过局部分辨率进行过滤。

对于核糖体数据集，使用六类3D分类来筛选50S亚基，将粒子数从47 866减少到34 010。对于薄膜数据集RELION公司采用了螺旋加工工具（He&Scheres，2017). 所有细丝都是人工采摘的。作为初始模型，肌动蛋白的60º低通滤波结构（PDB入口500万; 保罗等。, 2017)或者使用无特征的圆柱体。两者的结果与低通滤波PDB模型几乎相同，导致分辨率略高。CTF公司精炼在这种情况下没有发现有益的作用。对最终重建进行8类3D分类，以提取含有原肌球蛋白的结构（9496个颗粒）精炼分辨率为10.4º。这两种结构的螺旋对称性均使用了扭曲和上升的精确值relion_helix工具箱程序。傅里叶壳层相关性由两个半映射金标准方法确定，其曲线如所示支持信息中的图S1.

2.4. 搅拌机设计

搅拌器/喷雾器由标准高性能材料制成液相色谱法配件和管道，以及来自10µl Gilson吸管尖端的空气尖端(图S2). 喷头[图S2(一)]由2–3 mm长的150/40µm聚酰亚胺涂层石英管（Molex）制成，用聚丙烯酸酯胶粘合到360/180µm管中。将360管子密封在外径（OD）为1/16〃、内径（ID）为0.015〃的氟化乙丙橡胶（FEP）管子（Upchurch）中。喷嘴位于空气喷嘴末端上方0–0.5 mm处。通过一根0.007〃的短铂丝与高压连接，该铂丝用于通过外径为1/16〃、内径为0.01〃的FEP管的“T”接头与溶液接触。通过改变低压直流电源（Celex BPS1510）的输入，高压电源的电压可以在2至10 kV之间变化连接至EMCO Q101N-5高压变频器。高电压是使用数字电压表（Radio Shack）从100 MΩ–100 KΩ电压分配器电路的100 KΩ部分的电压测量得到的。注射泵的阀门和活塞以及支撑EM栅极的镊子均接地，以防止杂散高压可能造成的损坏。

对于混合装置[图S2(b条)]，使用两个同心管（360/200µm和165/100µm）（Molex），以便在喷涂之前不会混合两种溶液。FEP管（0.007〃ID 1/16〃OD）用于密封内部165µm毛细管。将内管放置在距离喷嘴起点100–200µm的位置，以将死时间。混合器的几何形状近似于双背靠背“T”混合器的几何形状。

3.1. 设置的优化

本工作中描述的修改设置（图1)基于先前的设计（白色等。, 2003)已对其进行了大量重大调整，增加了湿度室，优化了喷雾器设计，以提供高效混合和雾滴尺寸。通过更好地描述液滴速度和大小，以及收集每个网格的Atlas低倍视图以更好地评估冰厚和一致性，实现了这些改进。为了改善喷雾分布并产生细小的液滴气溶胶，使用5kV电位进行电压辅助喷雾，这与仅使用空气压力的标准喷雾相比具有显著优势。通过这种方法，可以更严格地控制喷雾行为，以获得最佳冰厚，同时需要更少的样本。电压辅助喷涂产生的液滴带有很高的电荷，可以促进液滴的自我分散并防止液滴的凝聚（贾达夫等。, 2011). 此外，湿度控制室用于提供可重复的条件，并确保微滴喷雾不会蒸发到EM网格。该系统通过计算机控制的注射器驱动器（Kloehn 50300系列）操作，该驱动器控制喷雾的时间和流量，此外，还提供了样品吸墨和浸入的软件控制。在之前的审查中详细描述了基本设计（Kaledhonkar等。, 2018).

图1 TrEM设备的当前设置。(一)完整仪器概述，其中显示了聚苯乙烯泡沫塑料冷冻杯，其中装有液体乙烷（I）、注射泵（II）、高压模块（III）、计算机控制器（IV）、柱塞上的镊子（V）、吸液臂（VI）和喷雾器（VII）。(b条)放大后的喷雾室显示了喷嘴（VIII）、吸污臂（VI）、带格栅的镊子（IX）、聚苯乙烯泡沫塑料液氮支架（X）内的乙烷杯，以及格栅插入前打开的端口，限制了乙烷液体暴露在室内潮湿空气中（XI）。

与传统吸墨纸一样，格栅表面的等离子处理是减少碳涂层格栅固有疏水性的关键步骤；除此之外，很少有液滴粘附在网格上。除了混合时间外，网格的插入速度还用于改变实验的延迟时间和时间分辨率。在我们的装置中，我们使用双腔空气活塞（图1)为了吸附格栅（VI），将格栅加速至液态乙烷（I）中，并打开和关闭端口开口（XI）。为了更好地定义网格可以下倾的参数和速度，使用了一系列气压（0.5–2.5 bar），产生了1至3 ms之间的下倾速度⁻¹(请参阅支持信息中的电影S1).

我们最初研究了TrEM装置产生具有足够质量冰的网格的能力，以及收集能够产生高分辨率结构的低温EM数据的能力。使用三种不同的模型系统（脱铁蛋白、核糖体和细丝）来研究将蛋白质样品喷洒到快速移动的辉光放电EM网格上的能力。每个系统的数据都是从单个网格中收集的，使用Falcon 3探测器在夜间（～12小时）以积分模式运行。从概览图像中，我们观察到约20–50%的网格表面积被水滴覆盖。虽然许多水滴产生的冰太厚，无法进行数据采集，但网格显示了许多适合成像和后续高分辨率的冰区结构测定(图S3). 对于每个样品，这会产生约1800个孔，其中有合适的冰用于成像，每个孔可以进行多次曝光，每个网格最多可以拍摄6000张显微照片(见表S2). 对于脱铁蛋白，共收集了1772张显微照片，重建后的整体分辨率为3.6º[图2(一)和2(b条)]. 对于大肠杆菌核糖体，收集了1494张显微照片，其中34 010个粒子参与了最终重建，整体分辨率为4.3º[图2(c（c）)和2(d日)]并显示了广泛的角度方向采样[图S1(c（c）)]. 对猪心脏细丝进行了研究，以探讨该装置对细长丝状颗粒的适用性。由此产生的网格显示，试样在孔内分布良好，没有灯丝长度方面的损坏迹象[图2(c（c）)]. 由此产生的细丝的肌动蛋白核的重建被分解为5.6Å，整个细丝具有较低的分辨率[10.4Å，图S1(b条)]因为附着的原肌球蛋白的异质性。在所收集的显微照片中，有相当数量的照片进入了最终重建阶段，这表明冰中的一致性分别为～86%、97%和100%，这些照片中的粒子进入了脱铁蛋白、核糖体和F-actin的最终重建阶段[图S4(一)]. 对冰的层析分析表明，冰的厚度在80到125纳米之间，这超出了理想值，限制了数据的分辨率。此外，对所有收集的显微照片进行的Thon环分析表明，主峰位于3至5℃之间[图S4(b条)]. 由于脱铁蛋白数据集的分辨率不受粒子数限制（>800000个非对称单位），冰厚是分辨率的主要决定因素，我们得出结论，需要更薄的冰才能获得>3.5º的分辨率。然而，值得注意的是，即使分辨率小于3.5°，快速混合和喷雾的能力也可以为蛋白质机制和循环提供新的见解。

图2 在TrEM设置上准备的网格中的三个模型系统的结构。为了测试我们通过在快速移动的垂直网格上喷涂蛋白质来制作高质量EM网格的能力，我们测试了三个样品，并用代表性的显微照片和3D重建显示了数据：(一,d日)大肠杆菌核糖体（0.72µM（M）50米M（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）KAc，8米M（M）醋酸镁2), (b条,e（电子）)脱铁蛋白[30µM（M）（24毫米），20米M（M）HEPES pH 7.5，150 mM（M）氯化钠]，以及(c（c）,（f）)猪细丝[5µM（M）（肌动蛋白单体）10 mM（M）MOPS pH值7，50 mM（M）KAc，3米M（M）氯化镁2，1米M（M）EGTA]。中的比例尺(一), (b条)和(c（c）)表示50 nm。中的比例尺(d日), (e（电子）)和(（f）)表示5 nm。

3.2. 下落和液滴速度的估算

在混合喷雾型实验中，如果我们知道柱塞臂的速度、移动的距离和离开混合器/喷雾器后液滴的速度，就可以计算出混合基质相互作用的总时间。气动插入臂的速度使用线性电位计。尽管如此，应注意的是，随着格栅向乙烷容器移动，柱塞持续加速，但在喷射点达到接近最大速度。因此，该测量是对喷嘴位置处速度的单一测量，它只会略微低估整体下落速度。在喷雾锥中心点和乙烷表面之间保持3 cm的恒定距离的情况下，我们计算了样品应用后格栅到达乙烷的时间在30到10 ms之间（对于0.5–2.5 bar的压力范围）[图3(一)]. 液滴速度是根据喷嘴尖端以及距离喷嘴4 mm处喷射液滴的高速视频记录计算的[图3中的绿色/蓝色正方形(b条)]. 两种产生的液滴速度均大于4ms⁻¹[图3(c（c）)]. 我们还观察到水滴离开喷雾器时的加速度。尖端/栅格距离为6-15 mm时，这相当于最慢液滴和最长距离的飞行时间≤4 ms。更高的滴速导致粘附在格栅上的液滴更少，电流设置的最短延迟相当于从液滴离开喷嘴到在格栅上玻璃化的约11 ms（典型滴速为6 ms⁻¹喷雾器到格栅的距离为6 mm，喷雾器到乙烷的距离为3 cm）。对高速视频上的液滴进行的分析显示，其直径约为75µm[图3(c（c）)]. 这比之前报告的（1µm）要大得多，后者使用了电喷雾（白色等。, 2003)而不是电压辅助喷雾，而是产生适合高分辨率数据采集的冰。

图3 测量柱塞和液滴速度。(一)压力和柱塞速度之间的关系，线性拟合：速度（ms−1)=～1.5×压力（bar）。(b条)一个液滴速度箱线图，在每个位置至少三帧内跟踪十个不同的液滴，在喷嘴（0 mm）和4 mm距离处测量(c（c）)喷头的显微图像（红色，标尺200µm）、液体喷射的破裂点（灰色，标尺100µm，距离毛细管尖端4 mm（蓝色，标尺00µm。

为了检验新仪器在制备时间分辨样品方面的适用性，我们使用几种不同的方法验证了混合能力。第一种方法是传统地将含有第一种蛋白质的网格涂抹，然后将涂抹的网格通过含有第二种蛋白质的电压辅助喷雾(电影S2). 通过移除停滞时间与混合室和液滴飞行时间有关，蛋白质在网格上沉积和冻结之间的时间延迟为～10ms，并且仅取决于喷雾器和液态乙烷之间的距离（3cm）和喷射速度（≤3ms）⁻¹). 肌动蛋白丝在网格上预先印迹（印迹时间4 s），然后通过电压辅助的脱铁蛋白喷雾。样品质量良好，共定位清晰[图4(一)]. 第二种方法是在电压辅助喷雾之前，在毛细管内混合载脂蛋白和细丝，得到的冰显示两种样品在所有研究区域都有明显的混合[电影S3和图4(b条)]. 喷洒前额外体积导致的附加延迟时间为1–2 ms，从喷洒跳闸到格栅的飞行时间测量值小于4 ms，导致总延迟约为15尽管这两种方法都提供了有希望的结果，并显示出明确的共同定位，但下一步是提供明确的混合证据。为了实现这一点，我们通过将肌动球蛋白S1与不同浓度的MgATP混合，将两个样品快速混合并玻璃化，MgATP以二阶速率常数共10页⁶ M（M）⁻¹ 秒⁻¹（Siemankowski&White，1984年). 0、8、80和800µ混合约15 ms后S1与肌动蛋白的分离程度M（M）MgATP预计分别为0、10、70和>99%。通过保持柱塞速度，使TrEM装置的工作延迟约15 ms，显微镜中观察到的灯丝装饰与预期一致，表明两种溶液在冷冻前混合了约15 ms[图4(c（c）)]. 目前正在进行调查，以确定腔室内的混合程度，临时模型表明，大部分混合可能发生在飞行中的液滴内。随着样品混合时间和飞行时间的增加，此方法的近似时间分辨率在10–15 ms范围内。使用精细微流体混合器，可以在喷洒混合样品之前实现更完全的混合。

图4 在TrEM装置上快速混合样品。(一)具有代表性的显微照片，细丝被吸干，脱铁蛋白喷在随后的凹陷网格上(b条)脱铁蛋白和细丝快速混合并直接喷涂到EM网格上的代表性显微照片(c（c）)在0、8、80和800µ的快速混合（～15 ms）后，肌球蛋白S1修饰细丝的四个代表性图像M（M）MgATP显示装饰与动力学模型预测的一致（分别为0、10、70和99%）。