2.1. DRS–AIMP2-DX2-S34–EPRS的克隆、表达和纯化_消费税三元配合物

N端截断的人类DRS（残基Ala21–Pro501）、一种N端截断且缺少外显子2的人类AIMP2剪接变异体（残基Ser34–Gln45和Asp115–Lys320，命名为AIMP2-DX2-S34）和C端截断的人EPRS_消费税使用PCR扩增（Met1–Gln157）。将每个基因克隆到pET-28a（+）载体（Novagen）中，以包含N端、C端和C端His₆标签。DRS、AIMP2-DX2-S34和EPRS_消费税将克隆质粒分别转化到Rosetta2（DE3）pLysS、BL21-CodonPlus（DE3大肠杆菌菌株。转化细胞培养16个 h在无诱导的Luria肉汤培养基中用作放大混合培养中的种子。三个未被引入大肠杆菌含有DRS、AIMP2-DX2-S34或EPRS的种子_消费税将质粒汇集到放大培养基中，得到总种子比为1:50的培养基。放大培养的细胞在Luria肉汤培养基中生长，并用0.5 米M（M）异丙基β-D类-OD处的1-硫代吡喃半乳糖苷_600 纳米0.5，然后在20°C下进一步孵育16 h.在含有20 米M（M）Tris–HCl pH 7.5500 米M（M）氯化钠，35 米M（M）咪唑，1 米M（M）苯甲基磺酰氟。35℃离心去除细胞碎片 000克对于50 在4°C条件下进行min，然后用0.22过滤上清液 µm过滤器，用于去除细胞碎片和任何聚集的蛋白质。将过滤的上清液应用于HiTrap螯合HP柱（GE Healthcare）上，该柱与裂解缓冲液平衡亲和层析。通过六柱体积洗脱，使用由20组成的洗涤缓冲液从HiTrap螯合HP柱中去除未结合或弱结合蛋白 米M（M）Tris–HCl pH 7.5500 米M（M）氯化钠，50 米M（M）咪唑。通过逐渐增加由20 米M（M）Tris–HCl pH值7.5500 米M（M）氯化钠，500 米M（M）咪唑。洗脱的蛋白质样品通过以下方法进一步纯化尺寸排除色谱法在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱（GE Healthcare）上，用50个缓冲液进行平衡 米M（M）HEPES–NaOH pH 8.0，200 米M（M）氯化钠，5 米M（M）DTT，1%(v（v）/v（v）)甘油。纯化的DRS–AIMP2-DX2-S34–EPRS_消费税复合物浓缩至6.0 毫克 毫升⁻¹用于结晶。

磷化烧蚀剂（AIMP2_消费税S156A）和磷光体（AIMP2_消费税使用QuikChange II site-directed mutagenesis Kit（安捷伦科技公司）通过定点突变将S156D和S156E）突变引入AIMP2-DX2-S34，并如上所述纯化蛋白质。

纯化DRS的金属分析–AIMP2-DX2-S34–EPRS_消费税复合物是通过感应耦合等离子体进行的质谱法（ICP-MS；820MS，耶拿分析）。

2.2. 结晶和结构测定

DA2E亚复合物的初始晶体是在22°C下通过坐滴蒸汽扩散法生长的，方法是在6.0的温度下混合等体积的蛋白质 毫克 毫升⁻¹和由1.2组成的结晶溶液 M（M）磷酸钠一元，0.8 M（M）磷酸二氢钾，0.1 M（M）瓶盖pH 10.5,0.2 M（M）硫酸锂。通过混合等体积的蛋白质溶液和由1.3组成的结晶溶液，使用吊滴蒸汽扩散法对DA2E晶体进行优化，以在22°C下进行X射线数据采集 M（M）磷酸二氢钠，0.5 M（M）磷酸二氢钾，0.1 M（M）瓶盖pH值10.5,0.5 M（M）以初始晶体为种子原料并添加0.015的硫酸锂 米M（M）细胞色素-7。

坐滴中生长的晶体已经被储存溶液低温保护，并在100的氮气气流中闪蒸冷却 K.从晶体到3.6收集数据 奥分辨率。使用香港（HKL）-2000套房（Otwinowski&Minor，1997年). 这个晶体结构DRS–AIMP2-DX2-S34–EPRS的_消费税由确定分子置换具有摩尔代表（Vagin&Teplyakov，2010年)使用DRS、AIMP2和EPRS的精细结构_消费税作为阶段模型。

晶体结构的建模是用库特（埃姆斯利等。, 2010)以及其他精炼于实现洛雷斯特（科瓦列夫斯基等。, 2016)和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)在中中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011)和中菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012). 在手动分配Zn之前，仔细分析了模型DA2E复合体周围发现的额外电子密度²⁺离子、磷酸盐离子或水分子。锌²⁺根据我们的ICP-MS结果和DRS–tRNA的结合模型，对离子和大多数磷酸盐离子进行了建模^天冬氨酸根据酵母DRS–tRNA的结构预测^天冬氨酸复杂（PDB条目1个系统; 鲁夫等。, 1991)分别是。对于水分子的建模，有几个代表性的程序，例如库特,REFMAC公司5和菲尼克斯定义，已经实现，但无法分配程序通常确认的水分子。因此，只有12个水分子通过迭代放置和后续确认手动分配精细化。晶体结构的验证在摩尔概率（陈）等。, 2010)和PDB验证服务器。数据收集和细化统计在表1中进行了总结DA2E亚复合体的坐标和结构因子已存储在蛋白质数据库中(https://www.rcsb.org)带代码6年6月.

3.1.体外MSC亚复合物形成：尝试获得稳定成分

为了阐明MSC的整体结构，我们尝试纯化和结晶与DRS相关的各种MSC亚复合物，其结构已经确定（Kim等。, 2013). 在MSC成分中，已知AIMP2的C末端结构域结合DRS（Quevillon等。, 1999)，但AIMP2和DRS之间的实际交互模式仍不清楚。我们观察到DRS与AIMP2、EPRS、MRS和AIMP3的GST结构域形成二元、三元、四元和五元亚复合物。重要的是，我们的试验中包括了一个缺乏外显子2的AIMP2剪接变异体（AIMP2-DX2），因为AIMP2-DV2包含C末端GST结构域。为了获得足够纯度的AIMP2-DX2复合物提取物结构测定，纳入了N末端硫氧还蛋白（Trx）标记。当纯化的Trx-AIMP2-DX2通过与凝血酶孵育进行Trx-tag裂解时，裂解产物似乎具有较小的分子量（～24 kDa）比预期的AIMP2-DX2构造（～28 kDa），通过SDS–PAGE分析（数据未显示）。进一步分析质谱法结果表明，凝血酶治疗去除了AIMP2-DX2蛋白的N末端肽段和Trx标记。通过N末端测序，我们确认了切割的AIMP2-DX2的前五个N末端残基是Ser-Tyr-Gly-Pro-Ala，对应于AIMP2的残基34-38。我们将其命名为AIMP2的33-氨基酸突变体AIMP2-DX2-S34。在从人类细胞培养物（Park等。, 2015)从而证明我们将AIMP2-DX2-S34纳入MSC子复合物的试验是合理的。

由于AIMP2-DX2-S34结构在溶液中比全长对应的AIMP2-DX2结构更稳定，因此它与DRS、EPRS一起用于MSC亚复合物的形成_消费税、AIMP3和MRS_消费税，每个都有N端或C端His₆标签[图1(一)]. 携带每个蛋白的质粒被克隆到单独的表达菌株中，然后将表达菌株收集在一起进行扩大培养。这些蛋白质只允许在细胞超声破碎后形成复合物。然而，蛋白质稳定地形成如下MSC亚复合物，如通过尺寸排除色谱法和SDS-PAGE分析[图1(b条)]：DRS–AIMP2-DX-S34（DA2），DRS–AIMP2-DX2-S34–EPRS_消费税（DA2E），DRS–AIMP2-DX2-S34–EPRS_消费税–AIMP3（DA2EA3）和DRS–AIMP2-DX2-S34–EPRS_消费税–AIMP3–MRS_消费税（DA2EA3M）。在纯化的四个MSC亚复合物中，DA2E亚复合物（～192 kDa）成功结晶用于结构测定。

图1 DRS–AIMP2的结构和组装消费税–EPRS公司消费税MSC的子复合体。(一)DRS、AIMP2、EPRS、AIMP3和MRS的域组成（顶部），以及本研究中使用的结构的表示（底部）。(b条)尺寸排除色谱法MSC子复合物DA2、DA2E、DA2EA3和DA2EA3M的分析。插图：最高峰值的SDS-PAGE分析。(c（c）)左图：晶体结构MSC的DA2E子复合体的动画表示。DRS（绿色），AIMP2消费税（橙色），EPRS消费税图中显示了（蓝色）和锌原子（灰色）。右：DA2E结构水平旋转90°，显示组件之间的接口。磷酸盐离子表示为棒状模型。（另请参见补充图S1）

3.2、。DRS–AIMP2_消费税–EPRS公司_消费税（DA2E）亚复合物围绕DRS同二聚体定向

我们成功地确定了DA2E的三级络合物结构为3.6 利用DRS和AIMP2的结构通过分子置换（MR）方法拆分_消费税–EPRS公司_消费税二进制复数（PDB条目第4页，共15页和5a34年; 赵等。, 2015; 金等。, 2013)作为定相模型。尽管我们努力通过外显子1区域阐明AIMP2的结构，但只能确定AIMP2对应外显子3和4的GST结构域（残基117-320）(补充图S2). 因此，在下面我们将使用术语AIMP2_消费税而不是AIMP2-DX2-S34来指代蛋白质。DA2E晶体属于空间组 P（P）6₁中包含两个DA2E子复合体非对称单元，每个由两个DRS分子AIMP2组成_消费税和EPRS_消费税.

DA2E组分以双重旋转对称围绕DRS同二聚体中心定向，DA2E的质量中心位于DRS二聚体界面[图1(c（c）)]. 与单独的DRS相比，DA2E复合体中的DRS结构没有表现出明显的结构变化，因为反密码子结合域（残基57–146）和催化域DRS的（残基189-497）可以很好地建模。然而，反密码子结合域和催化域（残基155–178），以及已知结合tRNA的另外两个环区（残基225–248和273–281）^天冬氨酸以诱导的方式（绍特等。, 2000)，由于缺乏电子密度而无法建模[补充图S1(一)]。由于低分辨率限制，DA2E复合物周围的额外电子密度无法清楚识别，因此根据其环境手动分配。DRS二聚体界面上观察到的外球面电子密度由两对His204/Glu208对协调，每对均来自一个单体，并被建模为Zn²⁺根据ICP-MS金属含量分析结果得出的离子(补充图S3). tRNA处观察到的额外电子密度^天冬氨酸-DRS分子的结合位点（催化位点和反密码子结合位点）被模拟为高浓度结晶溶液中存在的磷酸根离子，这似乎模拟了tRNA的磷酸部分^天冬氨酸主干(补充图S4). DRS–AIMP2处观察到的额外电子密度_消费税界面也被建模为与邻近DRS的主链O和N原子相互作用的磷酸根离子。由于这种相互作用似乎没有生物学意义，磷酸根离子仅在以下情况下被引入结晶在体外磷酸根离子可能有助于进一步稳定晶体中的DA2E络合物。由于分辨率限制较低，使用建模程序对水分子建模并没有产生一致的结果。经过仔细的迭代过程，只对十几个水分子进行了建模。

AIMP2型_消费税和EPRS_消费税两者都采用由N端Trx折叠和C端组成的GST折叠α-螺旋子域。EPRS公司_消费税采用标准四股β-表中的Trx子域，而AIMP2_消费税具有额外的肽段（残基148-170），构成链-环-螺旋基序(β2–α2） 跟随螺旋线α1，因此包括特征性的五股β-薄板[补充图S1(b条)]。AIMP2的残留171–179和289–291_消费税在中α2–β3回路和α6–α由于缺乏电子密度，无法分别对7个回路进行建模[补充图S1(b条)].

蛋白质界面、表面和组装(国际学生成绩评估)分析（Krissinel&Henrick，2007）)DA2E子复合体结构中的接口显示，DRS和AIMP2之间的相互作用_消费税主要来源于α7–β9环（残基338–342）和螺旋的C末端αDRS的9（残基383和384）和AIMP2的N末端亚结构域_消费税，包括β-表[图2(一)和2(b条)]. AIMP2之间的相互作用_消费税和EPRS_消费税主要是通过GST结构域的异二聚体化，其中蛋白质通过双重旋转对称相互关联。在以下各节中，将详细描述DA2E子复合体组件之间的接口。

图2 DA2E子复合体组件之间的接口。(一)DA2E结构的总体视图，显示DRS和AIMP2之间的接口消费税以及AIMP2之间消费税和EPRS消费税. (b条)DRS（绿色）和AIMP2之间的交互特写消费税（橙色）。DRS和AIMP2之间的氢键和盐桥消费税用紫色虚线表示。(c（c）)立体显示DRS合并对AIMP2的影响消费税–EPRS公司消费税接口。AIMP2消费税A2E结构（PDB入口5a34年; 白色）叠加在DA2E结构（橙色）上，以显示β4–β5个回路。这个β4–βAIMP2的5环区域消费税从A2E子复合体（红色圆圈）与螺旋碰撞αDRS中的9个以透明卡通表示（绿色）显示。第一个和最后一个残留物β4–β5环路（Lys198和Pro206）分别用青色和红色星形标记。(d日)尺寸排除色谱法DA2复合物形成的Ser156突变体分析。(e（电子）)AIMP2的R.m.s.d.分析消费税DA2E和异二聚体复合体的结构，显示出在β4–β5回路（Lys198–Pro206），在黄色框中突出显示。

3.3. AIMP2的Ser156在DRS和AIMP2之间的相互作用中起着关键作用_消费税通过氢键

DA2E结构显示DRS和AIMP2的绑定接口_消费税平均面积为747.2 Ų根据计算国际学生成绩评估DRS的AIMP2结合基序位于DRS的中间催化域，从DRS二聚体界面分离出来的tRNA^天冬氨酸-结合位点和活性位点[图1(c（c）)]这与ARS在MSC（Mirande等。, 1985).

DRS和AIMP2的复合形成_消费税主要由两个绑定接口介导[图2(一)]. 主界面由Lys338–Pro342之间的多个氢键形成α7–βDRS和His153–Ser156的9个回路β2–αAIMP2的2个回路_消费税[图2(b条)]而另一个界面涉及螺旋αDRS的9和β-AIMP2表_消费税[图2(c（c）)]. 主界面中的环在C之间建立了多重氢键^α主链，这让人想起反平行体的氢键网络β-表。有趣的是，AIMP2的Ser156_消费税似乎在调节DRS和AIMP2之间的相互作用中起着关键作用_{格林威治恒星时。}Ser156的侧链作为氢键供体与DRS的Phe339的主链酰胺基团偶联，而Ser156主链酰胺基与DRS Phe339O的主链形成氢键[图2(b条)]. 此前已证明Ser156暴露于溶剂中并被TGF磷酸化-β发出信号。磷酸化Ser156诱导AIMP2从MSC分离，然后易位到细胞核，在细胞核中AIMP2与Smurf2（Kim等。, 2016).

两个突变体，AIMP2_消费税生成S156D和S156E，以模拟磷酸化Ser156和AIMP2_消费税生成S156A突变体以消除侧链介导的氢键。AIMP2之间的相互作用_消费税突变体和DRS通过尺寸排除色谱法[图2(d日)]. 所有三个AIMP2_消费税突变体不能与DRS形成二元复合物，这表明AIMP2 Ser156侧链的氢键对与DRS的相互作用至关重要，而Ser156磷酸化会瓦解MSC组件。

3.4. DA2E三元络合物伴随着两个GST结构域之间界面1的构象变化

国际学生成绩评估对DA2E结构的分析表明，AIMP2的结合界面_消费税和EPRS_消费税平均面积为1083.3 Ų，大于DRS和AIMP2之间的值_消费税MSC中异二聚体GST结构域之间的相互作用网络先前已被广泛分析，并被指定为接口1和接口2（Cho等。, 2015). 在这里，我们简要描述了AIMP2之间接口1的性质_消费税和EPRS_消费税并深入分析了与异二聚体A2E结构相比，DRS的掺入在其中引起的独特构象变化。

界面1由螺旋的捆绑形成α3和αAIMP2第4页_消费税和α2和αEPRS第3条_消费税它建立了多个分子间氢键和盐桥。当AIMP2的结构_消费税在DA2E子复合体和异二聚体A2E子复合体中（PDB条目5a34年; 赵等。, 2015)经比较，这两种结构在201当量C以上非常相似^α原子，根-平方偏差（r.m.s.d.）为0.87 Å。尽管用于此比较的构造被不同地截断，但GST域结构不受截断的影响。然而，残留Phe199–Pro206的r.m.s.d.非常高，最大C^α偏差8.78 Thr203处的Δ[图2(e（电子）)]. 这些残留物属于β4–β5环，其最后三个残基（Met204-Cys205-Pro206）与螺旋形成疏水接触αEPRS第4条_消费税[图2(c（c）)]. DRS的加入导致了β4–β5回路，其中螺旋线的C端αDRS的9位于β-AIMP2表_消费税[图2(c（c）)，红色虚线圆圈]。从A2E子复合体叠加AIMP2结构[图2(c（c）)，白色]（PDB条目5a34年)到我们的AIMP2上_消费税结构[图2(c（c）)，橙色]显示出螺旋αDRS中的9个占据了β4–β5环路将位于A2E子复杂结构中。的结果国际学生成绩评估分析表明，螺旋上的残基Glu382-Lys383-Tyr384αDRS的9主要与AIMP2的Leu119、Val123和Ile201进行疏水接触_消费税，而β4–βAIMP2的5个回路_消费税夹在DRS和EPRS之间_消费税采用更有序的β-转弯结构[图2(c（c）)，橙色]。C的后续重排^α中坚力量β4–β与异二聚体A2E复合物相比，5环在界面1中引起显著差异。

3.5. 相邻的DA2E子复合体通过两个EPRS之间的接口2桥接_消费税分子

令我们惊讶的是，我们观察到两个EPRS分子_消费税通过接口2进行交互，每个接口都来自非对称单元[图3(一)和3(b条)]. 在EPRS接口2的情况下_消费税和AIMP3（PDB条目4个bvx; 赵等。, 2015)，螺旋的残留物α7和α4–α每个GST域的5个环路通过氢键和盐桥类似地建立了一个复杂的网络[图3(c（c）)]至EPRS_消费税晶体界面。因为EPRS_消费税和AIMP3具有40.1%的高整体序列相似性[图3(d日)]并共享相同的结构域[图3(b条)和3(c（c）)]，可以理解EPRS的外露表面_消费税在没有合法结合伙伴AIMP3的情况下，可通过接口2促进二聚化。

图3 GST域之间通过接口1和2进行交互。(一)一个非对称单元显示出整体的双重旋转对称性。其中一个子复合体以较浅的颜色显示，以区分这两个子复合体。(b条)异二聚体AIMP2的特写消费税–EPRS公司消费税两个DA2E亚复合物的界面处的复合物。AIMP2型消费税和EPRS消费税通过接口1进行交互，而两个EPRS消费税来自相邻亚复合物的分子通过界面2相互作用。(c（c）)异四聚体AIMP2模型结构的特写消费税–EPRS公司消费税–AIMP3–MRS消费税基于DA2E子复杂结构构建，其中AIMP3和MRS消费税分别为紫色和红色（PDB条目4个bvx). 异四聚GST结构域的组装与AIMP2的组装相同消费税–EPRS公司消费税–EPRS公司消费税–AIMP2消费税在我们的结构中观察到(b条). (d日)EPRS界面2中残基的序列比对消费税和AIMP3使用Clustal欧米茄（筛子等。, 2011)用显示电子脚本3（Robert&Gouet，2014）). 根据EPRS的结构定义了二级结构元素消费税。保存的残留物和类似残留物分别以红色和黄色突出显示。

在MSC亚复合物的试结晶过程中，我们获得了二元DA2亚复合物晶体，但其衍射仅为4.5 与衍射为3.6的三元DA2E亚复合物晶体相比，λ分辨率（未显示数据） 奥分辨率。而DA2亚复合物分子则没有明显的非晶体对称性在非对称单元，DA2E亚复合物分子非对称单元通过双重旋转对称相互关联[图3(一)]. 虽然两个EPRS之间的相互作用_消费税来自相邻DA2E亚复合物的分子非对称单元这可能是一种晶体伪影，很明显，这种相互作用有助于稳定，因此取得了成功结构测定DA2E子复合体的。