Protein crystal lattices are dynamic assemblies: the role of conformational entropy in the protein condensed phase

Dimova, M.; Devedjiev, Y.D.

doi:10.1107/S2052252517017833

研究论文

IUCrJ大学

第5卷| 第2部分| 2018年3月| 第130-140页

国际标准编号：2052-2525

https://doi.org/10.1107/S52252517017833

生物学|医学

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蛋白质晶格是动态组装：构象的作用熵在蛋白质浓缩阶段

玛格丽塔·迪莫娃 ^一和Yancho D.Devedjiev先生 ^一 ^*

^一弗吉尼亚大学麻醉系，1215 Lee Street，Charlottesville，VA 22908，USA
^*通信电子邮件：idd3cgm@gmail.com

K.Moffat编辑，美国芝加哥大学(2017年5月15日收到； 2017年12月13日接受； 2018年1月10日在线)

直到最近，构象熵蛋白质晶体内的接触被认为是一种极不可能发生的事件。一项基于最精确精细蛋白质结构的研究表明，侧链构象熵蛋白质晶格中可能存在静电紊乱。目前的研究使用了使用系综优化的结构精细化表明尽管矛盾，构象熵很可能是蛋白质凝聚相出现和完整性的主要因素。这项研究揭示了形状的作用熵局域熵在结晶开始后膨胀。首次提出了晶格中蛋白质原子分子间相互作用的完整模式，这表明范德瓦尔斯相互作用在晶体形成中占主导地位。

关键词：蛋白质晶体;静态障碍;动力障碍;构象熵;弹性分子形状;振荡晶格;局部熵力;X射线晶体学;结晶，结晶;晶体生长.

类似文章

1.简介

鲍德温分析了蛋白质折叠驱动力的性质（鲍德温，2014 )并重新审视考兹曼关于疏水因子的关键作用的理论。Kauzmann解释了疏水因子是如何工作的（Kauzmann，1959 )基于Frank和Evans提出的碳氢化合物在水相溶剂化时形成水合壳的建议（Frank&Evans，1945 ). 当疏水侧链埋在蛋白质的核心时，水合壳的自由能损失，提供了使蛋白质折叠合理化所需的缺失自由能。

蛋白质分子是动态系统，与环境相互作用。弗劳恩费尔德及其同事将围绕蛋白质分子的溶剂描述为包含熵（弗劳恩费尔德等。, 2009 ). 蛋白质表面提供了锚定水合壳的供体/受体原子。蛋白质结晶被认为是熵驱动的相变其根源在于蛋白质分子组装成水化壳后，溶剂分子迁移到本体溶剂，导致水化壳中的自由能损失晶格（维克洛夫等。, 2002 ). 与蛋白质折叠相比，在蛋白质结晶过程中，少量水分子会从水合壳中流失（Vekilov，2003 ).

蛋白质晶体是一种自组装的形式，在分子之间存在充满无序溶剂的空间时，它不同于无机晶体和有机晶体（Matthews，1968 ). 晶体中的空隙和本体溶剂中的热运动是导致熵在蛋白质结晶阶段。在X射线结构研究中熵已被描述为静态和动态无序（Burling&Brünger，1994 ). 无序的氨基酸侧链或多肽片段在电子密度图中的分辨率很低，可能需要高精度的数据来进行可视化（Marquart等。, 1980 ; 利布施纳等。，2013年 ).

很久以前使用核磁共振进行的结构研究表明，溶液中蛋白质分子的构象不均一性（有关综述，请参阅Montelione等。，2013年 ). 以高分辨率测定三维结构的受试者通常是小蛋白质（<20kDa）；然而，在某些情况下，高达50kDa的蛋白质结构已被合理准确地测定（Serrano、Aubol等。, 2016 ; 塞拉诺、杜塔等。, 2016 ). 核磁共振波谱用于表征从皮秒到小时（兰格等。, 2008 ; 科弗曼等。, 2016 ). 另一方面，后者是核磁共振的一个局限性，因为难以量化大范围内发生的动态运动。为了避免后一个限制，Lindorff-Larsen和同事开发了动态集成精细化（DER）方法，并使用该方法从X射线结构开始产生泛素的结构集成，并使用核磁共振（Lindorff-Larsen）获得的实验数据交叉验证该集成等。, 2005 ).

分子动力学（MD）模拟通常用于为使用X射线衍射方法获得的蛋白质分子三维模型添加进一步的维度：动力学。MD模拟程序预测蛋白质分子中单个原子的运动，并提供有关分子动态行为的信息，这些信息是理解催化机制、蛋白质-蛋白质相互作用、药物设计和配体结合相关过程所必需的。最近精细化技术（莱文等。, 2007 )通过使用蛋白质动力学统一模型的基础思想，缓解了观察到的参数和精炼参数之间的一致性（弗劳恩费尔德等。, 2009)描述了蛋白质分子在大量构象亚状态（CS）之间的转换。合奏精细化将MD模拟与传统晶体学相结合精细化。通过用精细分子的多个拷贝（系综成员）代替原子波动，得到的一组结构（系综）提供了关于蛋白质分子的更真实的信息。蛋白质动力学的统一模型假设，一个蛋白质可能会在能量景观中形成大量的CS器官。对于包含100个残基的多肽链，CS的数量为10¹⁰⁰由于这个原因，溶液中没有两个分子同时采用相同的构象，也没有一个分子两次返回相同构象。蛋白质分子在CS之间切换，在低能量层中找到一种相关（功能）构象，称为α-盆地（弗劳恩费尔德等。, 2009).

在检查晶体酶活性的旧数据中有大量证据（Doscher&Richards，1963）; 卡洛斯，1964年 ; 斯莱特曼和德格拉夫，1969年 ; Quiocho公司等。, 1972 ; Honikel&Madsen，1973年 ; Kasvinsky&Madsen，1976年 ; 斯皮尔伯格等。1977年 ). 虽然一些酶可能在晶体中失去了部分活性，但它们仍然保持催化活性。后一项观察表明，蛋白质在晶体中的状态与溶液中的状态相似，蛋白质动力学的统一模型（弗劳恩费尔德等。, 2009)也适用于蛋白质的结晶状态。然而，在另一组晶体酶中催化活性被抑制，可能是由于晶体中的堆积力限制了特定酶的构象灵活性。最近的出版物提供了直接证据，支持晶体蛋白质通用模型的有效性概念。墙壁等。(2014 )利用从蛋白质晶体获得的精确测量的散射X射线衍射来研究结晶蛋白质的构象动力学，并使用MD模拟来分析结晶相中分子的动力学。他们发现葡萄球菌核酸酶的八种亚稳态结构从4毫微秒延伸到1100毫微秒。马等。(2015 )观察到泛素结构中的摇摆运动以不同的形态结晶。使用三种技术，即X射线衍射、固态核磁共振和MD模拟，他们发现泛素的三维结构在0.1 ms到100µs的时间范围内振荡。The overall rocking motions in the晶体结构可能会导致与本研究图3所示类似的振荡晶体接触。

合奏精细化（莱文等。, 2007)与单一模型相比，对X射线数据的准确性不太敏感细化，并且已经证明可以改善细化统计，因此，提供了有关正在调查的生物大分子的更详细信息（伯恩利等。, 2012 ; 福尔纳里等。, 2014 ). 合奏精细化在蛋白质核心中发现了相关的功能动力学。例如，在20个选定的蛋白质中的三个中，在多种构象中发现了残基簇（多达16个），这些构象可能有助于蛋白质内配体的运动（伯恩利等。, 2012). 虽然有证据表明蛋白核心中存在空隙，但人们普遍认为蛋白核心是一个紧密排列的基质（Katti等。1989年 )以及动力障碍（Hetzel等。, 1976 ; 瓦格纳等。, 1976 ). 根据最近的数据，涉及残留物簇的堆芯动力学发生的程度，被定义为“熔融堆芯”；然而，它可能与生物学有关（伯恩利等。, 2012). 在一些蛋白质中，例如脯氨酸异构酶，其结构在室温下可用（PDB入口3千牛顿; 弗雷泽等。, 2009 )以及在低温条件下（PDB入口3千米; 弗雷泽等。, 2009)，核心的动力存在差异。虽然核心中的11个侧链在环境温度下在结构中形成动态簇，但在低温下它们是有序的，这表明构象退火到基态没有生物学意义（Burnley等。, 2012).

使用系综优化的蛋白质分子表面动力学的后果知之甚少精细化。本论文旨在填补这方面的文献空白。在这里，我们报道了一个动态与蛋白质晶格的时间平均分析表明，蛋白质晶体实际上是由具有弹性、振荡形状的分子组成的动态组合体，有效地将其定义为属于自己类别的材料。它们由两个相位组成：一个相位由对应相位的对称算符控制空间组，另一种是由于形状上的振荡而处于更接近无序体溶剂的状态。目前的观察结果扩大了形状的作用熵和局部熵力（van Anders等。, 2014 )结晶开始以上。蛋白质动力学的作用首次扩展到非对称单元与晶体的对称性有关，这是晶体物理学中的一个主要决定因素。还制定了一项原理，该原理可能用于确定胶粒在拥挤环境中的行为。我们的假设得到了新兴数据的证实（Wall等。, 2014; 马等。, 2015)为蛋白质晶格动力学的进一步实验研究提供了平台。

2.材料和方法

本研究的基本概念建立在蛋白质动力学的统一模型上（弗劳恩费尔德等。, 2009). 蛋白质晶体中的空隙充满了无序溶剂（Matthews，1968)，这将生成熵在蛋白质阶段，这将迫使蛋白质晶格以相关或非相关模式振荡（Devedjiev，2015 )为了保持晶体的完整性。

目前的研究假设在蛋白质核心中发现的“熔融”状态（伯恩利等。, 2012)也可能在表面发现，可能与晶体接触有关。因此，在一组集合成员中分析晶体接触，以确定是否所有接触都是内聚的。该研究调查了氢键、范德瓦尔斯接触和静电相互作用的发生情况（如果晶体是在pH值下获得的，则表明感兴趣的氨基酸链是电离的），以及对称性相关伙伴之间缺乏相互作用的情况。

墙壁等。(2014)和Ma等。(2015)使用四种独立的技术观察到，晶体中蛋白质分子的主链在100µs到4ns的时间范围内振荡。如果我们假设这些蛋白质的侧链在类似的范围内振荡，并且对于由100个氨基酸残基组成的蛋白质，取振荡速率100µs的最低值，那么每秒一个分子的振荡总数将为100⁵。我们构建了一个假设模型晶体，其中包含一个分子非对称单元在每个晶体学方向上被一个对称相关的邻居包围。假设模型晶体的独立振荡总数为100^{15 625}.甚至考虑到构象中的一些限制自由度在晶体接触中的残余物中，这个数字毫无意义，只是生动地证明了构象的定量评估熵在微观层面上，蛋白质晶体不是一个科学感兴趣的课题。因此，正如我们之前的研究（Devedjiev，2015)，我们使用统计方法来评估构象熵在蛋白质晶格中。

定量评估熵蛋白质结晶的宏观水平之前已经进行过（Veklov，2003)，并且通过实验确定熵是蛋白质晶体形成的驱动力。已经尝试确定构象的作用熵在微观层面上，并将其与晶体接触所涉及的氨基酸的物理特性联系起来（Derewenda，2004 ; 德雷温达和维克洛夫，2006年 ; Cie Shi lik&Derewenda，2009年 ). 这些研究使用了一种包括侧链构象系数的形式熵在均匀条件下计算的单个氨基酸侧链的（SCE系数）：蛋白质折叠。SCE系数不适用于非均匀条件下发生的蛋白质结晶（Devedjiev，2015)毫不奇怪，这些研究的结果与通过直接观察获得的结果不相关（Devedjiev，2015; 达斯古普塔等。, 1997 ). 为了规避上述限制，并评估构象熵在微观层面上，我们构建了一个定性物理模型，定义了非对称单元作为具有振荡形状的弹性实体，被堆积力困在晶格中。笼壁被描述为对称相关分子之间沿着相应的晶体学轴的接触区域。评估构象的空间分布熵，分析了两种类型的保持架：各向异性（空间群P（P）2₁)和各向同性（空间群P（P）2₁2₁2₁). 我们使用联系人（获胜者等。, 2011 )并研究了氨基酸侧链相关结晶方向（笼壁）的布居，以选择系综成员。还计算了感兴趣的系综成员以及晶体接触中的SASA的溶剂可及表面积（SASA）。

20个蛋白质结构用集合进行了优化精细化已从下载https://datadryad.org/resource/doi:10.5061/dryad.5n01h包括伯恩利的工作数据集等。(2012). 对蛋白质结构和对称性相关伙伴进行立体化学分析库特（埃姆斯利和考坦，2004年 ). 使用最小2.2º和最大5.0º的距离截止值分析了对称相关分子之间的接触。SASA的计算探针半径为1.4º，最小截止值为2.0º²对于溶剂暴露残留物。带电侧链之间静电相互作用的截止值为6º。所有晶体计算均采用中央对手方清算所4（优胜者等。, 2011). 插图是用PyMOL公司（DeLano，2002年 )和库特（埃姆斯利和考坦，2004年).

3.结果和讨论

最新发现（Devedjiev，2015)已经证明静态紊乱和构象熵尽管现有理论中指出了这些观点，但蛋白质晶体晶格仍能耐受（Derewenda，2004; 德雷温达和维克洛夫，2006年). 进一步评估构象的作用熵在蛋白质结晶过程中，使用集合精炼技术对蛋白质结构进行了分析（参见§2).

3.1. 确定构象的证据熵作为蛋白质凝聚相出现和完整性的主要因素

表1中给出的数据和2，其中计算了转录抗终止剂（PDB条目）结构中39个可用系综成员的溶剂可及表面积（SASA）3千瓦时; 罗德里格斯等。, 2009 )在总共600名成员中，前50名为HIV水解酶结构（PDB条目1千兹克; 雷林等。, 2002 )，显示定量表示蛋白质形状的变量的随机分布。所研究的系综成员选择的晶体接触中SASA的差异3千瓦时达到11%，而总SASA的变化为13%。在HIV蛋白酶中，差异更大：晶体接触中的SASA为17%，总SASA为16%。这些明显的巨大差异表明，一些系综成员可能不会在特定的分子间区域形成晶体接触。

表1
各向异性笼中的表面动力学（空间组P（P）2₁)

SASA是针对转录反终止子（PDB条目）结构中的39个信号群给出的3瓦; 有关详细信息，请参阅文本）。分子的形状由SASA的大小定量表示。

	SASA联系人	SASA合计
SASA最小值（Ω²)	1774	6002
SASA最大值（Ω²)	1985	6934
差异（%）	11	13

表2
各向同性笼中的表面动力学（空间组P（P）2₁2₁2₁)

HIV蛋白酶结构中的600个集合被精炼为1.09Ω分辨率（PDB条目1千兹克; 有关详细信息，请参阅文本）。分子的形状由SASA的大小定量表示。

	SASA联系人	SASA合计
SASA最小值（Ω²)	1513	5133
SASA最大值（Ω²)	1819	6109
差异（%）	17	16

在极地笼子里自由度沿着双螺旋轴，因为如果有垂直于极轴的对称算符，它们将在所有晶体方向上提供相同的环境。的确，灵活的循环A类55–A类67和B类53–B类63和终端探索自由度作为一个刚体（图1一和1b条和补充图S1）。然而，在非极性笼中，三个正交的螺旋轴沿着所有三个晶体轴提供了相同的晶体环境，柔性环A类66–A类69和B类66–B类69和终点的运动受到限制（图1c（c）和1d日). 此外，对熵在从两个分子中随机选择的五个系综成员中，没有发现对称算符在分子间接触中的任何作用（表3和4). 010和0-10方向笼壁中氨基酸侧链种群的差异可以通过空间组 P（P）2₁允许自由度沿极轴（参见§2). 然而，氨基酸侧链在100，−100和001，00−1方向上的分布差异并不遵循对称性定律，对称性算子为P（P）2₁ 空间组，这要求笼壁中氨基酸侧链在对称相关方向上的数量相等（补充表S3）。

表3
随机选择的系综（空间群）各向异性笼中的表面动力学P（P）2₁; PDB条目3千瓦时)

有关详细信息，请参阅文本。参考，参考分子。Sym，对称相关分子。

	笼墙
乐团编号。	100	−100	010	0−10	001	00−1	联系人中的SASA	SASA合计
1
接触残留物数量	40	72	0	23	20	69
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	4036/4012	6995/7671	0	2222/2585	1947/1867	7564/6646	3853	13043
2
接触残留物数量	28	0	15	15	24	32
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	2630/3129	0	1532/2006	第1411页，共1646页	2398/2066	3358/3283	3832	12960
三
接触残留物数量	31	65	0	24	28	58
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	3111/3281	7016/6887	0	2162/3026	3033/2773年	5965/5751	3696	12516
5
接触残留物数量	32	61	0	15	25	35
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	3430/4041	6984/7123	0	1879/1557	3173/3685	4723/5218	3662	12409
8
接触残留物数量	43	74	0	20	25	60
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	4204/4479	7529/8047	0	2301/2674	2365/2518	6216/5462	3804	12860
最小值（Ω²)							3662	12409
最大值（Ω²)							3853	13043
最小值（参考/符号）²)	2630/3129	6984/7671	0/0	1411/1557	1947/1867	3358/3283
%	16	9		9	6	2
最大值（参考/符号）²)	4036/4479	7529/8047	1532/2006	2301/3026	3173/3685	7564/6645
%	10	6		24	14	12

表4
随机选择的系综（空间群）中各向同性笼中的表面动力学P（P）2₁2₁2₁; PDB条目1千兹克)

有关详细信息，请参阅文本。参考，参考分子。Sym，对称相关分子。

	笼墙
乐团编号。	100	−100	010	0−10	001	00−1	联系人中的SASA	SASA合计
9
接触残留物数量	64	24	0	7	0	18
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	7179/6519	2073/2383	0	825/899	0	1567/2166年	3498	11809
18
接触残留物数量	58	28	0	9	0	19
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	6102/5585	2278/2355	0	948/1156	0	1956/2261	3493	11827
26
接触残留物数量	57	26	0	7	0	21
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	5997/5150	2117/2289	0	870/793	0	1968/2277	3155
27
接触残留物数量	59	27	0	7	0	18
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	6197/5266	2126/2290	0	第830页/849页	0	1519/2057	3147	10291
32
接触残留物数量	64	26	0	7	0	19
笼壁中的SASA（Sym/Ref）（Ω²)	5727/5110	2259/2222年	0	878/840	0	1894/1698	3146	10630
最小值（Ω²)	57	24	0	7	0	18
最大值（Ω²)	64	28	0	9	0	21
最小值（参考/符号）²)	5727/5110	2073/2222	0	825/793	0	1519/1698	3146	10291
%	11	7		4		10
最大值（参考/符号）²)	7179/6519	2278/2355	0	948/1156	0	1968/2277	3498	11809
%	9	三		18		14

图1
使用系综精化技术精化的蛋白质结构的主链原子中的刚体动力学。(一)转录反终止子（PDB条目）结构中的五个集合成员3瓦)显示由晶格对称性启用的两个柔性环的构象灵活性。(b条)分子N末端的柔性B类乐团成员的颜色编码如下：1、绿色；2、蓝色；3、薰衣草；5、黄色；8，粉红色。(c（c）)HIV水解酶结构中的五个集合成员（PDB条目1千兹克)由于三个正交的双螺旋轴定义了对称算子并限制了自由度。(d日)HIV蛋白酶的N-末端和C-末端没有表现出灵活性。着色方案如下：合奏成员9，绿色；合奏成员18人，蓝色；合奏成员26人，薰衣草色；合奏成员27，黄色；乐队成员32人，粉红色。C之间的距离^α还显示了系综成员的原子。

包含HIV水解酶结构中所有600个信号群的快照（补充图S2）表明，一些信号群成员距离太远，无法与对称性相关分子相互作用。在图2中(一), 2(b条), 2(c（c）)和2(d日)一对特殊的对称相关残基的振荡表明，这对残基有四种状态：形成盐桥（图2一)，形成静电相互作用（图2b条)，进行静电相互作用和范德瓦尔斯接触（图2c（c）)最后，缺乏接触（图2d日). 在代表HIV蛋白酶和转录抗终止剂结构的成对集合成员中比较晶体接触（图3一和3b条)发现了接触区侧链之间的内聚和非内聚星座的随机分布。在这里，我们认为蛋白质晶体晶格中的术语“接触残基”和“接触面积”由于表面的灵活性而本质上是相对的，并且是动态的。时间平均值晶体结构可能无法识别所有可能的接触残留物。图3(一)和补充图S2、S3和S4生动地展示了动态蛋白质模型的一系列振荡，远远超出了时间平均模型中的静态无序。表5给出了时间平均模型和选定集合成员之间不一致范围的数据我们得出结论，系综成员中任何表面暴露的残基都有可能基于构象形成相互作用自由度，与对称性相关的分子在任何时候都可以被定义为接触残基。上述数据清楚地表明熵只会增加发生接触事件的概率，导致内聚相互作用，该相互作用将涉及氢键、范德华或静电相互作用（焓因子）。已知的表面收缩理论熵在蛋白质结晶中，构象与熵蛋白质分子的结晶倾向（Derewenda，2004). 构象熵蛋白质分子的微观参数和单个粒子的特性，与物理定律无关熵结晶，这是一个宏观参数和系统的一个特性（Derewenda&Vekilov，2006). 这些是不兼容等级的参数。在蛋白质结晶中，熵只考虑了有序相（晶体）和无序相（溶质）中粒子数量的变化，而忽略了粒子的单个性质。在一个蛋白质分子整合到晶格，许多水分子将离开有序的水合壳层，加入无序的本体溶剂等。, 2002); 因此熵系统的自由能将增加，自由能将减少。与当前理论相反（Derewenda，2004)，本研究表明构象熵似乎是支持蛋白质凝聚相形成的主要因素，并与焓保持阶段的完整性。

表5
转录抑制因子中时间平均模型和选定集合成员的比较

所有距离均以奥数表示。

合奏	1	2	三	5	8
C类^α	1.49	1.36	1.37	1.20	1.53
所有原子	1.89	1.85	1.78	1.81	1.91
C类^α在循环中A类55–A类67和B类53–B类63	3.37	3.37	3.15	2.72	3.50
回路中的所有原子A类55–A类67和B类53–B类63	3.94	3.76	3.83	3.52	3.92

图2
蛋白质晶体接触的随机性。(一)Glu与HIV水解酶结构中系综成员90的盐桥A类参考分子和Lys的21A类43个对称相关分子形成一种内聚相互作用，它是晶格。(b条)在HIV水解酶结构中的集成成员40中，GluA类参考分子和Lys的21A类通过静电相互作用实现43个对称相关分子接触。(c（c）)合奏成员28中的盐桥和范德瓦尔斯相互作用。(d日)HIV水解酶Glu结构中的集成成员1A类21和LysA类43sym不位于形成晶格接触的附近。

图3
蛋白质晶体中的晶格动力学。(一)极笼：转录抗终止剂及其对称性相关伙伴结构中的晶体接触。(b条)非极性笼：HIV水解酶结构整体中的晶体接触。在这两种情况下都有十名合奏成员。参考分子显示为黄色键，而对称相关分子显示为氰键。

3.2. 证明局部熵力是决定胶粒在拥挤环境中行为的一般因素的证据

之前已经发现（van Anders等。, 2014)那个形状熵是结晶开始下方局部致密堆积的驱动力。本研究比较了表面的出现熵在晶体与类似表面接触的区域熵在与接触无关的分子区域。表6中给出的结果和7显示增加的本地熵位于极性晶格。与分子的非接触区域相比，接触区域的柔性大2.14倍（补充表S1和S2；最大偏差为12.83Å）。在非极性笼中，相应值为1.67倍，最大偏差为6.49？（表7和8; 补充表S3和S4），这与增加的自由度用于极性笼中的侧链。有趣的是，在极性笼中，二级结构在接触面积上表现出显著的灵活性，接触面积是极性笼的5.11倍，而非极性笼只有1.27倍。

表6
形状熵在蛋白质浓缩阶段：极性笼

形状熵的出现是由转录抗终止剂（PDB条目）晶体触点中49个表面暴露氨基酸残基的波动决定的3千瓦时). C之间的差异^α原子和末端氨基酸残基表示为表面构象熵的量度。位于不对称单元开关方向边缘的残基的一些氨基酸侧链占据系综内相邻的笼壁或与对称相关分子失去接触。

合奏团成员编号。	C中的差异^α原子（Ω）	末端侧链原子的差异（Ω）	笼壁侧链的出现
1	0.98	1.20	−100, −1−10, 001, 00−1, −10−1, 100, 0−10, 0−1−1
2	0.90	1.81	−100, −1−10, 001, −10−1, 00−1, 100, 0−10, 0−1−1
三	0.81	1.36	−100, −1−10, 001, 00−1, −10−1, 100, 0−10, 0−1−1
4	1.03	1.50	−100, −1−10, 001, −10−1, 00−1, 100, 0−10, 0−1−1
5	0.73	1.38	−100, −1−10, 001, 00−1, −10−1, 100, 0−10, 0−1−1
6	0.75	1.25	−100, −1−10, 001, 00−1, −10−1, 100, 0−10, 0−1−1
7	0.79	1.37	−100, −1−10, 001, −10−1, 00−1, 100, 0−10, 001, 0−1−1
8	1.08	1.51	−100, −1−10, 001, −10−1, 100, 0−10, 0−1−1, 00−1
9	0.87	1.52	−100、−1−10、001、−10−1、00−1、100、0−10、0−1−1、−10−1
10	0.84	1.76	−100, −1−10, 001, 00−1, −10−1, 100, 0−10, −10−1, 0−1−1
最小值	0.73	1.20
最大值	1.08	1.81

表7
形状熵蛋白质凝聚相：非极性笼

形状熵的出现是由HIV蛋白酶晶体接触物（PDB入口）中36个表面暴露氨基酸残基的波动决定的1千兹克). C之间的差异^α原子和末端氨基酸残基表示为表面构象熵的量度。位于不对称单元开关方向边缘的残基的一些氨基酸侧链占据系综内相邻的笼壁或与对称相关分子失去接触。

合奏团成员编号。	C中的差异^α原子（Ω）	末端侧链原子的差异（Ω）	笼壁侧链的出现
1	0.05	0.84	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
2	0.05	1	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
三	0.12	0.92	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
4	0.19	0.73	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
5	0.09	0.67	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
6	0.14	0.78	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
7	0.13	0.65	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
8	0.13	0.67	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
9	0.18	0.82	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
10	0.17	0.78	00−1, 100, 10−1, −100, 0−10, 1−10
最小值	0.05	0.65
最大值	0.19	1

表8
两种蛋白质（高电位铁硫蛋白（PDB入口）的晶格中按类型发生的分子间相互作用3a38年)和RhoGDI抑制剂（PDB进入1公里)，证明了晶格中天然（与H原子）蛋白质中氢键和静电相互作用的重要性

		氢键		静电		范德瓦尔斯，非氢原子		范德瓦尔斯，氢原子介导
PDB条目	交互总数	不。	%	不。	%	不。	%	不。	%
3a38年	6142	21	0.3	5	0.09	157	三	5995	97
3a38年−H	183	21	11	5	三	157	86
1公里	5908	34	0.6	三	0.05	117	2	5764	97
1公里−H	144	24	17	三	2	117	81

当前研究中的数据是从20个用系综优化的结构中推断出来的细化，以及我们之前的研究中报告的基于105个高分辨率蛋白质结构的晶体接触中构象柔韧性（表面熵）的发生（Devedjiev，2015). 数据扩展了形状的作用熵作为形成胶态凝聚相的驱动力，并在结晶开始之前保持其完整性。因此，它们提供了坚实的证据，涵盖了生成和保持自组装胶体形成完整性的所有实验条件。我们建议，由于这项原则的一般性，可以拟定如下：在自组装系统中，在拥挤的环境中，含有溶解在液相中的胶体粒子，粒子之间的接触使局部熵达到最大。这也可以表示为公式

$[\Delta S_{\rm c}>\Delta S-{\rm-nc}，\eqno（1）]$

哪里ΔS公司_c（c）是构象的变化熵晶体接触区域中从液相到晶相的转变ΔS公司_数控是构象的变化熵在不涉及晶体接触的区域。这里，我们需要指出，这一原则与Wukovitz&Yeates（1995）提出的原则相关 )对于蛋白质晶体晶格中的最小唯一接触数自由度对于晶体中的蛋白质分子。

严格考虑这一原则的不寻常但合乎逻辑的结果是，蛋白质晶体不属于物质固态的定义：它们是属于自己类别的材料。我们需要注意的是，上述公式并不代表严格的数量关系；这不是一个等式。它只是在发生概率的意义上比较两个量。构象发生的概率更高熵在晶体接触中发现，为扩大熵在凝聚相的一般情况下。

3.3. 信号群表示蛋白质结构在环境温度下的实时振荡

自结晶学早期以来，人们就知道蛋白质晶体代表两个相：由对称算符控制的有序蛋白质相和填充晶格中分子之间空隙的无序溶剂相。散装溶剂含有熵和驱动器熵在围绕蛋白质的水合外壳中（弗劳恩费尔德等。, 2009). 与蛋白质相比，蛋白质水合外壳在其自身的时间尺度上波动，差异从皮秒到纳秒（尼克等。, 2012 ). 图1(一)，1(b条)，1(c（c）)和1(d日)二级结构中的振动可以被合理化为对称算符描述的刚体运动。如补充图S2和图2所示的合奏成员(一), 2(b条)和2(c（c）)传统上认为是晶体体积内侧链的不同构象，其定量特征是占有因子。在报道转录抗终止剂和HIV水解酶结构的研究中，情况确实如此，因为数据是在低温下从玻璃态晶体中收集的。在环境温度下，图2中所示的构象(一), 2(b条)和2(c（c）)是由对称算符控制的状态，因为它们是与有序相相互作用的结果。图2所示的构象(d日)然而，补充图S2中的一些是瞬态的，因为它们与动态相（水合壳或大块溶剂）接触，并将在时间尺度上探索构象空间，该时间尺度是使用基于X射线自由电子激光的先进结构方法进行实验测量的。墙壁等。(2014)和Ma等。(2015)测定了主链原子在微秒到皮秒范围内的振荡，这在上述方法的范围内。用系综精化20种结构的晶体接触分析精细化（伯恩利等。, 2012)表明晶格中的动力学是蛋白质晶体的一个共同特征。

3.4. 范德瓦尔斯相互作用在蛋白质晶格的形成中占主导地位

图2(一), 2(b条)和2(c（c）)证明蛋白质分子中存在的所有类型的相互作用也发生在晶体接触中。我们进一步量化了两种蛋白质分子晶格中按类型发生的相互作用：一种通过实验确定了H原子的位置（PDB条目3a38年; 塔克达等。, 2010 )另一个具有理论预测位置（PDB条目1公里; 马蒂亚等。, 2002 ). 结果如表8所示令人惊讶的是，97%的接触是由氢介导的晶体接触引起的。这些结果揭示了H原子在晶体蛋白质中前所未有的作用`剥离天然形式的H原子蛋白质分子为氢键和静电相互作用提供了人工提升的作用，并掩盖了真正的相互关系。我们称之为“章鱼效应”。章鱼在珊瑚表面移动时，会使用覆盖着吸盘或吸盘的手臂。位于手臂下表面的吸盘数量众多，即使手臂的一部分与珊瑚表面分离，其余部分的吸盘仍会使章鱼的身体牢牢附着在珊瑚上。在中振荡时晶格，即使特定侧链与对称性相关分子失去接触（图2d日和3，补充图S3和S4）仍然存在大量相互作用以保持蛋白质的完整性晶格（表8). 这解释了范德瓦尔斯相互作用在蛋白质晶格形成中的主导作用，这是一个以前从未被认识到的概念。

3.5。合奏精细化证实时间平均模型并不是溶液中蛋白质结构的最准确表示

林多夫-拉森等。(2005)将单个静态结构与一组结构进行了比较，这些结构被限制为与两组不同的核磁共振参数同时拟合：结构（NOE，J型耦合和RDC）和动态(¹⁵N松弛速率）。比较表明，集合产生了更好的交叉验证统计数据。

众所周知，动力无序不在单一模型的范围内精细化。利布施纳等。(2013)首先定量评估了时间平均模型的再现性，发现传统的精细化即使在原子分辨率（0.75º）下，该技术也无法成功地模拟蛋白质结构的柔性部分。传统的X射线数据采集方法依赖于X射线衍射物理，该物理基于光子与电子的相互作用，电子以不可预测的方式围绕原子核循环，并且是随机的（Johnson&Blundell，1976 ). 出于这个原因，在第三代同步加速器上采集具有合理统计数据的数据可能需要至少几分钟的时间，或者在家庭源上需要更长的时间。在数据收集期间，晶体中的蛋白质分子可能采用了大量实验可测量的构象。合奏细化，莱文及其同事使用医学博士对动态障碍进行建模，并证明了整体精细化在改善晶体学和R（右）_自由的与数据准确性无关的因素（莱文等。, 2007). 进一步研究改进了集成算法精细化发现精练的整体所呈现的蛋白质核心中的熔体（伯恩利等。, 2012). 表5, 6和7定量地说明了集合精制蛋白质晶格中发生的构象变化的规模。属于相同化学实体的系综中原子位置的差异大于来自不同物种的同源蛋白质的典型偏差，其序列相似性远低于100%。记住构象自由度晶体中的温度受晶格类型的限制（补充图S3和S4），在溶液中，人们可以预计与时间平均模型的偏差甚至比表5中报告的更大.

4.结论

我们在这里通过构象分析显示熵在两个属于极性和非极性空间群的蛋白质晶格中，蛋白质凝聚相的分子间接触本质上是动态的。

基于我们之前分析过的20个集合精炼结构和105个结构的证实，我们已经表明形状的作用熵并且局部熵力在结晶开始之前膨胀，我们已经制定了一个原理，确定了胶粒在拥挤环境中的行为。

在时间平均模型中，静态无序被定义为由占据因子决定的蛋白质晶体体积内的侧链构象分布。实际上，在环境温度下，它代表构象态的集合。

对含有实验确定的H原子或理论指定的H原子的两个天然蛋白质分子晶体中的分子间相互作用的分析生动地表明，氢介导的范德瓦尔斯相互作用是维持蛋白质晶体晶格完整性的主导力`剥离H原子的蛋白质分子会导致氢键和静电相互作用的人为提升，并掩盖蛋白质接触区的真正相互关系。

支持信息

补充图S1和S2。内政部：https://doi.org/10.1107/S02522521717833/mf5019sup1.pdf

致谢

YD设计了这项研究，YD和MD进行了这项调查，YD分析了数据，YD与MD撰写了手稿。作者声明没有竞争性的经济利益。

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