Twist and turn: a revised structural view on the unpaired bubble of class II CPD photolyase in complex with damaged DNA

Maestre-Reyna, M.; Yamamoto, J.; Huang, W.-C.; Tsai, M.-D.; Essen, L.-O.; Bessho, Y.

doi:10.1107/S205225251800996X

研究论文

IUCrJ大学

第5卷| 第5部分| 2018年9月| 第608-618页

国际标准编号：2052-2525

https://doi.org/10.107/S205225251800996X

生物学|医学

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扭曲和旋转：对Ⅱ类CPD光解酶与受损DNA复合物中未配对气泡的结构观点的修正

曼纽尔·雷纳音乐大师,^一山本俊培,^b条黄伟成,^一蔡明道,^一拉尔斯·奥利弗·埃森 ^c、，^d日和吉隆贝绍 ^一 ^*

^一中国科学院生物化学研究所，台湾台北115南康二段学术路128号，^b条大阪大学工程科学研究生院化学系，地址：日本大阪市富冈町山1-3号，邮编：560-8531，^c（c）德国马尔堡35032 Hans-Meerwein Strasse 4号菲利普斯大学化学系^d日德国马尔堡Hans-Meerwein大街6号菲利普斯大学LOEWE合成微生物学中心，邮编35032
^*通信电子邮件：bessho@sinica.edu.tw

美国芝加哥大学K.Moffat编辑(2018年4月3日收到； 2018年7月11日接受；在线2018年8月8日)

环丁烷嘧啶二聚体（CPD）光解酶利用蓝光的能量修复紫外线诱导的DNA CPD。在结合时，CPD光解酶会导致光损伤从双链DNA翻转到酶的催化位点。这个过程被称为碱基滑移，它会在DNA中诱导一个扭结，以及一个不成对的气泡，这些气泡通过蛋白质-核酸相互作用网络来稳定。此前共晶报道了CPD光解酶结合模式的详细研究结构。然而，在所有情况下，光损伤部位的核苷间连接是化学合成的甲缩醛类似物，而不是天然的磷酸二酯。这里，第一个晶体结构和构象分析通过本文对Ⅱ类CPD光解酶与含有天然环丁烷嘧啶二聚体和离子内磷酸二酯键的光损伤DNA的复合物进行了分子动力学模拟。结论是，当与II类CPD光解酶络合时，高度保守的泡状侵入区（BIR）介导CPD DNA开放形式的稳定。

关键词： II类CPD光解酶；DNA修复；DNA畸变；环丁烷嘧啶二聚体；晶体结构.

PDB参考：马氏甲烷八叠球菌Ⅱ类CPD光解酶与完整的含磷酸盐CPD损伤复合物，5zcw

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1.简介

DNA光解酶是古老且普遍存在的含黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的酶（Essen&Klar，2006）)利用蓝光能量以序列依赖的方式修复紫外线诱导的DNA损伤。此外，它们构成了任何生物系统中最古老、最保守的DNA修复途径（Mei&Dvornyk，2015）). DNA光解酶已进化为对两种主要的UV DNA光产物作出反应，即6–4嘧啶–嘧啶二聚体（6–4光产物）和环丁烷嘧啶二聚物（CPD）。因此，DNA光解酶在功能上可分为（6–4）和CPD光解酶（Lucas-Lledó&Lynch，2009 ). CPD光解酶在遗传学上可进一步分为I类、II类、cry-DASH和最近的III类（Scherer等。, 2015 ). 密切相关的隐花色素主要作为蓝光感光体通过氧化生色团的光依赖性还原（光还原；Geisselbrecht等。, 2012 ). 有趣的是，通过光诱导形成磁敏自由基对，隐花色素可以作为磁受体发挥作用（Ritz等。, 2000 ).

虽然DNA光解酶在系统发育上差异很大（Kiontke等。, 2011 )，它们都共享一个通用的两域拓扑。这两个结构域的元素都参与DNA识别和结合，而每个结构域都有一个单一的捕光辅因子作为发色团（Geisselbrecht等。, 2012; Kiontke公司等。, 2011; Mees公司等。, 2004 ). DNA光解酶的C末端结构域普遍含有一个减少的FAD辅因子（FADH^负极)独特的U形构造（Mees等。, 2004)它既有吸收光的作用，又有催化作用。N末端结构域的辅因子，即所谓的天线发色团，根据系统发育关系而变化（Kiontke等。2014年 ). 天线发色团增加吸收横截面酶的活性。高效的光驱动DNA修复是通过类Förster实现的能量传递从天线辅助因子到催化FADH^负极，对蓝光的吸收相对较弱（Essen&Klar，2006). 在CPD光解酶修复CPD DNA的过程中，FADH^负极吸收单个蓝色光子，产生激发的FADH^负极（FADH公司^负极*). 然后，辅因子将一个电子注入结合的CPD病变，产生一对自由基，即氧化自由基FADH( $[{\rm FADH}^{\bullet}]$ )和减少的自由基阴离子病变 $[{\rm CPD}^{-\项目符号}]$ （韦伯，2005年 ; Brettel&Byrdin，2010年 ). $[{\rm CPD}^{-\项目符号}]$ 然后几乎无障碍地分裂成它的组成碱，电子被反传递到 $[{\rm FADH}^{\bullet}]$ .

所有之前发布的CPD光解酶–DNA共晶结构表明，为了实现最佳FADH^负极至CPD距离电子转移，组成CPD的两个碱基必须以大约120°的角度从DNA链中翻转出来，从而进入光解酶催化位点（Kiontke等。, 2011). 与其他DNA修复酶一样（Qi等。, 2009 )，CPD光解酶似乎在解封CPD中发挥了积极作用，因为光损伤DNA的构象空间不允许CPD损伤从核苷酸链中自发翻转（Knips&Zacharias，2017 ). 此外，已经证明不能从dsDNA中翻转CPD是cry-DASH蛋白的一个共同特征，cry-DASH蛋白作为光裂解酶，仅对单链DNA（Pokorny等。, 2008 ). 有趣的是，一些祖先的cry-DASH蛋白确实保留了dsDNA修复活性（Tagua等。, 2015 )这进一步支持在所有其他dsDNA-修复、CPD光解的CPD触发中发挥积极作用。

由于CPD光解结合和随后的碱基翻转，由CPD引起的自然DNA畸变加剧。含有游离CPD的DNA已经显示出扭结，即DNA主干的急剧弯曲涉及相邻的基板拆垛（Dickerson，1998 )，在光损伤处约为30°（Husain等。1988年 ; 公园等。, 2002 ). 光解酶结合的CPD DNA进一步扭曲，CPD损伤处的扭结角约为50°（Kiontke等。, 2011; Mees公司等。, 2004). 此外，在II类CPD光解中，CPD下游的DNA错位，即横向弯曲，与I类CPD光解酶（Kiontke等。, 2011). 在I类和II类CPD中，由于CPD损伤的不配对和翻转，即然后，未配对的气泡通过位于连接螺旋线的环内的侧链来稳定α17和α18（Kiontke）等。, 2011; Mees公司等。, 2004). II类CPD光解酶稳定DNA链中的气泡通过 π-三种保守氨基酸Arg429、Trp431和Arg441在上述环中的堆积（补充图S1一)以及与未配对互补碱的离子相互作用（Kiontke等。, 2011)，而I类CPD光解使用一组不同的相互作用（Essen&Klar，2006).

这些观察结果已得到证实通过可用的高分辨率共晶与DNA（Pokorny）复合物中I类、II类和cry-DASH CPD光解酶的结构等。, 2008; Kiontke公司等。, 2011; Mees公司等。, 2004; Selby&Sancar，2006年 ). 然而，主要由于在净化化学合成的天然CPD方面存在挑战，这些配合物共享合成CPD类似物的使用，其中，离子内磷酸二酯键被不带电的甲缩醛部分取代。因此，CPD损伤部位的DNA主干负电荷被消除。然而，如上所述，碱基滑动稳定化涉及带正电荷的氨基酸与CPD主链附近的未配对碱基相互作用。因此，迄今为止描述的CPD结合模式和在催化位点稳定单链DNA的机制是否完全代表了生理光解酶-DNA复合物是值得怀疑的。为了解决这个问题，我们在这里提出第一个共晶的结构马氏甲烷八叠球菌Ⅱ类CPD光解酶(嗯CPDII）与完全天然、含磷酸二酯酶的CPD DNA复合体，分辨率为2.7º。正如预期的那样嗯CPDII–DNA复合物类似于先前发表的含有甲缩醛键的结构（Kiontke等。, 2011). 一方面，我们在这里显示的数据证实了之前关于顺式——同步器-活性位点内的环丁烷加合物，包括独特的六水簇（6WC）的存在和作用。然而，CPD损伤的结合部位及其对映体在氨基酸侧链和非配对碱的放置以及水合球中表现出细微的差异，这导致了更明显的DNA扭结。这使我们确定了连接螺旋的环α17和α18是一个高度保守的泡状侵入区（BIR），负责非配对泡状稳定和磷酸盐识别。因此，CPD损伤中存在的层内磷酸二酯部分深刻影响了对受损DNA的识别，并且对于II类CPD光解酶中有效的DNA结合至关重要。

2.材料和方法

2.1、。合成和杂交光损伤DNA

DNA双工体的序列与之前描述的PDB编码结构的序列相同2xrz（2xrz）（Kiontke等。, 2011)被雇佣。带有序列d（5′-TGCGCAAGCCGAT-3′）的互补非光损伤DNA是从台湾台北基因组有限公司大量订购的。另一方面，单链光损伤DNA是在内部合成的。用于顺式——同步器CPD购自美国弗吉尼亚州斯特林市格伦研究所（Glen Research，Virginia，Sterling）。CPD构建块和核苷磷酰胺盐溶液（格伦研究）安装在应用生物系统3400 DNA合成器上，并根据制造商的说明合成了14-mer，d（5′-ATCGGCT<>TCGCA-3′）。在用硫酚处理固体载体使CPD部分的磷酸二酯内基团脱保护后，进行裂解和脱保护。使用Gilson分析HPLC系统分析和纯化寡核苷酸，在该系统上使用Watersμ安装了Bondasphere C18，5µm，300º色谱柱（3.9×150 mm）。在0.1中以5–13%乙腈的线性梯度运行色谱柱M（M）pH值为7.0的醋酸三乙基铵超过20分钟。通过蒸发干燥混合溶液，并将残渣通过NAP-10（英国白金汉郡GE Healthcare）和阳离子交换器（AG 50W-X2，Na⁺表格，Bio-Read Laboratories，Hercules，California，USA）栏。两股钢绞线均在储存缓冲液（100 m）中溶解M（M）Tris–HCl pH 8.0，100 mM（M）NaCl），以1:1摩尔比混合，并通过将溶液加热至95°C，然后在3小时内缓慢降低温度至25°C，在热循环器中进行杂交。

2.2. 蛋白质生产和纯化

蛋白质生产和纯化遵循既定指南（Kiontke等。, 2011). 简要地，大肠杆菌BL21（DE3）细胞通过一个基于pET-28的构建物进行转化，该构建物包含MM_0852开放阅读框，其编码嗯CPDII（GenBank ID AAM30548.1）。蛋白质产生了通过在25°C的TB培养基中进行自动诱导，每升培养物的蛋白质产量超过100 mg。将细胞颗粒重悬于缓冲液（50 mM（M）磷酸盐缓冲液pH 8.0，300 mM（M）NaCl）并溶解。清除细胞碎片后通过第二步离心，将上清液加载到10 ml镍-NTA自包装柱上，洗脱蛋白质通过增加250 mM（M）咪唑至运转缓冲器。作为最后的抛光步骤，将蛋白质装载到尺寸排除色谱法含有Superdex 200的色谱柱与10 m相平衡M（M）Tris–HCl pH 8.0，100 mM（M）氯化钠。

2.3. 蛋白质结晶和数据采集

蛋白质-DNA复合物在黑暗和氧化条件下制备(即暴露在空气中），以避免自发DNA修复，方法是将蛋白质溶液与1.25倍摩尔过量的dsDNA混合，使最终蛋白质浓度在6.0至6.5 mg ml之间⁻¹.在黑暗中培养30分钟后，晶体生长通过在由2µl蛋白质–DNA样品溶液和2µ1结晶缓冲液组成的4µl液滴中的蒸汽扩散[0.1M（M）醋酸钠pH值4.6,0.25M（M）硫酸铵，4%(w个/v（v）)聚乙二醇4000]。24小时后，用环捕出晶体，并在添加30%的结晶缓冲液中进行低温保护(v（v）/v（v）)甘油和数据是在台湾NSRRC的TPS-05A光束线上或日本SPring-8的BL32XU上测量的。

2.4. 数据处理和结构解决方案

从几个晶体中获取的数据是手动处理的通过略加修改的版本卡莫合并协议（Yamashita等。, 2018 )使用XDS公司（Kabsch，2010年 ).混合物聚类（Foadi等。, 2013 )来自中央处理器4套房（优胜者等。, 2011 )用于确定数据集的最佳组合，然后进行合并通过 XSCALE（XSCALE）（Kabsch，2010年). 然后求解最终的合并和缩放数据集通过分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007 ). 两个分子模型嗯CPDII–使用混合手动操作进一步改进了每个不对称对称单元的CPD DNA复合物精炼在里面库特（埃姆斯利等。, 2010 )和最小二乘自动化精炼具有REFMAC公司5英寸中央处理器4我（穆尔舒多夫等。, 2011 ). 在这里，FAD是以完全氧化的形式建模的，在所有图中都是这样显示的。数据收集和细化统计见补充表S1。

2.5. 分子动力学模拟

所有分子动力学模拟均使用琥珀色17软件（案例等。, 2017 )使用最新版本的蛋白质琥珀色力场（ff14SB；梅尔等。, 2015 )和核苷酸[ff14和∊/ζ_OL1型（兹加波娃等。, 2013 )，χ_OL3（OL3）（兹加波娃等。, 2011 )，χ_OL4（OL4）（克雷普等。, 2012 )和β_OL1型（兹加波娃等。, 2015 )更新（Cheatham&Case，2013 )]，带有FADH的附加参数^负极以及具有磷酸二酯和甲缩醛骨架的环丁烷嘧啶二聚体（宫泽等。, 2008 ). 后者是手动更新的，以与琥珀色17命名法和用于任何骨干部分的存在。模拟是在一个工作站上运行的，该工作站配有四个运行Ubuntu 16.04 LTS的Nvidia GTX1080 GPU。

2.5.1. 系统设置

这个嗯CPDII–通过提取复合物I（对应于蛋白质链A类和DNA链C和D类; 补充图S2）。手动擦除替代构象，并根据PROPKA公司服务器（奥尔森等。, 2011 ; 瑟恩德加德等。, 2011 )预测pH为4.6，与结晶条件相同。然后将处理后的文件加载到琥珀色拓扑和坐标准备程序xleap公司（王）等。, 2006 )以及辅因子和CPD的相应参数文件。通过添加钠和/或氯离子形式的反电荷来中和系统，以获得30 m的有效氯化钠浓度M（M）最后，将该综合设施封闭在TIP3P水箱中，该水箱从嗯CPDII–DNA复合物。甲缩醛CPD衍生物嗯CPDII–DNA复合物是类似制备的，唯一的区别是CPD单体的参数设置。对于这两种情况，最终生成了一组拓扑和初始坐标。

2.5.2. 最小化

在每次生产运行之前，将拓扑和坐标最小化并分别平衡。最小化分四个步骤进行。首先，溶质原子受到100 kcal mol的约束⁻¹谐波抑制，同时SHAKE（震动）-约束（宫本茂和科尔曼，1992年 )允许水和离子松弛500个最陡下降周期，然后是4500个共轭梯度步骤。接下来，解除对离子、水和DNA的限制，让分子在与之前相同的条件下放松。遵循相同的程序，包括FAD残留物。最后，解除了对蛋白质的谐波约束，整个系统放松了相同次数的循环。

2.5.3. 平衡和生产动态

最小化后，使用朗之万恒温器（随机种子和γ=5 ps⁻¹)对溶质分子施加弱约束。接下来，在300 K下进行另一个50 ps的恒体积模拟，以进一步平衡系统。最后，对一个大气进行了50 ps的恒压无约束平衡（蒙特卡洛恒压器，压力释放时间2 ps）。

在温度和压力平衡后，系统最终收敛需要20 ns的时间。在此之后，收集200 ns的生产动态，每100 ps进行一次快照。对于描述具有磷酸二酯酶连接的CPD的复合物的模拟，以及对于甲缩醛连接的CPD的模拟，重复两次该过程，包括最小化，导致每个复合物的400 ns的生产动态。总的来说，探测了0.8µs的模拟时间。

2.6. 数据分析

进行了角度、矢量和水密度分析通过 CPPTRAJ公司（Roe&Cheatham，2013年 )，它是琥珀色16/琥珀色工具17包装（箱等。, 2017). 对于扭结角和位错角，使用每个臂的3′端和5′端碱基对的质心（COMs）生成向量，从中导出角度。未配对气泡内的扭曲角被计算为CPD内酯磷酸二酯COM之间生成的矢量之间的矢量乘积（P0；PDB入口5zcw公司)或甲醛（C0；PDB条目2xrz（2xrz）)以及相应结构的dG6′、dA7′、dAs8′和dG9′的组合COM。所有蛋白质图均以非正交方式呈现PyMOL公司（薛定谔），在分析分子动力学轨迹和渲染视频时供应商管理部（汉弗莱等。, 1996 ).

进行了水密度分析通过主旨（阮等。, 2012 )如中所述CPPTRAJ公司简单地说，从每个200 ns生产动力学模拟中提取2000个快照，集中到其质量中心，并使用随机选择的快照对齐。通过将所有快照与同一组坐标对齐并居中，我们可以准确地进行比较要点结果使用相同的计算区域。总的来说，水密度分析区域跨越了一个以蛋白质-DNA界面为中心的20×10×20Ω盒，个体密度以0.5×0.5×0.5Ω体素计算。为了可视化结果，在x赫兹平面。

使用POVME公司2.0软件（Durrant等。2014年 ). 这里，我们使用了与水密度分析相同的快照，通过这些快照我们可以准确地进行比较POVME公司结果使用相同的包涵体区域。计算了两种不同的体积：（i）对应于碱翻转留下的总空腔的未配对气泡体积，以及（ii）对应于溶剂可及体积的自由体积，即不被稳定残基Arg429、Trp431和Arg441所占据。对于后者，模拟快照没有修改，而对于前者，三种氨基酸被修改生物信息学丙氨酸。然后，口袋由一组半径为5至6º的两个重叠包涵体球定义，其覆盖了蛋白质-DNA界面的体积。POVME公司以所有默认设置运行，体素栅格间距为1.0º，凸面外壳排除选项设置为“true”。

3.结果

3.1. 的总体结构嗯CPDII–DNA复合物与磷酸二酯酶相关的CPD损伤

这个晶体结构的嗯含有天然CPD的CPDII复合物，即在CPD部分内呈现磷酸二酯键，此处称为PDM（PDB条目5zcw公司)由属于空间组 P（P）2₁2₁2₁，与含有甲缩醛键的等效物（FDM；PDB条目）获得的晶型相同2xrz（2xrz）)，但由于单位-细胞参数变化高达2º，同构性有限。因此，两种晶体结构都包含两个嗯CPDII–CPD DNA复合物非对称单元（附图S2），对应蛋白质链A类显示更明确的DNA末端（图1). 为了简单起见，从这一点来看，蛋白质链形成的蛋白质-DNA复合物A类和DNA链C和D类将被称为复合物I，而包含蛋白质链的复合物B和DNA链E类和F类称为复合体II（补充图S2）。由于络合物II的PDM电子密度不如络合物I的PDM，除非另有明确说明，否则此处所述的所有描述均指络合物I。尽管PDM结构的分辨率比FDM（2.7）差对2.2μl），我们能够观察到复合物I中的整个双链DNA（14-mer），显示了5′臂（CPD损伤的上游DNA）和3′臂（CP损伤的下游DNA）；图1一)完全由电子密度定义。同时，复合体II中5′臂主要部位的PDM电子密度缺失（补充图S2）。此外，在复合物I中，我们发现连接链中N端和C端结构域的连接区的大部分具有显著的电子密度A类（氨基酸Val186–Glu231；补充图S1一)，只有Glu189和Met196之间的氨基酸缺失，而在FDM中，Pro188和Glu198之间的残基未定义（图1b条).

图1
整体褶皱嗯CPDII与含有天然环丁烷嘧啶二聚体（CPD）的双链DNA复合物。(一)整体复合体视图，具有蓝色（N端）和绿色（C端）两个子域。DNA显示为双链卡通，而氧化的FAD辅因子（黄色）和CPD损伤（绿色）显示为棒状模型。(b条)PDM结构（PDB条目）中域链接区域（灰色）的差异5zcw公司)对FDM结构（PDB条目2xrz（2xrz）). (c（c）)光解酶结合导致DNA几何畸变。双绞线显示为绿色（PDM）、淡蓝色（FDM）和黑色(A.鸟巢Ⅰ类CPD光解酶；安CPDI）。出于定向目的嗯CPDII结构在背景中显示为淡绿色。侧视图（左）示出了扭结角度，即由于互补腺嘌呤的CPD翻转和部分解叠导致的DNA的急剧弯曲。这里，扭结角是根据5′的矢量积计算的对每条链条的3′臂。顶视图（右）显示了II类CPD光解酶（绿色，PDM；淡蓝色，FDM）中3′臂与I类（黑色，安CPDI）。通过叠加所有三个分子的5′臂来计算位错角，然后确定PDM或FDM 3′臂与安CPDI 3′臂。

尽管两种晶体结构之间存在相似性，并且当PDM与FDM进行比较时，没有主要的畴间构象变化（856个普通C的r.m.s.d.为0.73º^α原子），结合DNA的几何形状存在明显差异。在我们的计算中，由CPD结合导出的FDM扭结角为53.9°。同时，PDM显示出61.1°的明显不同值（图1c（c），左）。另一方面，DNA错位与组囊藻I类CPD光解酶，PDM中的位错对应30.8°，FDM中的位错对应29.9°（图1c（c），右；补充图S1一). 由于DNA扭结是光解酶结合的直接结果（Mees等。, 2004; Kiontke公司等。, 2011; 公园等。, 2002)，我们假设观察到的差异一定与CPD磷酸二酯部分（P0）在活性位点的识别方式有关对在相同位置容纳形式乙酰基连接的CPD的方式。

3.2、。磷酸二酯键合CPD在嗯CPDII结合位点

对PDM结构的仔细检查显示，在每个复合物中组成CPD的两个胸腺嘧啶之间的主链电子密度增加，清楚地表明在这个位置存在全磷酸二酯键（图2一，补充图S3）。比较PDM复合物I和II时，结合模式非常相似（图2b条; 408普通C的有效值为0.296º^α原子）。这里，与FDM很相似，CPD占据FAD辅因子质心12.1°范围内的空腔，5′和3′CPD胸腺嘧啶的C4羰基与FAD腺嘌呤的N6氨基相互作用（图2b条). 显著的蛋白质–CPD损伤相互作用包括π-堆叠（Trp421从后面，Trp305从侧面）、疏水相互作用（Met379）、氢键（Asn257和Glu301）和离子相互作用（Arg164和Arg256），所有这些都在将CPD部分保持在活性位点内发挥作用。活性位六水簇（6WC）也存在于PDM结构中（图2b条). 6WC参与3′CPD胸腺嘧啶的结合，但也被提议在DNA-光对催化循环（Kiontke等。, 2011). 与FDM结构非常相似，CPD损伤似乎完好无损。根据低构象选择性嗯CPDII用于CPD，PDM呈现准经典CPD光损伤，基面之间倾斜50.6°（FDM倾斜43.1°；小分子晶体结构内的CPD倾斜为～57°；Kiontke等。, 2011; 公园等。, 2002). 考虑到PDM或FDM中几乎相同的结合模式，活性位点中CPD部分的结合模式几乎不受另一部分性质的影响嗯CPDI-DNA骨架相互作用。

图2
天然CPD绑定嗯CPDII公司。(一)确定CPD主干的性质。PDM的电子密度（蓝色；PDB条目5zcw公司)比FDM更突出（红色；PDB入口2xrz（2xrz）)，清楚地证实了磷酸二酯骨架的存在。电子密度计算为1.5的OMIT图σ轮廓水平相对于各自的模型，然后与PDM结构叠加。(b条)PDM活动站点。的活动站点共晶该结构包含CPD（亮绿色）和氧化FAD辅因子（金）。它还包括II类CPD光解特异性水团簇（6WC）。(c（c）)在天然CPD存在下稳定扭曲的DNA。PDM（绿色）和FDM（浅蓝色）活性位点残基的重叠显示DNA几何结构中有约15°的扭曲，并伴有侧链和碱基重排（黑色箭头）。此外，直接水合球也发生了移动，促进了新的相互作用（PDM用红色表示WA1、WA2和WA3，FDM用淡蓝色表示WA3）。(d日)BIR顶部的锁紧螺栓，存在磷酸二酯酶相关CPD损伤时的BIR锁紧螺栓（PDB入口5盎司). Asp428和Trp431之间的差分锁定相互作用以红色突出显示。底部，在存在甲缩醛相关CPD损伤（PDB条目）的情况下，BIR锁定螺栓2xrz（2xrz）).

相反，由CPD翻转到光解酶活性位点和互补DNA链上相应的未配对腺嘌呤引起的未配对气泡的关键稳定性受到链内连接的化学性质的强烈影响，即磷酸二酯部分（P0）对甲缩醛基（C0）（图2c（c）). 这些变化大多发生在连接螺旋线的回路中α17和α18,即气泡侵入区（BIR），与未配对气泡直接接触（图2c（c），补充图S1）。此前，在FDM的配合物I和II（Kiontke等。, 2011). 然而，在PDM中，我们观察到两种络合物中BIR的第三种构象，与FDM络合物II中的构象相似但不相同（图2c（c）). 为了比较这两种模式，对PDM复合物I和FDM复合物II的活性位点进行了排列，包括CPD、FAD和蛋白质侧链，原子半径在上述任意一种的3.5°范围内，但不在CPD翻转留下的空间内（图2c（c）和补充图S3）。相对于CPD主链，PDM Arg441的胍基部分更接近P0质心，允许氨基酸与其形成盐桥。此外，PDM Arg429侧链偏移1.6º。同时，Arg429侧链现在可以直接与未配对dA7′中的N1相互作用，也可以间接与dA7’N6相互作用通过单一结晶水（WA1；图2c（c）)和内酯磷酸二酯通过一对水分子（WA2和WA3；图2c（c）). 此外，Arg429位移会导致紧邻CPD上游的碱基dC6发生重排，使其偏离未配对气泡1.8º。相反，与CPD下游碱基dC9相互作用的Trp431侧链被Arg429拉动，使其也移动1.8º进入CPD翻转留下的空间，并允许其与Asp428的羧基侧链相互作用通过其吲哚N^∊原子（图2d日). 这些细微的重排形成了与活性位点的空间关系，导致整个复合体围绕PDM活性位点扭曲约15°（图2c（c）). 因此，未配对的空间卷，即未成对DNA气泡产生的体积从802μ^三FDM至772º^三在PDM中（表1)导致DNA结合模式的差异，最终导致DNA几何形状和畸变的差异。

表1
几何参数嗯CPDII–DNA结合位点

扭结角是指结合DNA的下游和上游臂之间的角度。体积计算为CPD触发（未配对气泡）产生的空腔总体积或Arg429、Trp431和Arg441未遮挡的体积（自由体积）。模拟计算基于人口分析，如图3所示.

系统	扭结角（°）	未配对气泡（Å^三)	自由体积（Ω^三)
产品数据管理	61.1	772
FDM公司	53.9	802
模拟1（磷酸二酯）	57.93 ± 0.20	725.14 ± 0.56	478.75 ± 0.60
模拟2（磷酸二酯）	59.61 ± 0.220	723.20±0.59	478.63 ± 0.48
模拟1和2的平均值	58.77 ± 0.30	724.17 ± 0.81	478.69 ± 0.77
模拟3（甲缩醛）	58.12±0.26	756.70 ± 0.59	510.98 ± 0.69
模拟4（甲缩醛）	49.92 ± 0.17	699.80 ± 0.50	478.75 ± 0.55

3.3. 的依赖项嗯CPDII蛋白呼吸对CPD内连锁性质的影响

作为调查的下一步嗯CPDII–DNA相互作用在一个较宽松的环境中，我们基于PDM（补充视频S1–S4）进行了四轮200 ns的生产分子动力学（MD）模拟。其中两轮没有进行任何进一步的修改（PDM模拟），而在其他两轮中，PDM中的CPD磷酸二酯链被甲缩醛部分取代，从而形成FDM等效系统（FDM′）。

在这里，PDM系统的行为与实验确定的晶体结构，保持其所有关键功能（图3，补充视频S1和S2）。首先，也是最引人注目的是，DNA扭折角的群体分析表明，它服从中心对称正态分布，平均中心为58.77±0.30°（表1，图3一). 通过相同的过程，我们确定平均未配对体积空间为724.17±0.81^三，BIR残基Arg429、Trp431和Arg441的总体积为245.48±1.12Å^三并离开478.69±0.77º^三可使用溶剂（表1，图3b条). 此外，水密度分析表明，所有三种晶体高占有率水（图2中的WA1、WA2和WA3c（c）)也存在（图3c（c）). 溶剂暴露WA1所占据的位置是dA7′和Arg429之间两种相互作用中的一种，其水氧密度比散装溶剂水（6.5×SW）的水氧密度高约6.5倍。

图3
模拟含有dsDNA的CPD磷酸二酯或甲缩醛链的呼吸行为嗯CPDII复合物。(一)DNA扭角种群分析，用虚线突出分布的中间，并用相应的颜色表示数值。对应于PDM（PDB条目5zcw公司，复杂I）或FDM（PDB条目2xrz（2xrz），复合物II）晶体结构分别以绿色和蓝色星号突出显示。顶部为含CPD磷酸二酯类模拟物的种群（模拟物1为黑色，模拟物2为红色）。底部，两个包含甲缩醛的CPD模拟的总体（模拟3为黑色，模拟4为红色）。(b条)未配对DNA气泡的非闭塞和总体积群体分析。非封闭卷(即未被氨基酸覆盖的体积（封闭未配对空间）总是较小的，并且位于图形的左侧。总体积始终较大，位于图形的右侧。分布的中间点突出显示通过虚线和相应的值。顶部是两个含磷二酯模拟物的种群（模拟物1和模拟物2分别为黑色和红色）。底部，两个含有甲缩醛的模拟物的种群（模拟物3和4分别为黑色和红色）。(c（c）)含磷二酯和甲缩醛系统的水密度分析。左，水密度分析系统的总体表示。在感兴趣的区域周围大致画出一个分析盒（黑线），包括未配对的气泡和周围溶剂的一部分。该长方体被划分为0.5×0.5×0.5 Au的体素。此处，红色对象显示分析框中的区域，其中包含模拟1中占用率高于5的水（包含磷酸二酯）和模拟3中的淡蓝色对象（包含甲缩醛）。右，最高水占用率年-第12轴切片年体素（左侧面板上的虚线平面），为每个模拟显示。高精度体素以红色显示，具有溶剂当量密度的体素以蓝色显示。溶质占据的体素，即水密度低于1时，显示为绿色。出于定向目的，地图上显示了dC6、dC9、C0、P0和Arg429的大致位置，尽管它们不一定与第12个共面年体素。

为了进一步了解PDM和FDM之间的差异，我们接下来修改了PDM的初始拓扑和坐标，用CPD磷酸二酯酶P0代替甲缩醛基团（C0），有效地将PDM CPD转化为FDM CPD，同时保持PDM DNA几何形状和水化球完整（FDM模拟）。然后，我们继续为该系统执行400 ns的生产MD通过两次200 ns的复制，并遵循因–PO交换引起的任何扰动₂–至–CH₂–（补充视频S3和S4）。有趣的是，我们观察到两种截然不同的行为。在两个200 ns轨迹中的第一个轨迹中（补充视频S3），DNA扭结角度与PDM没有显著差异（58.12±0.26°，图3一). 然而，WA2和WA3的位置已经移动了～15°，就像PDB入口一样2xrz（2xrz）而WA1虽然位置相似，但占用率低得多（～3.5×SW；图3c（c）). 最后，未配对气泡的总体积增加到756.70±0.59Å^三（表1，图3b条)Student的t检验表明，与PDM模拟相比，这是一个显著的变化。然而，与PDM轨迹相比，未配对气泡中被Arg429、Trp431和Arg441遮挡的空间保持不变，为245.72±0.91^三，表明气泡的较大部分仍然可以溶剂进入（510.98±0.69^三; 表1).

在第二个200 ns FDM′轨迹的早期（补充视频S4），dC9–dG6′配对被打破，dC8继续与dA7′形成异常配对（补充图S4一). 结果，未配对气泡的形状和体积缩小（699.80±0.50Å^三; 表1，图3c（c）)导致DNA扭折角更尖锐（49.92±0.17°；图3一). 然而，与此同时，BIR侧链Arg429、Trp431和Arg441对未配对气泡的闭塞作用较小（221.05±0.74^三)表明他们已经从未配对的空间中后退。同时，高占有率水的存在大大减少，WA2和WA3保持在其既定位置，WA1的占有率仅略高于散装溶剂的占有率（图3c（c）). WA1的缺失以及未配对区域的形状完全不同，导致Arg429几乎完全与dA8′相互作用，而不是与dA7′相互作用（补充视频S4）。

因此，总的来说，CPD主链上存在的甲缩醛基团深刻影响了模拟，扰乱了DNA几何结构和未配对气泡的稳定性，并影响了其水合球。

4.讨论

CPD光解酶的功能众所周知（钟，2015 ; Brettel&Byrdin，2010年)特别是由于高分辨率的可用性共晶含有CPD的DNA与CPD光解酶（Kiontke）活性位点结合的结构等。, 2011; Mees公司等。, 2004). 然而，这些结构的一个显著缺点是，在所有情况下，共晶体中使用的CPD DNA缺乏自然发生的CPD损伤形式，而是包含一种化学合成的类似物，其中碱之间带负电的离子内磷酸二酯键被中性的甲缩醛部分取代。这种缺乏天然骨架的现象如何影响DNA结合和识别尚不清楚，尽管据推测这种影响很小。我们的第一个CPD光解酶结构，嗯CPDII与天然磷酸二酯酶结合的CPD的复合物显示，在未配对DNA泡如何被II类光解酶稳定方面存在相当大的差异。

由于嘧啶二聚体部分在天然CPD和人工CPD中是相同的，因此嗯CPDII活性位点能够同样很好地调节两者（图2). 然而，DNA骨架中的甲缩醛和磷酸二酯基团在体积、疏水性和电荷方面存在明显差异（图2一)导致CPD碱基滑移后出现的未成对DNA气泡发生显著的结构变化（图2c（c）).

三种氨基酸Arg429、Trp431和Arg441的存在是通过与相邻碱基（Arg429-dA7′或dA8′，Trp431-dC9）和翻转骨架相互作用来堵塞未配对气泡的关键，即天然CPD中的磷酸二酯或合成CPD类似物中的甲缩醛键（Arg441；图2). 总的来说，这些氨基酸负责堵塞大约三分之一的气泡体积（表1，图3)，而其余部分是溶剂可及的。此外，它们的构象以及翻转的CPD的构象负责与光解酶（Kiontke）结合的DNA的特征扭结角等。, 2011).

稳定DNA畸变也是许多其他DNA结合蛋白的基本特征（沃纳等。, 1996 ; 卢斯等。, 2009 )，并被认为是具有以下能力的残留物π-堆叠或带正电荷（卢斯科姆等。2001年 ; 沃纳等。, 1996). 然而，蛋白质–DNA界面水合作用在畸变稳定中的作用最近成为人们关注的焦点（Schwabe，1997 ; 施耐德等。2014年 ; Jayaram和Jain，2004年 ; Chong&Ham，2016年 ). 人们发现高利用率水具有多种作用，例如润滑作用（Schwabe，1997)，适配器（Halford&Marko，2004 )或者DNA扭曲留下的空白区域被堵塞（罗宾逊等。, 1998 ; 陈等。, 2005 ). 因此，有趣的是，当比较PDM和FDM′的晶体结构和MD模拟时，CPD上的甲缩醛部分会降低关键稳定水域的占用率，尤其是WA1（图3c（c）). 在光解酶活性的背景下，WA1的高占有率是非常显著的，因为光解酶必须作用在四种可能的底物上，即TT和不太常见的CT、TC和CC嘧啶二聚体，因此必须稳定不同的未配对气泡（分别为AA、AG、GA和GG）。在这里，WA1可以作为Arg429和未配对气泡的5′区域之间的高度通用适配器。例如，在存在TC CPD损伤的情况下，Arg429需要与GA未配对气泡中的5′dG相互作用。在这些条件下，Arg429–WA1–5′G相互作用可以很容易地通过三个伙伴之间的位置轻微改变来适应，从而使dG N1、N2和O6完全稳定（补充图S4b条). 因此，这种高度保守的基于Arg429–WA1的II类机制可能表明，与I类CPD光解酶相比，它对不同CPD底物的耐受性更高，其中TT二聚体的底物特异性更高并且未配对气泡的稳定似乎是一个相当不特定的被动事件（Essen&Klar，2006; Kim&Sancar，1991年 ).

此外，在我们的模拟中，当我们通过用甲缩醛键取代磷酸二酯来扰动PDM结构时，我们观察到络合物无法将WA1保持在其指定位置（图3c（c）). 此外，模拟似乎以两种不同的方式对缺少这些水作出反应。它要么保持PDM扭结角，代价是在未配对气泡中有一个大的、不稳定的、溶剂可及的体积（图3c（c），表1)，如模拟3（补充视频S3）中所示，或其修改了复合体的整体几何结构，接近FDM扭折角（表1，补充视频S4）。在后一种情况下，DNA几何形状的改变导致Arg429向dA8′方向后退，导致Trp431跟随（图3，补充图S4）。然后，一个不稳定、摆动的dC9进入未配对气泡，与dA7′发生异常相互作用。生成的未配对气泡小于含有磷酸二酯CPD的模拟中的气泡（表1). 有趣的是，Arg429、Trp431和Arg441阻塞了较小的体积，但dC9的加入完全弥补了这一点。因此，我们的模拟表明，在存在甲缩醛主链的情况下嗯CPDII–DNA复合体面临着一项看似不可能完成的任务：它可能以完全封闭的未配对空间或相反的空间为代价来维持DNA的生理扭曲（扭结角度），但并非两者兼而有之。

尽管很难证明dC9的抖动行为可能发生在体外，也许正是由于这些变化晶体结构，但不在PDM中晶体结构，在络合物I和络合物II之间观察到两种不同的构象（补充图S5）。此前，这两种构象被假设为对应于封闭（复合物II）和栓接（复合物I）状态（Kiontke等。, 2011)第二个是真正活跃的状态。关键的是，在栓接构象中，由于相对于其互补dG6′的横向位移，FDM中的dC9没有完全配对（补充图S5），而在PDM复合体和FDM结合复合体（复合体II）中Watson–Crick配对完全实现。因此，我们认为，Trp431旋转90°的栓接构象并不代表完全活性的蛋白质，而是解决气泡堵塞问题的构象对在存在甲缩醛CPD主链的情况下的扭转角。因此，这种构造不能代表嗯CPDII结合其天然底物，但更确切地说，它是酶在面对不寻常底物时可塑性的一个例子。

迄今为止，特定侧链在稳定光解酶-DNA复合物中未配对气泡中的具体作用尚未得到适当解决（Essen&Klar，2006）). 然而，对所有II类CPD光解酶序列的广泛分析表明，Arg429、Trp431和Arg441的BIR嗯CPDII具有与上述未配对气泡稳定模式一致的显著保护模式（补充图S1b条). 在这两种精氨酸中，只有Arg441是严格保守的，它形成了与病变内磷酸二酯酶骨架的定向盐桥。另一种是Arg429，可以被其他需要空间的残基取代，如谷氨酰胺、蛋氨酸或组氨酸。此外，大多数II类光解酶大多含有对应于Trp431的残基，其次是其他芳香族苯丙氨酸和组氨酸。有趣的是，只有PDM结构显示Trp431 N^∊1吲哚部分的原子与Asp428形成氢键（图2d日)虽然没有直接进入未配对气泡，但它是BIR的一部分。Asp428在所有II类光解中严格保守，并与Arg441形成盐桥（图2d日和补充图S1b条). 由此，我们可以推断Asp428、Trp431和Arg441的三联体形成螺栓状下部结构这有助于稳定未配对的泡沫。尽管Arg429可以被其他大量残基取代，至少在II类光解酶中是如此，但它们与未配对碱相互作用的功能在保持未配对气泡稳定性方面仍然至关重要。在I类光解酶中，出现了BIR的另一种保存模式（补充图S1b条)，如安CPDI–DNA复合物。有趣的是，在这个含有层内甲缩醛键的结构中，一个保守的BIR残基Arg404是唯一一个通过填充到蛋白质表面而与DNA没有任何相互作用的残基。显然，该残留物可以实现与Arg441相同的功能嗯CPDII通过采用替代的侧链构象来稳定脂内磷酸二酯。

总之，通过结合结构和计算研究，我们在这里研究了II类CPD光解酶结合其天然底物的方式。此外，我们已经表明，虽然先前发表的结构在描述II类CPD光解酶活性位点时是准确的，但整个结合区域并非如此。最后，我们证明了这一点嗯CPDII是一种非特异性的双链DNA结合蛋白，使用的工具与这类蛋白质如何影响DNA超微结构的整体观点一致。通过让我们确定迄今为止尚未被注意的BIR，这些结果将为进一步精炼或者重新思考CPD光解酶结合光损伤DNA的结构生物学，即蛋白质-DNA复合物中的外围效应器和水的作用。

5.相关文献

本文的支持信息中引用了以下参考文献：Crooks等。（2004年 )和埃森等。(2017 ).

支持信息

3D视图

PDB参考：马氏甲烷八叠球菌Ⅱ类CPD光解酶与完整的含磷酸盐CPD损伤复合物，5zcw

补充表格和图表。内政部：https://doi.org/10.107/S205225251800996X/mf5026sup1.pdf

补充视频S1。内政部：https://doi.org/10.1107/S205225218996X/mf5026sup2.mp4

补充视频S2。内政部：https://doi.org/10.107/S205225251800996X/mf5026sup3.mp4

补充视频S3。内政部：https://doi.org/10.107/S205225251800996X/mf5026sup4.mp4

补充视频S4。内政部：https://doi.org/10.107/S205225251800996X/mf5026sup5.mp4

致谢

我们要感谢Stephan Kiontke博士对蛋白质纯化和结晶的有益讨论。我们还要感谢Andrew H.-J.Wang教授和Wen-Jin Wu博士在项目设置阶段的有益讨论。此外，我们还感谢大和教授琥珀色-兼容CPD和FADH^负极这些参数是公开的，川野幸树博士和山本正树教授在我们的同步加速器实验中给予了他们的帮助。此外，我们感谢Gusti Ngurah Putu Eka Putra先生和Po-Hsun Wang先生在样品制备和晶体低温保护方面的帮助。我们感谢台湾国家同步辐射研究中心（NSRRC）对台湾光子源05A微晶照相光束线的束时分配。经日本同步辐射研究所（JASRI；提案2016A2507、2016B2507、2017 A2576和2017B2576）批准，在SPring-8的BL32XU光束线上也进行了同步辐射实验。

资金筹措信息

已确认以下资助：台湾科技部（向台湾蛋白质项目授予编号：MOST105-0210-01-12-01、MOST106-0210-01-15-04和MOST107-0210-01-19-02）；材料与器件网络联合研究中心合作研究计划（批准号：20163007和20173008）；和空军科学研究办公室（批准号：FA9550-14-1-0409）。

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