1.简介

在其功能的过程中，蛋白质经历了一系列结构转换，采样不同的结构中间产物。因此，蛋白质结构与功能之间的关系由其动态特性决定（列文蒂诺等。, 2015)。这些中间产物的出现和衰变的时间尺度跨越多个数量级——从飞秒到秒——所有这些都有助于蛋白质的整体高效和特异功能。平衡测量提供了所有热力学上可获得的蛋白质构象状态的集合，并由能量最低（人口最多）的结构控制。确定蛋白质功能性中间体的结构并非易事，因为系统必须从非平衡状态扰动并实时跟踪。时间分辨实验允许收集此类信息。在这里，我们关注时间分辨X射线溶液散射（TR-XSS），这是一种在蛋白质功能期间提供实时全局结构信息的技术。具体来说，我们通过将TR-XSS与光固化策略耦合，以不可逆非天然光活化蛋白反应为目标。

TR-XSS被用于跟踪许多生物过程，因为它可以提供反应过程中物种的直接结构信息（列文蒂诺等。, 2015)。然而，TR-XSS需要以下两种形式的触发器光激发，一温度突变，在感兴趣的生物分子中，混合配体或pH值突变以尽可能均匀地启动反应。据我们所知，泵-探针小角X射线散射（SAXS）或广角X射线衍射（WAXS）尚未应用于不可逆蛋白质反应途径，TR-XSS研究主要集中于光活性蛋白质或对pH或温度诱导的蛋白质齐聚或折叠/展开（Cammarata等。, 2008; 里默曼等。, 2017; 基姆等。, 2015)。光触发提供了一些最快且均匀的反应起始条件。考虑到只有一小部分蛋白质是自然光激活的，因此必须采用非自然触发方法。由于许多蛋白质过程都是由小分子介导的，因此可以制备含有可光解保护基团的分子的合成类似物，并通过光脉冲光解来启动蛋白质功能。

光笼引发的TR-XSS是一种新的实验方法，可以使用X射线溶液散射（XSS）跟踪由小分子结合引发的时间分辨结构转变。配体通过光切割迅速释放到蛋白质溶液中，并且在衰变后以适当的时间延迟收集XSS图谱。小分子配体的光降解为观察非天然光活化蛋白质的单一周转事件提供了一条途径，为在更广泛的生物系统中研究反应动力学和结构动力学开辟了许多可能性。

三磷酸腺苷（ATP）水解推动了许多酶反应和生物过程，从物质跨细胞膜的转运、信号级联、蛋白质折叠和伴侣作用到蛋白质降解。这些酶被称为ATP酶，利用ATP的结合和分解作为能量来源，在其第三或第四纪构造在其功能循环期间。笼状ATP以前曾被用于研究驱动蛋白产生力的机制，以及分别通过斑贴和拉伸测量研究肌肉中ATP敏感钾通道的动力学（Clapp&Gurney，1992）; 高盛等。, 1982)。在本研究中，我们将1-（2-硝基苯基）笼状ATP（NPE-ATP）的激光闪光光解与时间分辨X射线散射测量相结合，研究细菌脂类翻转酶MsbA中可溶性核苷酸结合域（NBD）的ATP依赖性二聚化。这些结构域是ATP-结合盒转运蛋白家族中底物移位的“动力中风”机制的关键驱动因素。ATP与每个NBD的结合诱导每个结构域的构象变化，随后形成闭合的二聚体，而转运蛋白跨膜结构域的进一步变构变化导致溶质通过交替进入机制跨膜转运（Ward等。, 2007)。时间分辨傅里叶变换红外光谱（TR-FTIR）先前被用于间接研究通过ATP-decaging（Syberg等。, 2012)。相反，X射线溶液散射直接报告蛋白质结构的变化。在这里，我们探索ATP-去壳策略结合X射线散射，以获得NBD二聚化的时间分辨结构见解。使用图1所示的实验装置我们能够观察到NBD二聚体竞争构象的形成（出现在实验的早期时间点）以及随后的NBD二聚体形成。ATP-促进的NBD二聚体本身是一种亚稳中间体，在ATP分子水解后（～10 s）会降解，无法使用标准静态SAXS数据收集策略进行成像。由于我们目前对NBD二聚体形成的理解主要来自于ATP后水解阶段的结晶模型，因此我们的方法提供了另一种在结构上可视化溶液中短寿命蛋白质状态的方法。

图1 实验装置和蛋白质结构转变概述。(一)在355nm激光照射下，NPE基团从NPE-ATP中光激发去壳，释放出游离ATP到溶液中。去壳反应在10毫秒的时间尺度上发生。这个量子产率反应速率为0.67（Syberg等。, 2012)。(b条)NBD（蓝色）依赖ATP的（黄圈）二聚化机制。(c（c）)束线处实验装置的示意图。

2.材料和方法

3.结果和讨论

为了使用去壳NPE-ATP的X射线散射跟踪NBD的二聚化，我们使用了一个5 ns 355 nm的激光脉冲，在我们的实验装置中，该激光脉冲与样品毛细管中的X射线脉冲重叠（图1c（c）和S1）。实验的可实现时间分辨率受到以下NPE-ATP衰变时间（~10 ms）的限制闪光光解（麦克雷等。, 1980)。采用缓慢流动的液体输送系统，在每个泵-探头脉冲之间自动刷新样品，同时保持X射线路径中的激光照射体积（参见图S1支持信息).

时间分辨散射数据是在泵浦-探针装置中收集的，在激光诱导光解和入射X射线之间有50 ms到1.4 s的时间延迟，并且超过问范围0.038–2.5º⁻¹.最短时间延迟（50 ms）被选择为比已知NPE-ATP去壳时间长（McCray等。, 1980)因为实验的目的是观察与缓慢二聚化步骤有关的结构变化，而不是与核苷酸结合事件有关的结构改变（Syberg等。, 2012)。值得注意的是，完整的酶机制不仅涉及ATP结合后二聚，而且还涉及较慢的ATP水解步骤（～10 s），导致二聚NBD的分解。这一慢步的持续时间比实验时波束线ID09（ESRF）的可用延迟窗口长。

在激光脉冲和X射线脉冲之间的负时间偏移（−100µs）下记录蛋白质未激发（暗）状态的散射。产生的结果回转半径(R（右）_克)根据绝对散射计算的暗态的21.5±0.19Ω与理论值吻合得很好R（右）_克20.7Å，来源于apo态MsbA-NBD的晶体结构[PDB代码，5个人数字电视;3b5瓦（病房等。, 2007)]. 相反，晶体二聚体（PDB代码，3b60个)有更大的理论R（右）_克23.5奥。实验R（右）_克表明笼状ATP的存在不会促进MsbA NBD的二聚化。

虽然绝对散射用于测量总散射体积，但差异曲线在追踪蛋白质的局部和特定构象变化方面很有价值。因此，为了观察去壳后ATP结合和二聚化导致的NBD结构变化，通过从随后的时间延迟中减去暗（apo）状态曲线绘制差异曲线。散射差异曲线如图2所示揭示了差异信号的演变，主要是在低问范围（0.038–0.5º⁻¹)。A clear and consistent increase in the前向散射强度（当问<0.1Å⁻¹)很容易注意到，这与ATP-结合的NBD二聚体的形成有关（图2一)。我们发现R（右）_克与蛋白质大小的增加一致（图2b条)。决赛R（右）_克在1.4s的时间点上，23.16±0.23μl与结晶二聚体的匹配良好。

图2 NPE-ATP光电记录后的时间分辨SAXS数据。(一)散射差异曲线图(问Δ我 对 问)通过从所有后续时间点测量值中减去以负激光偏移量（−100µs）散射的蛋白质来计算。插图显示了前两个时间点（50和100 ms）的差异曲线。(b条)回转半径表示NBD二聚化和动力学拟合R（右）克随着时间的推移（带有相应标准偏差的黑色方块）。激光激发后的时间点用二阶动力学函数（黑线）拟合。计算的速率常数用于二聚(k个昏暗的)从适合的6200M（M）−1 秒−1.

随着R（右）_克表示与NDB二聚化相关的结构变化，这是2的模型的二阶动力学速率方程A类→B类(A类是NBD单体，并且B类是二聚体）。配合如图2所示(b条)并产生a速率常数共6200页M（M）⁻¹ 秒⁻¹用于二聚步骤(k个_昏暗的)。Syberg提出的动力学等。(2012)用多重指数全局拟合近似，而不是这里提出的更具生物化学代表性的双分子动力学模型，因此无法直接比较动力学常数。仅出于比较目的，单个指数适合我们的R（右）_克数据产生a速率常数2.4秒⁻¹它类似于速率常数共1.4秒⁻¹Syberg获得等。（未显示配合）。

晶体二聚体和单体（PDB代码3b60和5idv问范围<0.13º⁻¹（图S2）。此外，计算出的从头算单体和二聚体NBD的分子包络也非常类似于它们各自的晶体结构（图S3）。总之，这些相似性支持NPE-ATP去壳化诱导NBD二聚体。

先前报道的通过FTIR光谱获得的NBD二聚动力学依赖于核苷酸信号的光谱变化（Syberg等。, 2012).时间分辨光谱学是一种成熟的技术，可以产生关于探针局部环境的信息，并提供与蛋白质结构变化的间接关联。相反，时间分辨X射线散射在蛋白质的构象周期中产生直接的结构信息。我们的TR-XSS实验可以直接可视化ATP在NBD中诱导的结构转变及其齐聚反应。具体而言，在第一个时间点（50 ms）问值0.08和0.2º⁻¹分别已经存在，表明NBD分子在停滞时间实验的结果。这些早期的结构变化可能与ATP与NBD的结合有关，并且在之前的TR-FTIR工作中没有捕捉到，这突出了全球结构信息的重要性。可以看到进一步的结构变化，如问= 0.2 Å⁻¹在100到300ms之间变宽，从400ms开始，在问= 0.13 Å⁻¹。这些结构变化似乎是一个单一的过渡事件等静压点0.1º⁻¹.

利用差分散射曲线的奇异值分解（SVD）分析进一步研究结构转变。分析表明存在一个主要成分和一个次要成分（图3一)，其中第一个组件是迄今为止最重要的。我们将此成分归因于NBD二聚体，因为其浓度在测量的时间点内持续增加（图3b条)，与R（右）_克这一部分的重要性并不令人惊讶，因为它是本研究中所探讨的长时间延迟预期的主要结构变化。

图3 TR-XSS数据的单值分解分析揭示了两种成分的存在。(一)以线性比例绘制的奇异值（来自矩阵s的对角线）。(b条)单一（VT型)显示特征向量相对振幅的矩阵（分量1和分量2分别为红色和蓝色）对时间。(c（c）)奇异（U）矩阵表示两个主要分量的特征向量。

SVD分析还显示了第二个次要成分，该成分已在50 ms时出现并迅速衰减。我们将该成分归因于NBD的核苷酸捕获事件和产生二聚化能力状态所需的构象变化。我们推测，50 ms处的散射差异曲线代表了与NBD结构域的核苷酸结合构象有关的中间产物之一，因为它与根据NBD晶体结构计算的散射曲线很好地相关，这些NBD与各种配合物核苷酸（PDB代码，5dgx公司和3b60个; 图S2）。具体来说，实验差分曲线和核苷结合晶体结构的计算差分曲线都在0.08℃处出现正峰⁻¹0.2º时为负⁻¹。即使在两个核苷酸结合的晶体结构中，计算的XSS曲线在该区域也显示出轻微的差异，表明这一变化问范围是响应核苷酸结合的内部结构重排。这一结合步骤的深入表征需要用更快的ATP-去壳类似物散射更早的时间点。这将允许我们对这一步骤的动力学建模，并更好地确定样品中存在的种群；然而，这超出了本次调查的范围。

为了进一步加强我们的研究并证实我们在SVD分析中的发现，我们使用绝对散射曲线的累积一级相关图进行了独立分析（图S4）。该关联图显示了连续的结构转变，揭示了前100毫秒内的快速衰减状态，随后是中间状态的稳定演变，在200到800毫秒的时间延迟之间尤其明显。

通过结合ATP和TR-XSS的光激发去壳，我们能够实时跟踪NBD的二聚化，这为研究许多依赖ATP的反应的结构动力学提供了新的可能性，并可能在任何光降解系统中进行。研究非平衡和单向蛋白质功能与结构耦合的能力为获得对分子结构-功能关系的宝贵见解开辟了新的可能性。由于其他NPE笼式生物活性配体（如GTP）也可在市场上买到，该方法为研究G蛋白偶联受体信号等反应中的机械相关构象转换打开了大门。可以合成具有不同光固化基团的笼状配体，从而可以调节去胶波长、量子产率和去胶速率，同时提供从纳秒到毫秒不等的时间分辨率。结合TR-XSS，这项技术为研究配体结合引起的蛋白质三级和四级结构变化铺平了道路。为了成功进行TR-XSS实验，必须考虑几个参数，以克服与进行这些实验相关的技术困难。最重要的是问为了提取出清晰的结构和动力学模型，必须检测到被调查结构变化的预期范围。例如，对于经历局部结构扰动的大型蛋白质和蛋白质复合体，与蛋白质的整体散射能力相比，信号差异将很小。因此，必须获得高分辨率和高信噪比的图像，需要更明亮的X射线源或更长的累计曝光时间。随着非常明亮的同步加速器光源、X射线自由电子激光器的出现以及探测器技术的发展，这一警告正在被克服。这些进步使这些技术得以更广泛地使用。