1.背景

第一台硬X射线自由电子激光器（XFEL），即Linac相干光源（LCLS），于2009年在斯坦福附近的美国能源部SLAC实验室开始运行（Pellegrini，2012）). 第二个项目于2012年在日本SACLA实验室启动（石川等。, 2012). XFEL在韩国（PAL）和瑞士（SwissFEL）的初步运行于2016年末开始，而欧洲XFEL（EuXFEL）在德国汉堡DESY实验室的波束时间提案于2017年初被接受。这为晶体学和原子分辨率成像创造了许多新的机会，时间尺度从飞秒到秒。对于结构生物学来说，更重要的是，它允许在室温下进行时间分辨衍射，同时避免了辐射损伤的大多数影响，此外还允许研究对于传统晶体学来说太小的亚微米晶体。“衍射-破坏”方法使用超过损伤的方法，例如，使用持续时间为40 fs的X射线脉冲，在不断增长的光电子级联开始二次损伤之前产生X射线衍射图案，随后破坏样品。这使得可以在室温下使用微晶以原子分辨率制作“分子电影”（定义见下文），而无需冷却以避免损坏。这可以在接近生理条件下，在这些分子机器运行的正确热浴中进行。虽然晶体中存在的挥发性缓冲液可能与蛋白质的工作环境不同，但许多酶仍以晶体形式保持活性（Hajdu等。, 1988).] 由于每个样品都会被脉冲破坏，因此需要连续不断地补充水合微晶，在脉冲束中以单列方式运行。然后，必须将它们的衍射图案合并到这一系列飞秒晶体学（SFX）技术中。

LCLS的典型脉冲可能包含约10个¹¹ 光子（8 kV）。这将从单个大型病毒中散射一百多万个光子，因此也可能从单个粒子（SP）中衍射。X射线束直径可小至0.1µm，光束中的部分能量扩散为10⁻³以及120 Hz X射线脉冲的重复率，受探测器的读出速率限制。目前（如下所述），对于单个病毒的散射，三维重建（需要大量注射）后的分辨率约为10nm。散射偶尔会在单个镜头中扩展到更高的分辨率，这目前不能为三维重建提供足够的数据。然而，布拉格反射通常是在0.2纳米分辨率的蛋白质微晶中检测到的。然而，当一立方微米的冷冻蛋白质晶体吸收了30 MGy的临界损伤剂量时，它将大约100万光子散射到布拉格光束中（欧文等。, 2006)，更大的剂量可以用于超过损伤的脉冲（巴蒂等。, 2012).

除了晶体学提供的受晶体形成限制的静态分子形状外，酶催化等化学反应还涉及蛋白质中随时间变化的构象变化。时间分辨晶体学领域（Moffat，2014; 施利希廷等。, 1990)如果这些原子运动与晶格。反应物可以扩散到晶体中（这可能比溶液中需要更长的时间），并且可以研究这种混合的结果，其优点是比溶液散射获得的空间分辨率高得多。我们将看到，由于衬底扩散到微晶的时间缩短，XFEL使用微米级晶体的能力可以显著提高时间分辨率。分子动力学也可以使用低温电子显微镜成像，使用从平衡系综中快速猝灭的样品来提供可以根据构象相似性排序的图像，从而显示为电影。光敏蛋白也可能在猝灭过程中受到闪光，猝灭时间为毫秒。

对于晶体来说，“布拉格增强”是一个强大的效应，因为布拉格峰的强度（不是角积分强度）使峰值高于噪声水平，与晶体中分子数的平方成正比，因此，即使是由10×10×10分子组成的纳米晶，其峰值强度也将是一个分子的一百万倍。（背景、像素大小和其他散射伪影可能会使这个简单的估计变得复杂。）

Bostedt回顾了XFEL在结构生物学中的应用领域等。(2016)斯彭斯（2017b条)和Schlichting（2015年)，在一期特别的哲学事务（Spence&Chapman，2014）)，在一期特别的结构动力学（Ourmazd，2015年)斯彭斯等。(2012). 在Ribic中可以找到XFEL操作的简单解释等。(2012)Pellegrini（2012）回顾了XFEL的发明历史). 亚利桑那州立大学正在与麻省理工学院（Graves）合作建造一个比校园实验室小的紧凑型XFEL等。, 2012)，并计划在德国汉堡的DESY实验室开发一种紧凑的阿秒XFEL（Kärtner，2016).

2.XFEL结构生物学实验方法

根据使用的技术，可以方便地对XFEL的结构生物学研究进行分类。这些XFEL数据采集模式包括快速溶液散射（FSS）、使用蛋白质微晶进行连续飞秒晶体成像（SFX）和单粒子成像（每次拍摄一个粒子）等。文献中使用的“纳米晶”一词相当松散：我们建议将尺寸大于1微米（最大尺寸）的晶体称为“微晶”。大多数发表的SFX研究都使用了几微米大小的晶体，但偶尔也会看到侧面分子少于50的晶体衍射。

目前最流行的模式（SFX）的历史和发明可以追溯到通过液体射流通过光束输送样品的早期提议（Spence&Doak，2004)以及该方法在同步加速器（夏皮罗）上的首次应用和发展等。, 2008)准备在LCLS的第一次晶体学实验中使用（查普曼等。, 2011)使用气动虚拟喷嘴（GDVN）进行样品输送（Weierstall等。, 2012). 在这种方法中，飞秒X射线脉冲从连续的水合微晶衍射，在聚焦的XFEL光束上以随机方向呈单列排列，如图1所示每个微晶都会被衍射后的光束破坏。在LCLS上以120 Hz的频率读取衍射图案。GDVN喷嘴可以提供快速同轴流动的气体来聚焦液体，从而避免堵塞，现在可以通过亚微米分辨率的双光子激光打印来制造。这种喷嘴形成方法（Nelson等。, 2016)为测试所有样品输送模式的原型开辟了新的可能性，包括用于快速溶液散射（FSS）的混合射流和片状射流。

图1 手持式气体动态虚拟喷嘴（GDVN）系统的环境SEM图像。当液体以大约10毫秒的速度进入真空时，高压气体的外层使其加速，由此可以看到液体变窄−1在那里，它分解成液滴，在大约10时冻结6°C秒−1（魏尔斯塔尔等。, 2012; 图片由D.DePonte提供）。图中显示的是布拉格光束，从流中的微晶散射到左上角，图中还显示了用于光敏蛋白质的泵浦激光。

如果我们在这些方法中增加在注射前将溶液混合在一起进行化学反应的可能性，我们可以获得图2中总结的四种常见实验方法。2它们是串行飞秒结晶术（SFX），每次一个蛋白质微晶，快速溶液散射（FSS）（或“快照WAXS”），每次使用一个粒子（如病毒）的单粒子衍射（SP），以及用于化学反应快照成像的混合和注射研究（使用溶液散射或微晶）。其他输送模式，如粘性介质“牙膏”喷射，如脂质立方相（LCP）喷射（Weierstall等。2014年)或一种基于矿物油（Sugahara等。, 2015)已经描述过了，包括带有液滴的传送带（Fuller等。, 2017)和“固定目标”方法，其中样品在光束上扫描，通常是二维的，如下所述。Weierstall（2014年）对各种样品交付方法进行了比较). 由于高速（约10 ms⁻¹)在GDVN液体喷射器中，大多数蛋白质微晶以120Hz的重复频率在两次喷射之间浪费掉。为了保存珍贵的蛋白质，开发了粘性射流（Weierstall等。2014年; 博塔等。, 2015; 康拉德等。, 2015)使用从喷嘴缓慢流出的高粘度汽车润滑脂介质。粘性LCP培养基还具有很大的优势，它可以形成膜蛋白微晶的生长培养基，例如G蛋白偶联受体（GPCR；Landau&Rosenbusch，1996)，使得晶体可以在同一系统中生长和输送。Weierstall中给出了LCP喷气机的构造细节等。(2014).

图2 (一)每次发射一个蛋白质微晶的连续飞秒X射线衍射（SFX）。(b条)快速溶液散射（FSS），每次发射都有许多相似的分子。(c（c）)单粒子（SP）模式，每次发射一个粒子。(d日)用于慢动态快照成像的混合射流。(e（电子）)图中显示了一个简单的瑞利射流，水流在其中分裂成直径为几微米的完美球形水滴（韦尔斯托尔等。, 2008). 还使用了固定采样阶段（见正文）。所有这些都可以与X射线吸收或发射光谱相结合。

虽然大多数时间分辨SFX都是使用简单但浪费的GDVN安排（既接受膜蛋白又接受可溶性蛋白）进行的，但使用粘性射流收集时间分辨数据已经取得了一些成功。润滑脂基质喷油器（Sugahara等。, 2015)已被用于成像光系统II（Suga）中氧键形成的位置等。, 2017)通过时间分辨的SFX。Nogly（2016)，用于Nango拍摄细菌视紫红质的多帧三维电影等。(2016). 这种方法在更高重复率下的使用仍有待确定，因为在液体管中破坏一个样品时产生的冲击波不得干扰下一个微晶。这限制了晶体之间的距离、流速和X射线脉冲的强度，如Stan拍摄的爆炸射流的戏剧性图像所示等。(2016).

虽然液体喷射器最适合未来XFEL中预期的高重复率，具有更快的摄像头，并且可以用于结构测定对于可能不会在LCP中生长的可溶性蛋白质，已经开发了一些“固定靶”系统，这些系统在蛋白质的使用方面浪费更少。其中包括芯片上的粒子捕捉阵列（Lyubimov等。, 2015)和扫描阵列（Mueller-Werkmeister等。, 2010; 奥格巴伊等。, 2016)对于三维和二维晶体（弗兰克等。2014年). 一个最新系统（Roedig等。, 2016)使用的硅膜具有比蛋白质微晶稍大的小孔。晶体被硅膜下面的滤纸“邪恶”地从上面的溶液中渗入孔中，并卡在孔中。来自单晶晶片的一阶（最低角度）布拉格衍射光束被衍射到一个大角度（可能超出探测器边缘），因此背景非常低，因为硅中布拉格反射之间的非弹性X射线散射非常弱，并且由于没有溶剂背景。晶体通过流动的湿氦气保持水合，并在大气压力下的空气或氦气环境中收集数据。这种前景看好的“公路隧道”布置正在进一步开发，以实现时间分辨衍射。Oghbaey中描述了第二次扫描固定样本安排，该安排使用光谱学定位微晶样本，命中率高等。(2016). 平田也使用了固定样本等。(2014)从大单晶中收集数据。

对于单个颗粒，大多数样品输送都使用了气动透镜组气聚焦喷射器系统（Hantke等。2014年)由GDVN或电喷雾驱动，由乌普萨拉的Hajdu小组广泛开发。尽管LCP注射器的命中率可能高于微晶的40%，但事实证明，在这些系统中，很难获得超过约1%的单粒子命中率。命中率为

哪里T型是一个传输系数对于颗粒射流（解释颗粒在输送到喷嘴的过程中的损失），（f）是粒子注入频率，σ是X射线束直径和粒子直径的总和，υ是XFEL重复率，c（c）是粒子速度和d日是指颗粒束直径，假设其大于X射线束直径。我们看到，通过增加注入频率、增加重复率或降低粒子速度，可以最容易地提高命中率。

使用位于水合石墨烯基底上的病毒可能具有优势。一个简单的会聚喷嘴可以获得2µm的200 nm粒子焦点（Kirian、Awel等。, 2015)，同时也探索了沿着空心光管（贝塞尔光束）传播病毒的可能性（埃克尔斯科恩等。, 2013). 新的光学成像方法现在首次允许在XFEL注射过程中直接观察生物颗粒，这是帮助校准的一项最重要的进步（Awel等。, 2016).

最后，双聚焦系统，在§7，也如图2所示（王）等。2014年). 一个重要的发展是将这种布置用于静电结构测定（SFX）使用乙醇作为第二种流体，而不是§7（奥伯瑟等。, 2017). 第三个外同轴快速气体护套也用于聚焦两个液体流。研究发现，通过调节中间醇流的速度，可以将携带微晶的最里面的流的直径减小到零，从而使该系统起到一个平滑的截止阀的作用，根据需要减少样品消耗。该系统似乎是目前最普遍适用于最广泛条件的系统，因为它支持可溶性蛋白和膜蛋白、保守蛋白，可用于快速时间分辨的泵-探针（或混合）实验，并将运行到未来XFEL预期的兆赫重复率。未来喷嘴处的温度应可控。

由于所有这些模式都有时间分辨的变体，数据收集模式的完整分类可以标记为SFX、FSS、SP、TR-SFX、TR-FSS和TR-SP。时间分辨模式可以使用多种方式来启动反应，包括光脉冲（例如在研究光敏蛋白时），化学混合或外加电场。只有TR-SP才能提供真正的分子电影，而无需任何形式的集合平均或建模。

3.辐射损伤及解决

辐射损伤对生物学中几乎所有成像和衍射方法的分辨率都有基本限制（中子衍射除外）。单粒子（SP）低温电子显微术（cryo-EM）通过合并许多类似粒子的真实空间图像来处理这一问题，每个粒子接收的临界“损伤剂量”都低于非常低的临界“损害剂量”，而临界“损伤量”太小，不允许仅由一个分子形成有用的图像。该剂量是分辨率的函数，其中高分辨率细节（对应于高角度散射）在曝光期间首先被破坏：因此，在延长同步辐射曝光期间，高阶布拉格反射在低阶之前衰减，因此辐射损伤最初具有与温度升高类似的效果。Howells中给出了剂量分辨率依赖性的详细测量和理论等。(2009). 与类似的XFEL-SP数据融合算法相比，低温电子显微镜真实空间图像没有显示相位问题，并且不具有衍射图案中存在的额外Friedel对称性。成像解决了相位问题。

Breedlove&Trammel（1970年)研究表明，使用任何形式的散射辐射都不可能对分子进行单原子成像（可能除了中子和氦原子，因为它们不存在亮源），因为这样做所需的辐射剂量会破坏分子。这是从有用的图像形成的横截面比率得出的弹性散射破坏非弹性散射在一定范围内的光束能量和辐射类型。更全面的分析（亨德森，1995)使用该比率乘以样品中沉积的平均能量非弹性散射用于比较电子和X射线衍射（XRD）的损伤和分辨率。该平均沉积能量约为20 eV透射电子显微镜（TEM），约等于XRD的全X射线束能量，其中光电子是由光子湮灭的非弹性事件产生的。（在TEM中，在能量损失事件之后，束流电子继续以较低的能量到达探测器，以产生衍射图案中的背景。）横截面亨德森的结论是，比率和沉积的能量有利于电子电子显微镜提供了比X射线衍射更多的单位损伤信息。

Breedlove的论文中还包含这样一句话：“如果观察速度足够快……在10之内，这并不能阻止X射线分子显微镜的出现。”⁻¹³ s’。这一无损伤成像100 fs的估计结果具有显著的先见之明：最近使用50 fs脉冲的XFEL晶体学显示，晶体在大剂量下的散射分辨率为0.2 nm，LCLS中单个病毒粒子的散射分辨率是0.59 nm，经过多次发射（蒙克等。, 2016). Solem（1986）进一步探讨了这种可能“超过”辐射损伤的想法)并且，在Neutze的分子动力学模拟中，为了响应XFEL的高强度飞秒脉冲的承诺等。(2000). 有关审查，请参阅Chapman等。(2014). [回想一下，X射线仅由原子电子云散射，而不是原子核散射，原子核的位置在分子动力学模拟中被跟踪。电子束同时被电子和原子核散射。Spence（2017）中给出了用于外辐射损伤的快速X射线和电子衍射的比较一).] 由于晶体学中损伤过程的积累时间长达一秒（Hendrickson，1976）;例如气泡形成），持续损伤的概念并不完全新鲜，但这里的概念性突破是认识到，如果激光放大允许几乎无限数量的X射线光子被压缩成任意短脉冲，就可以打破分辨率、辐射损伤和样本大小之间的关系（豪威尔斯等。, 2009)因此，原则上，如果光束可以聚焦到这些维度，就可以从任意小的样本（例如单个病毒）中获得无损伤的原子分辨率。人们还可以在接近其自然室温环境的条件下研究样品，避免需要冷冻样品以减少损坏。2006年在DESY使用VUV激光闪光灯以较低的分辨率首次证明了这种“衍射-破坏”机制（查普曼等。, 2006)，暗示了高分辨率、几乎无损伤的“电影”的可能性（Spence，2008). 2011年首次发布了使用1.8 kV XFEL光束从蛋白质纳米晶和微晶获得的高分辨率（0.8 nm）结果（查普曼等。, 2011)，以及第一个单粒子XFEL结果（Seibert等。, 2011). 在首字母之后弹性散射，对于大于非弹性的样品平均自由程在喷出的光电子中，光电子被加热，使样品温度达到大约50万K并蒸发。对于小于这个尺寸的样品，光电子会逃逸，留下带电的样品，样品会经历库仑爆炸。

图3显示了随着XFEL的增加，高角度散射（对应于示例中最精细的细节）的衰减脉冲持续时间在1.8 kV条件下，从光系统I（Barty）进行布拉格衍射等。, 2012). 对于最长的脉冲，晚来的X射线从已经损坏的晶体中衍射。入射脉冲可能包含约10个¹¹硬X射线光子，其中98%以上（12kV）通过蛋白质晶体而无相互作用。剩下的2%中，84%在光电子生产过程中被湮灭，8%被康普顿过程散射，8%被布拉格散射。

图3 来自光系统I的合并SFX中的Bragg峰值强度（Chapman等。, 2011)作为反分辨率的函数（单位：nm−1)对于几个不同的X射线脉冲持续时间，归一化为50 fs的结果（Barty等。, 2012). 精细的细节首先被破坏脉冲持续时间由衰减高阶布拉格峰所用的时间设置。

对于辐照度为10的40fs，2keV脉冲的情况¹⁷ 宽厘米⁻²（已经详细分析过），蛋白质晶体中10%的C原子吸收光子并被电离，这一过程我们可以将其描述为初级或电子损伤。光电子和俄歇电子的级联释放出这种能量，随后是在10–100 fs的时间尺度上发生的二次碰撞或场电离引起的低能电子级联。离子的库仑排斥和电子温度的升高会导致原子和离子在脉冲期间发生位移，从而导致二次损伤过程，这可以通过使用足够短的X射线脉冲来避免。如果二次电子温度升高时无法逃脱。较高的光束能量产生较弱的散射，包括布拉格散射和非弹性散射，康普顿散射取代了在较低能量下占主导地位的光电效应（Attwood和Saktinawat，2016). 对于单粒子（SP）模式，在没有布拉格衍射的情况下，损伤效应以不同的方式表现出来。两者的模拟分子动力学（Hau-Riege，2012年)和流体力学规范（Caleman等。, 2011)预测离子的0.5纳米运动可以在不到100 fs的时间内发生，因此脉冲最短可达10fs可能需要达到原子分辨率，这是一个比SFX更严格的要求，它得益于周期性排列分子的布拉格散射和随之而来的“布拉格增强”：前面提到的相干放大产生的平方效应。（然而，这将被下文讨论的“选通”效应所修正。）研究发现，如果使用足够短的XFEL脉冲，以更高的速率施加剂量（Lomb等。, 2011; 巴蒂等。, 2012). 更具体地说，如果同步加速器冷却样品的“安全剂量”约为30 MGy（或室温下为0.2 MGy），那么使用70 fs脉冲的XFEL的估计安全剂量约为700 MGy[见Chapman等。(2014)进行全面讨论]。最近，在铁金属簇周围的密度图中，已经对特定地点的损伤效应进行了成像铁氧还蛋白使用XFEL数据（Nass等。, 2015)并与同步加速器的结果进行了比较。在最大XFEL强度下使用亚微米光束焦点，光束能量高于和低于FeK（K）边缘进行比较。这项工作和支持模拟（Hau-Riege&Bennion，2015)建议在单粒子（SP）成像中使用最小的光束焦点获得最高强度时，可能需要20 fs或更少的脉冲持续时间来最小化某些类型的特定位置损伤，特别是在存在产生强烈局部光电子簇射的重原子的情况下。

点荷载研究（图3)展示了外部布拉格反射的消失如何“浇灌”过程的时间分辨率：有效的脉冲持续时间重要的是这些斑点消失所花的时间，在脉冲结束之前破坏了平移对称性，而不是脉冲的持续时间（巴蒂等。, 2012). 对于单个粒子，从模式中散射的连续分布中更难确定损伤的开始，并且一旦从单分散粒子获得可靠的高分辨率数据，就需要通过已知结构的建模进行研究。目前，SP数据的三维重建分辨率（约10 nm）不足以观察到这些损伤限制对分辨率的影响。图4所示的衍射图案（下文讨论）包含单分子和晶体衍射的信息，因此可用于解决此问题，因为所示的漫反射散射是晶体中单个分子散射强度的非相干和，而布拉格光束是相干和。

图4 来自光系统II晶体的XFEL衍射快照。这是一个具有[100]法线的部分，通过索引后从数千个微晶合并而来的三维数据集的原点。由于分子的静态位移，扩散散射被认为远远超出了布拉格反射，可以用于提高分辨率和辅助相位调整（Ayyer等。, 2016).

4.XFEL的连续晶体学

虽然大部分蛋白质结构分析最好在同步加速器上进行，但XFEL结晶学已被发现具有以下优点。

使用XFEL测定的100多个结构已存入蛋白质数据库（PDB）。最近的SFX示例包括分辨率为2.9º的GPCR血管紧张素受体（对控制高血压的药物很重要）（Zhang等。, 2015)，视紫红质与抑制素结合（Kang等。, 2015)和细胞色素c（c）氧化酶（平田等。2014年)而溶菌酶、葡萄糖异构酶、索马丁和脂肪酸结合蛋白3的结构也被报道为分辨率高于2º（Sugahara等。, 2015)包括福田对亚硝酸盐还原酶的研究等。(2016). 同步加速器（Stellato）也开发了串行晶体学等。2014年; Standfuss&Spence，2017年)，其中源亮度并且探测器的速度可能足以在曝光期间冻结晶体的旋转。同步加速器也使用粘性介质进行了SFX，以减少短暂曝光期间的晶体旋转（博塔等。, 2015; 大声地说等。, 2015).

最近的一个重要进展是认识到，在无序仅由理想晶格中蛋白质的刚体位移（无旋转）组成的晶体中，这些快照中布拉格反射之间的强漫散射主要是来自一个原始晶格的单粒子衍射图样单位电池，大致描述为分子转化。（与分子变换不同，它在原点周围确实降为零。）这是由一个扩展（Ayyer）预测的等。, 2016)德拜理论（德拜，1913年)热运动晶体的散射，如图4所示由于这种各向异性散射远远超出了布拉格反射（并且不受热阻尼的影响），这种效应现在被用于将光系统II密度图的分辨率从0.45 nm扩展到0.35 nm（Ayyer等。, 2016). 由于它提供了“过采样”数据（布拉格点之间的强度），这种连续散射也有助于解决相位问题并开启了解决不完美晶体的可能性。这种方法也可以应用于液晶，液晶具有取向有序性，但不具有平移对称性；然而，晶体标引的力量会因定向而丧失。

5.单粒子成像：分子机器

在这里，我们简要总结了单粒子（如病毒）成像的进展，每个XFEL镜头只有一个部分，并阐述了XFEL的时间分辨率和数据量可能为我们理解生命分子机器提供的独特见解。Ekeberg（2015）回顾了单篇方法)，博斯特德等。(2016)，阿奎拉等。(2015)和Liu&Spence（2016年). 在木村可以发现SACLA XFEL在日本的相关单粒子发展等。(2014)（用于活细胞成像）和Takayama等。(2015)（用于choloroplasts的SP成像）。

人们越来越认识到，在生理条件下，由于热能的可用性，蛋白质在结晶学给出的平均结构周围采样了大量构象，这种由近平衡涨落组成的动态行为对其功能至关重要。XFEL单粒子成像是否有助于我们理解这些过程？这可能是因为在近生理条件下可以获得的大量数据，以及我们现在讨论的原因。在较高的温度下，蛋白质在亚状态之间迅速转换，但在大多数晶体结构确定的温度下是不活跃的。控制条件包括溶剂化学(例如pH）、压力、局部电场和配体结合。蛋白质的功能是热运动及其化学和物理环境之间复杂相互作用的结果。因此，蛋白质功能的现代描述基于多维能量景观（弗劳恩费尔德等。, 2001; 威尔士，2003年)这定义了构象状态（热力学）、它们之间的能量屏障（动力学）和工作循环的相对概率。这种景观概念取自最初的伊林过渡态理论化学动力学。历史上，对肌红蛋白的研究引领了这条道路（参见费尼莫尔等。, 2004以及其中的参考）。分子过程取决于整体中速率和种群的变化，例如促进反应的酶或触发神经过程的细胞内离子浓度的变化。自由能的微小变化（少量千吨)因此，在含有数千种这种相互作用的蛋白质中，一些氢键或范德华接触的断裂可以启动信号级联或催化化学反应。内在蛋白质动力学只发生在几个自由能范围内千吨。有人建议采用一种方法（Henzler-Wildman&Kern，2007）)蛋白质取样的构象亚状态及其之间的通路不是随机的，而是蛋白质功能所需状态的进化选择的结果，因此是预先形成的。信号转导、酶催化和蛋白质-配体相互作用是特定配体与蛋白质的互补预先存在状态结合的结果，并随之改变平衡。在这幅图中，能量景观是蛋白质的一个基本固有属性，编码在折叠中并以其功能为中心：根据这一学派的观点，配体并不诱导形成新结构，而是从预先存在的结构中选择。另一种解释是假设构象确实提供了诱导配合。配体结合改变了能量景观，因此底物必须从无配体景观过渡到配体结合景观，这一事实带来了相当大的复杂性。

根据驱动力、可逆性、速度、循环性质和热力学，可以区分几种类型的蛋白质动力学。某些分子马达转换ATP水解提供的化学能（12 kcal mol⁻¹, 20 千吨在300 K或每个分子0.52 eV的条件下）进行机械运动。除此之外，生命的分子机器主要是由热波动（连同化学能量的输入）驱动的，其运行时间比微秒长，这一点自20世纪60年代初首次对肌红蛋白进行研究以来就已经很清楚了，在该研究中，需要结构波动来调节O₂扩散（有关审查，请参阅弗劳恩费尔德等。, 2001). 这些分子机器可能被认为是聚焦于布朗运动。在平衡状态下，受到周围水分子的冲击，这些机器（如核糖体和驱动蛋白）可以说处于空转状态。（在平衡状态下，激动素在微管上向左或向右移动的可能性相等，当提供化学能量时，它只向一个方向移动。）另一种类型的系统是光敏蛋白质，它对光子能量的反应远远大于千吨注意，虽然绘制能源景观不需要时间序列信息，但需要确定特定驱动系统所采用的路径的穿越方式。在能量约为的工作循环中分子构象的相对能量千吨可以从比率中获得n个₁/n个₂平衡中两个特定构象的布居数，因为这个比率是由玻尔兹曼指数因子给出的。这样，如果我们假设只需要观察n个₁=1个从系综猝灭的最极端最高能量构象的例子，我们可以发现任意给定总数的能量差N个=n个₁+n个₂从系综（Dashti）重建的密度图等。2014年). 使用冷冻EM数据确定核糖体能量景观的最新例子可以在Dashti中找到等。(2014). 因此，数据量要大得多（N个)XFEL SP实验（尤其是使用新的高重复率机器时）可以获得这些在低温电子显微镜成像中看不到的更罕见、更大能量和更大构象变化，这些变化可能对生理功能很重要。这些可能是速率线性化（并且超出了分子动力学模拟中常用的或结晶学中看到的谐波近似）。对于未来几天内可从欧洲XFEL获得的数据集，其值非常大N个（和n个₁=1），一个简单的估计表明，这些能量差异可能超过每个分子ATP的可用能量。这些非常大的构象变化将在中等分辨率（可能为1 nm）下可见。通过这种方式，人们可以超越对可结晶蛋白质的研究所施加的微小构象变化，这种变化只能提供晶体中所有构象的周期平均值，以及核磁共振动力学研究中对粒子大小的限制（勒万多夫斯基等。, 2015). 如此大的高能构象变化必须位于对酶功能具有限速作用的重要的最小能量途径上。泵-探针SP研究还具有提供时序信息的重要优势。

由于大多数生物化学反应发生在微秒或更长的时间尺度上，因此飞秒尺度上的XFEL成像（而非减少损伤）在生物学中的价值受到了质疑。然而，事实上，正如已经指出的那样，从初始电子激发的激发态寿命（可能很短或很长）开始，所有时间尺度都是相关的（Moffat，2014). 例如，酶依赖于比酶常数快得多的波动。带电配体的结合可以在很小的扩散距离上静电控制，因此可以在很短的时间内进行。其他反应取决于形成寿命极短的正确离子簇。人类视觉和光合作用等光驱动过程的关键初始阶段显然是在飞秒范围内完成的。

这里有助于区分化学反应动力学被定义为原子尺度上的分子过程（通常涉及电子激发），时间跨度很短（Levine，2005)，来自动力学用速率方程描述中间物种在较长时间内的出现和衰变，最终导致热力学的最终状态平衡所有这些见解加深了我们对生物化学的理解，改进的时间和空间分辨率也可以提供更准确的信息精炼分子动力学模拟中使用的原子势。

LCLS的单粒子倡议（SPI）计划包括LCLS主任在多年期间为专用非竞争波束时间预留的波束时间，以系统地跟踪、识别和纠正LCLS SP衍射中的分辨率限制因素。在减少束线背景散射和改善探测器性能方面取得了稳步进展，导致分辨率稳步提高。对于散射较强的软X射线数据，在LAMP室（LCLS的AMO实验站）不同条件下收集的数据以及用于三维重建的合并和相位显示约为10病毒衣壳的nm分辨率图像，而可以获得较少的数据，在单个镜头中显示出更高的分辨率。在单粒子实验中收集的数据的质量还取决于准确的探测器特性、光束位置的横向抖动、撞击的冲击参数、可能“沉积”到粒子表面的盐量（“结块”；Kassemeyer等。, 2012)和杂散（寄生）散射的X射线背景等。, 2016). 使用遮蔽光阑系统大大降低了背景，特别是在样品稍下游放置一个小光阑，它阻挡了上游背景源，例如来自光阑边缘和凹凸（Awel）的X射线散射等。, 2017). 由于电介质球的散射是散射角的四次幂倒数动态范围当前X射线探测器的数量是一个严重问题。然而，随着不断的进步，有理由预计不久将实现1 nm或更高的分辨率，新的欧洲XFEL很快将提供更多的SP数据。

6.快速时间分辨串行晶体学

“分子电影”一词在文献中被广泛使用和误用。撇开动画和观察的直接性问题（基于快速建模光学光谱学，从衍射数据，从透镜成像等。)，为了我们的目的，重要的是要区分涉及系综平均的方法（例如通过检测分子发生化学反应的晶体中的布拉格衍射）和不涉及的方法[例如基于XFEL衍射的低温电子显微镜和时间分辨单粒子成像（TR-SP）]。另一个重要的区别是“捕获”（或猝灭）实验，即处于热平衡状态的分子被迅速猝灭，然后按照构象对其图像进行分类，以及泵-探针实验，即分子在可控和测量的延迟后被激发，然后拍摄快照。（在低温下，EM分子也可以在被玻璃化薄冰膜冻结之前被光学激发。）下文讨论了从系综平均数据（布拉格衍射可以为其提供最高的原子分辨率图像）制作的电影的分析和解释：为了简洁起见，我们将这些描述为“分子电影”或“电影”。

光敏蛋白质的实验使用微米大小的蛋白质晶体，在X射线脉冲上游的液体射流中激发，并记录其快照。激发和X射线相互作用之间的时间延迟（对应于“分子电影”的一帧）可以通过定时电子器件（泵照明沿流体空间延伸）或液体流中的流动时间来确定（最准确）（精确度较低，但允许更长的延迟）。每个延迟（电影帧）都需要数千张快照（晶体处于随机方向）来建立三维衍射数据集。SFX数据分析算法（下文讨论）的稳步改进（除了简单的蒙特卡罗平均法）现在可以解决由于微米级蛋白质晶体的光照明而导致的结构系数幅度的微小变化，尽管在处理部分反射时，由于晶体尺寸和方向的持续变化，存在缩放问题。（能够检测用于XFEL数据SAD定相的结构系数幅值的更小变化是对数据质量的更严格测试。）第一个TR-SFX结果是由Aquila获得的等。(2012)用于光系统I–铁氧还蛋白。在Barends中可以找到最新的例子，其中包括仪器方面的许多进步以及使用XFEL时同步加速器在时间分辨率方面的改进（高达1000倍）等。(2015)肌红蛋白，库皮茨等。(2014)，年轻等。(2016)和Suga等。(2017)用于Nango的光系统II等。(2016)细菌视紫红质和天波儿等。(2014)和潘德等。(2016)用于光活性黄色蛋白（PYP）。

在飞秒光脉冲激发的蛋白质晶体中，根据先前的光谱研究确定，在一个工作循环周围有两条反应路径（例如下面讨论的光活性黄色蛋白质），不同单位细胞中的分子有一定的概率要么完全不被激发，要么在任一路径上引发反应。（进一步分支也是可能的。）每一条由化学速率方程描述的路径都会产生具有不同速率常数的不同中间物种。晶格常数、温度系数和总分辨率的测量可确保晶体在循环过程中保持完整，且不同单元单元中分子的外包络和接触点几乎不受影响。（每次发射中的光电子级联对晶体的破坏发生在后面。）来自微晶流的可观测到的是布拉格反射，在定相后，布拉格反射提供了一个时间点上所有被照射晶体平均值的电子密度的周期性空间平均值（泵浦-探针延迟）。因此，该方法需要以最高分辨率从先前的晶体学中准确了解未照射（暗）的基态（或最终）结构。然后可以使用奇异值分解（或使用分子动力学建模）等方法从布拉格数据中分离沿每条路径的时间分辨电荷密度。由此，可以根据描述反应动力学的速率方程来提取反应循环中来去的中间物种的数量。

图5展示了潘德的作品等。(2016)在对光活性黄色蛋白的TR-SFX研究中，他在3 ps范围内获得了200 fs的时间分辨率，这足以提供几帧分辨率为0.16 nm的反式/顺式这种光敏蛋白的光子吸收导致的异构化反应。其机制与人类视觉中第一个事件（在不同的蛋白质基质中）发生的机制相同，即光子撞击视网膜上的视紫红质。这涉及到一个圆锥交点[激发态和基态核坐标中的简并度（Schoenlein等。, 1991)]. 该TR-SFX实验是使用图1所示的GDVN泵-探针液体注入系统进行的激光照射（模拟阳光对植物或有机体的影响）会引起结构因子的微小变化，可以通过分子置换方法进行相位调整，以在每个时间延迟内产生亮（光泵）和暗状态之间的密度差图。该项目遵循了早期在较长时间间隔内使用相同方法以较低时间分辨率对同一系统进行的工作（Tenboer等。2014年).

图5 变速箱-至-顺式PYP中的异构化。加权差电子密度图以红色（−3）显示σ)和蓝色（3σ). 参考结构显示为黄色，跃迁前的结构（但仍处于电子激发态）显示为粉红色，基态跃迁后的结构显示为绿色。表示重要的负面特征α并指出了积极的特征β。已发音的更改用箭头高亮显示。(一,b条,c（c）)过渡前的典型时间延迟。虚线：C2=C3双键方向，特征β1.虚线：环羟基与Glu46和Tyr42的氢键。100至400 fs的色谱仪配置泵-探头延迟。(d日)转换后799 fs的发色团配置。(e（电子）,（f）)在800–1200 fs的更长时间内进行彩色扬声器配置。(克)3ps生色团构型；虚线表示β（潘德等。, 2016).

很明显，如果可以使用之前用于本工作的劳厄方法，可以获得更准确的结果（例如，参见肖特等。, 2003). 这里，光束中广泛的能量传播用于提供“更厚”埃瓦尔德球体它跨越了布拉格峰的全角度剖面，允许每个快照记录每个时间点的全反射（对于单个投影），并且无需在不同偏度的不同尺寸晶体之间缩放布拉格峰。所需的大量能量扩散dE类/E类然而，使用单色X射线激光器通常是不可能的。（对于LCLS，dE类/E类≃ 0.1%; 对于同步加速器，dE类/E类≃0.02%是常见的。）莫法特（2014)发现从镶嵌无序d的晶体中提供角度积分强度φ= 10⁻²和布拉格角 β，一个需要dE类/E类>φ帆布床β。对于高角度反射β=0.3 rad，这需要dE类=260 eVE类=8 kV，对于更完美的晶体，电压更低，对于低角度反射，电压更高。有人建议，有时用于SFX的亚微米级晶体更完美，因为它们的尺寸可能小于一个镶嵌块。然而，该模型可能不适用于许多蛋白质，这些蛋白质的缺陷结构尚不清楚（Snell等。, 2003). 还提出使用“啁啾”光束（在脉冲期间改变能量）和使用“双色”方法。在这里，XFEL在稍微不同的波长下产生具有可调谐飞秒级延迟的脉冲对。有关使用两种颜色的SFX中的错误分析，请参见Li等。(2015).

一种很有前途的方法是利用基因工程在一个被称为光遗传学的感兴趣系统中创建光敏蛋白域。如果可以生长微晶，这将提供研究蛋白质动力学的一般方法（Moffat，2014）).

Spence（2014）回顾了XFEL时间分辨衍射的新方法)，包括持续时间的阿秒脉冲的使用Δt吨这里，能源扩散不可避免地扩大ΔE类（eV）=4.14/Δt吨（fs）在带状光束中可以提供劳厄衍射所需的条件：14阿秒脉冲在10此外，时间相干性允许来自不同反射的布拉格光束（以不同波长激发，但在同一方向衍射）短暂干涉（在拍频期间），有助于解决相位问题通过提供三相不变量（Spence，2014).

7.慢时间分辨串行晶体学：混合射流

在同步加速器上进行的溶液散射实验可以在化学反应期间从溶液混合物中提供衍射（Van Slyke等。2014年). 反应可能在物种发生化学反应之前以某种方式触发，或由混合引起。混合时间决定了方法的时间分辨率。反应可以由X射线束本身产生的光电子触发，例如细胞色素P450（施利钦等。, 2000)和辣根过氧化物酶（Berglund等。, 2002). 高亮度因此，现代同步加速器和快速探测器的速度最近使得串行晶体学方法能够提供由光束触发的酶机制的“分子电影”，其中辐射剂量远低于Garman–Henderson的“安全剂量”，反应过程中的分辨率损失最小（Horrell等。, 2016). 在串行晶体学模式下使用XFEL，可以使用微米大小的晶体，这样就可以用这种小晶体快速扩散混合到晶体中，并且晶体可以提供原子分辨率数据。[例如，葡萄糖在1µm溶菌酶晶体中的扩散时间约为20ms（Schmidt，2013).] 此外，辐射损伤几乎可以消除，从而将损伤的影响从化学反应中分离出来。最重要的是，化学反应可以在室温下的近物理条件下通过快照X射线衍射成像，在这种条件下，正确的热能可以参与（与其他驱动力一起）驱动这些反应。Wang中给出了用于XFEL样品交付的第一个双聚焦GDVN“混合喷嘴”的描述等。(2014)最新的设计可以在卡尔维找到等。(2016)；这些已成功用于LCLS。

图6显示了在XFEL（Kupitz）进行的时间分辨混合实验的结果等。, 2016). 这里，酶之间的反应β-内酰胺酶（BlaC）和一种小药物分子头孢曲松（图中方框）已经使用药物分子和酶微晶的溶液完成，这些溶液在输送到GDVN喷嘴之前混合。密度图显示了药物在两个位置结合到酶环中。药物分子结合过程中的四帧电影正在制作中。第二个例子可以在Stagno中找到等。(2017)对于腺嘌呤核糖开关RNA适配体，混合后延迟10秒即可捕获中间相的结构。

图6 BlaC催化间隙的电子密度。(一)整个四聚体的精细模型(σ=1.1）非对称单元混合后。电子密度（2F类o个−F类c（c）)装订袋中以蓝色显示。子单位A类和C类含有磷酸盐；亚基B类和D类与亚单位中的头孢曲松结合D类被束缚得稍微更紧。(b条)载脂蛋白（红电子密度）亚单位的放大截面D类显示磷酸盐电子密度的装订袋。(c（c）)混合（蓝色电子密度）亚单位的放大截面D类显示头孢曲松电子密度的装订袋。(b条)和(c（c）)显示同一亚单位结合囊的略有不同的视图；然而，配体结合球的变化很小。来自库皮茨等。(2016).

我们现在可以预见，在不久的将来，将使用更广泛的方法来触发XFEL成像动力学的反应。这些可能包括太赫兹泵送（蛋白质周围的水合外壳通过偶极相互作用）、温度跳跃和温度平衡测量，特别是笼式分子释放实验（Schlichting，2000)，包括质子释放笼的光泵驱动的pH变化（例如，参见Lommel等。, 2013)和其他光敏化合物。

8.快速解散射和角关联

我们将使用XFEL将广角X射线散射（WAXS）称为“快速溶液散射”（FSS）。除了减少辐射损伤外，XFEL还具有提高时间分辨率的优势。因此，我们看到了对水在低温下的相变的显著研究（尼尔森等。, 2016)通过时间分辨泵-探针XFEL溶液散射（Arnlund等。2014年; 基姆等。, 2015). 在Arnlund及其同事的研究中绿芽囊藻在光泵态和暗态的差分图中获得了反应中心、500fs的时间分辨率和约0.4nm的空间分辨率，允许在光子激发后获得分子膜。（先前的晶体学提供了准确的暗态结构，允许通过分子动力学进行广泛建模。）时间相关衍射提供了负责耗散能量的“地震”机制的详细信息，该机制阻止蛋白质在吸收大光子能量（2.5 eV>>）后展开千吨). 获得了低散射角和高散射角下初始地震运动（7ps）的时间常数-q个加热过程（14 ps）。“地震”的震中（安萨里等。1985年)在叶绿素辅因子处发生。以同样的方式，列文蒂诺等。(2015)发表了对碳单氧基肌红蛋白的TR-FSS研究，使用LCLS数据观察血红素铁-CO键光解后光诱导的结构重排以及由此产生的“地震”运动。他们看到了3.6 ps时间周期的阻尼振荡。对于无机反应，Kim等。(2015)发表了对金三聚物[Au（CN）]中原子间键形成的显著FSS观察₂⁻]_三反应是在接近的金原子之间以光学方式触发的，避免了因扩散造成的时间延迟，分辨率为亚埃，时间分辨率为200 fs。

已经指出，来自时间或空间冻结分子的溶液散射应该是各向异性的，包含斑点（除了相干粒子间散射的影响外），而同步加速器WAXS数据是各向同性的，因为分子在曝光期间旋转。这种散射被称为波动X射线散射（FXS；Kam，1977)此外，有一种方法可以使用这种各向异性散射来提取一个粒子的电子密度图（图像），这种各向异性的散射在溶液中每次激发都会有许多相同的、随机定向的粒子（Kam，1977). 显然，这种二维FSS模式包含的信息比WAXS模式简化为一维数据的信息更多，有助于反演三维模型。然而，FXS模式缺乏三维重建所需的完整信息（Elser，2011）). 关于Kam理论及其历史的教程回顾可以在Kirian（2012）中找到). 这个概念可以在二维相同物体平放在垂直于光束的平面上的简单情况下理解，其区别仅在于光束方向的随机旋转。然后，每个粒子的二维角相关函数（ACF）将独立于其方向，从而可以将它们相加在一起。（ACF是衍射图样中每个分辨率环周围衍射强度的自相关函数。）对于每次拍摄的许多粒子，可以显示出来（Kirian，2012)这种各向异性的ACF是由衍射图案形成的，每次发射都有许多粒子，由添加到传统WAX背景中的单粒子ACF组成，可以减去它，因为它是各向同性的。原则上，通过相位和傅里叶变换数据两次，可以将生成的ACF反转为真实空间图像：一次将ACF转换为衍射强度，第二次相位和变换得到真实空间图像（Saldin等。, 2011).

在胶体玻璃的X射线散射中观察到FXS的这种各向异性（Wochner等。, 2009)以及平躺在膜上的随机定向金纳米棒（Saldin等。, 2011). 使用Kam理论对这些数据进行了反演，以提供典型纳米棒的实验图像。对于溶液中的蛋白质，XFEL FXS数据的各向异性（记录时间比旋转扩散分子的时间）通常被导致各向异性的其他实验制品淹没。然而，使用二维光刻结构（佩德里尼等。, 2013)使用Kam方法（Donatelli）的重要新发展，在低分辨率和PDB中的配体门控离子通道（pLGIC）数据等。, 2015)它通过单一相位步骤对图像进行反转。一个重要的理论发现是，该方法的结果与每次发射的粒子数无关（Kirian等。, 2011)；然而，使用单粒子方法（每次发射一个粒子），实验分辨率（在没有建模的情况下）似乎更好。很难通过直接撞击和光束直径与粒子直径匹配来改进SP模式；然而，实验撞击参数（粒子中心和光束中心之间的距离）很少为零，撞击率也很低(例如1%或更少），而FXS（每次射击有很多粒子）的命中率为100%。因此，每次发射的最佳粒子数（和分析方法）仍有待于根据实际实验条件确定，包括背景散射和撞击参数的变化。当检测溶液散射中基态和激发态结构之间的差异时，Kam角相关方法对于已知结构尤其有效，因为在这些差异测量中消除了许多误差源（Pande等。2014年). 实验FXS结果显示，在LCLS下，溶液中的聚合物哑铃具有很强的各向异性，其中Kam角相关方法用于重建一个哑铃的图像（Starodub等。, 2012). 这里，样品密度与宿主溶液的差异很小，就像蛋白质一样。本文与Kirian（2012)，为这种有前途的单粒子成像方法提供了极好的介绍。

9.数据分析

9.1. 连续飞秒晶体学

SFX衍射图样需要新的数据分析算法，而高空间相干性为解决相位问题。在数据采集期间，软件（例如，参见Barty等。2014年)用于丢弃空白镜头，识别包含可转位布拉格点数量的良好点击，纠正探测器伪影，减去背景并生成虚拟粉末图案（显示德拜-谢勒环的所有良好图案的总和），以快速指示数据质量和分辨率，可能有助于索引，生成命中率和分辨率的统计信息，并将清理后的输出转换为标准文件格式，如HDF5。这些快照数据的自动索引仍然是一个活跃的研究领域，布拉格反射是“部分”反射这一事实使其变得复杂。由于晶体（被每次射击摧毁）不能通过布拉格条件摇晃，从而提供全面估计结构因子（因此测角仪很少使用），必须开发新的算法，解决由光束强度波动、晶体尺寸变化以及从衍射图样强度和几何形状精确确定晶体方向所产生的缩放问题。蛋白质纳米晶体的XFEL衍射表达式首先由Kirian从第一原理推导而来等。(2010)自开发并提供SFX分析软件包以来CrystFEL公司[白色等。(2016)；另请参阅Ginn等。(2016)对于cppxfel公司包装]。最小晶体的SFX图案的新特征包括布拉格点之间的干涉条纹，对应于纳米晶体外部形状的“形状变换”或傅里叶变换。该函数位于每个布拉格峰周围，其角宽度为互易空间约为λ/D类对于宽的晶体D类，并有助于更大晶体的镶嵌性。必须首先为每个布拉格点指定散射矢量，然后提供旋转矩阵，必须为晶体和实验室框架之间的每次拍摄确定旋转矩阵。索引大多是使用标准晶体造影软件实现的（例如MOSFLM公司; 温等。, 2011)使许多微晶的数据合并成三维衍射体。然而，专门为SFX数据开发的新算法，并在实验数据上进行了测试，现在可以使用更少的点（大约5个；Li等。, 2017). 这些算法的稳步改进需要更少的点，允许使用收集的总数据量的更大比例，从而减少所需的蛋白质量和波束时间。它们还为具有小单元单元的晶体的稀疏数据提供自动诱导。当分子的点群对称性低于晶格对称性时出现的索引歧义可以使用期望最大化和压缩（EMC）方法解决（Liu&Spence，2014）)或相关系数和聚类程序（Brehm&Diederichs，2014; 另见Kabsch，2014). 这种模糊性意味着，例如，来自两个连续微晶的数据可能会被错误地合并到亚面体的如果索引是基于Bravais晶格独自一人。此算法的简化版本在中实现CrystFEL公司最初，使用蒙特卡罗方法获得了全反射，该方法依赖于记录和合并随机取向的晶体，这些晶体的取向跨越并对每个布拉格反射的摇摆曲线进行充分采样。结构系数测量中产生的误差可以从偶数布拉格强度之间的扩散来估计(我_即使)和奇数(我_古怪的)衍射图案（Boutet等。, 2012),

这与图案数量的平方根成反比（比例常数k个)由于晶体尺寸、方向的变化以及冲击参数（X射线束中心和样品中心之间的距离）和束流强度的射-射变化的组合，使得正交中的误差增加，如图7所示.这个比例常数k个在过去六年中，随着算法的改进和误差源（尤其是与探测器计量、晶体尺寸缩放和光束带宽相关的误差源）的估计、跟踪和减少，已大幅下降。然而，这种泊松标度确实意味着需要100倍以上的数据才能添加一个有效数字。正如罗斯曼所评论的那样，串行晶体学方法避免了在预先设置的测量方向上使用测角仪，相当于“先射门，后提问”。许多研究都集中在非常困难的偏爱或“后精炼”测量上（博洛托夫斯基等。, 1998). 被截获的全反射的分数埃瓦尔德球体每个反射与精确布拉格条件的精确偏差定义了偏心，如怀特所述等。(2016)Uervirojnangkoorn公司等。(2015)，Kabsch（2014年)和Sauter（2015年). 这是复杂的，因为对于给定的能量范围，“加厚”埃瓦尔德球体与低角度相比，高角度的跨度范围更大。Ginn方法取得了重大进展等。(2015)它从数千个蛋白质微晶中提供了0.175纳米分辨率的结构。使用一个直方图来细化方向矩阵，该直方图显示了作为X射线波长函数的预测反射次数，直到直方图中发现一个尖峰，从而给出波束能量扩展。偏倚基于布拉格峰的模型角剖面，并对点位置进行了细化。SFX数据的算法开发领域，包括迭代精炼实验参数的变化（尤其包括每个X射线脉冲中的波长分布、晶体尺寸和衍射条件的变化以及布拉格剖面的建模）仍然是一个活跃的研究领域，通过减少获得准确结构所需的波束时间和蛋白质数量，正在产生巨大的收益。其他实验参数可能包括样品到探测器距离的变化、杂散X射线散射引起的背景、读出噪声和像素饱和度。Boutet对溶菌酶晶体的XFEL和同步加速器数据进行了比较等。(2012).

图7 散射系数误差测量的实验减小(R（右）分裂)随着数量的增加N个衍射图样遵循泊松误差定律R（右）分裂=k个/N个1/2对于光系统II复合体的SFX分析（PDB条目第三个星期五)k个= 18.5. SFX算法开发、部分反射分析和缩放的进展通过减少k个近年来。

SFX数据的相位调整主要通过分子置换（MR）方法实现（Rupp，2010)，其使用PDB中具有相似序列和折叠的蛋白质作为模型结构。单波长异常衍射（SAD）方法已成功应用于XFEL数据（Barends等。2014年; Nass公司等。, 2016)，和之前一样同晶置换（山下等。, 2015)以及使用硫和氯（Nakane等。, 2015; 巴秋克等。, 2016). 这表明SFX数据分析的准确性不断提高。新建从头开始实验相位测量的方法包括测量重原子（包括硫）散射因子的强度依赖性，重原子的电离在多次后饱和K（K）-壳层/俄歇电离级联，导致“空心”原子。通过根据脉冲强度对数据进行排序，类似于SAD或同晶置换然后可以申请（儿子等。, 2011). 最后，最小晶体中布拉格反射之间的干涉条纹提供了解决相位问题。对于浸没在宽相干光束中的纳米晶，人们发现(N个−2）包含N个垂直于方向的平面克沿方向在布拉格反射之间运行克。这类似于(N个−2）从光栅的光透射衍射图案中的主极大值之间看到的辅助极大值N个裂缝。这些沿几个方向分布的条纹给出了晶体的尺寸，可用于求解相位问题（斯彭斯等。, 2011). 有关此方法的实验演示和其他参考，请参阅Kirian，Bean等。(2015). 此外，对于纳米尺寸的衍射相干光束，这种情况与全相干扫描透射电子显微镜中的情况类似（STEM；Spence，2013). 如果波束扩散角大于布拉格角，这些相干衍射级在探测器上重叠，产生干涉条纹，干涉条纹取决于光束相对于探测器的绝对位置晶格，可以根据硬X射线眼底成像理论进行分析（斯宾塞等。2014年).

9.2. 单个粒子

对于SP（单粒子）数据分析，对于每次发射一个粒子（如病毒），相干衍射成像（CDI）方法已适用于XFEL数据，包括混合输入输出（HIO）算法（Fienup，1982）)及其变体[见Marchesini（2007）)和斯彭斯（2017c（c）)审查和Millane&Lo（2013年)回顾结晶学中相关的迭代相位法和重要的约束比概念]。与CXDI问题不同，必须首先使用未知结构的随机定向粒子（需要一定数量的最小检测光子）确定连续衍射图案之间的定向关系，其精度可能会限制分辨率，然后才能求解相位问题。解决这些问题的方法包括吉普拉尔算法（Kassemeyer等。, 2013)，歧管嵌入（Yoon等。, 2011)以及期望最大化和压缩（EMC）算法（Loh&Elser，2009)，在cryo-EM中广泛使用，已应用于SP XFEL数据（见Ekeberg，2015以及其中的参考）。Kodama和Nakasako（2011）讨论了其他方法)，他们应用类似于冷冻EM中使用的方法来识别真实空间中的水套，需要非常高的分辨率数据（因此需要非常平坦的埃瓦尔德球体），以及Sekiguchi等。(2014)，谁描述了SITENNO公司用于单粒子数据收集、合并和定相的软件包。关口等。(2016)描述数据分析方案(阿修拉)用于评估基于主成分分析的反演密度图的准确性。Takayama公司等。(2015)描述一种通过在这些固定样品附近添加分散的胶体金颗粒来产生强参考波的方法，该方法将分辨率提高2倍，并对数据进行相位调整。

为了解决这个问题，Starodub中给出了从电介质球获得的相干硬X射线散射的例子，该散射可以以闭合形式获得等。(2008). 在这里，可以看到q个⁻⁴随着散射角的下降，相干衍射成像中出现了一个问题，即必须同时记录低角度的强强度和高角度的弱强度，而强度范围往往超过动态范围探测器。

似乎可以使用与低温电子显微镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）社区相同的方法来合并来自类似随机定向单个粒子（如病毒）的数千个衍射图案。在这里，一个粒子的多个副本的噪声低剂量投影图像，位于多个随机方向，被记录在一个视野内，必须合并以生成三维图像（Spence，2013). 然而，XFEL衍射图案还需要解决相位问题而且，与真实空间的低温电子显微镜图像不同，不需要校正电子透镜像差，而低分辨率衍射图案的弗里德尔对称性导致了对映体模糊，这在真实空间图像中并不存在。此外，与图像不同，衍射图案有起源，并且由于冷冻EM图像中的冰引起的背景必须与由于颗粒周围水套的衍射引起的X射线衍射图案中的背景不同地处理。在先前关于连续衍射图案的迭代定相的工作的基础上，已经开发了两种主要方法，用于从许多随机取向的快照单粒子X射线衍射图案重建三维图像（密度图），以及用于处理粒子不均匀性的相关问题。我们将在这里仅简要概述这些方法的一般原则，重点放在关键问题上。

流形嵌入方法（Yoon等。, 2011)如图8所示，简化为三像素(x个, 年, z（z）)探测器和粒子的单轴旋转以说明该方法的原理。通过这种简化，快照衍射图案可以表示为三维矢量，每个分量表示像素处的散射强度值。这些矢量（衍射快照）以随机时间序列到达。然而，粒子的旋转在这个三维强度空间中描绘出一个循环（一维流形）。确定这个流形可以为每个快照分配一个方向，因为尽管向量以随机序列和位置到达，但它们会建立一个循环，最终揭示它们的序列和最近的邻居。一般来说，探测器有N个像素和粒子围绕三个轴旋转，在N个-像素强度的维希尔伯特空间。流形可以通过定义粒子方向的三个欧拉角定义的三维潜在空间进行参数化。出现了许多实际困难，包括从角度增量到坐标变化的转换N个尺寸，以及噪音和构象变化的影响。在最简单的情况下，第二个构象将定义第二个不同的环；然而，噪音的影响使歧管变厚，因此它们可能重叠。区分粒子取向变化和构象变化（对于制作三维“分子电影”至关重要）的关键问题是利用与构象变化相关的操作相互转换，而与旋转组相关的操作则不相互转换这一事实来解决的。与旋转不同，构象变化改变了粒子的内部结构。这种方法的一个重要特点是，所有数据都用于所有分析，而不是选择子类（例如方向或构象）进行连续分析。然而，即使在没有噪声的情况下，也需要最小数量的散射计数来识别特定方向，这与所寻求的不同方向的数量成正比。这种方法的计算要求相当高，并对可以分析的最大分子的大小设定了限制。

图8 针对只能绕一个轴旋转的样本和三像素检测器的简化流形嵌入方法。三维空间中的矢量表示衍射图案，每个轴是一个像素，每个坐标值是该像素的强度。当粒子返回其原始方向时，分子的旋转使矢量追踪出一个环，而环上的相邻点用小矢量表示类似的衍射图案χ（最小平方差，欧几里得公制）。然后，通过识别循环路径，可以对分子在随机方向上记录的模式进行排序，以制作电影。

第二种方法基于期望最大化和压缩原则（EMC；Loh&Elser，2009）; Sigworth，1998年; 登普斯特等。, 1977). 对于一组有噪声的二维图像，该方法在二维中得到了最简单的解释我(k个)已知位于四个方向中的任意一个的同一非对称物体我=1，4与正常旋转90°不同。在这里，k个是图像索引并延伸到N个×N个图片的像素。首先假设一个模型，该模型可能由随机值组成，并在四个方向中的每一个方向上生成我（扩展）。假设泊松噪声P（P）_我(k个)计算出实验图像我(k个)来自每个模型的定向我为了避免在第一次迭代中出现极小的数字，这些概率被归一化为一。对每个图像重复该过程（最大化），给出一组系数P（P）_我(k个). 然后根据加权和形成四个新模型米(我) =。由于应用于模型的四个初始定向生成操作是已知的，因此可以将四个新模型返回到相同的方向，求其平均值，并将其平均值用作模型的新估计值。然后从第一步开始迭代。使用低分辨率二维X射线阴影图像的方法的实验证明，每张图像只需2.5个光子（Ayyer等。2014年).

在这两种方法中，非晶体学的解相位问题（2017年在Spence审查b条)可以与方位确定的问题相结合。

颗粒不均匀性（随着颗粒尺寸的增加而增加）是单颗粒XFEL成像的最重要问题，并且如果有足够的高质量数据可用，则原则上可以通过上述方法区分构象的能力来解决。Schmidt介绍了一种从单个镜头获得三维重建的方法等。(2008)使用由分束器分离的多个入射光束。几位作者指出埃瓦尔德球体只需一次拍摄即可提供有限的三维信息。伯赫等。(2008)描述从单次拍摄中提取三维信息的其他可能性，例如使用谐波的劳厄衍射、相干会聚光束衍射和多针孔傅里叶变换全息术。图9显示了从拟菌病毒粒子，以及使用EMC算法获得的病毒重建三维图像（Ekeberg等。, 2015).

图9 的三维重建（左）拟菌病毒使用霍克软件（EMC算法）来自LCLS[AMO，pnCCD探测器，70 fs脉冲，1.2×1012 每脉冲光子数（0.24 mJ），1.2 keV X射线]。

已建立SFX和SP数据数据库CXIDB(https://cxidb.org/index.html)，其中可以找到已发布的数据并用于评估新算法。该网站还提供霍克XFEL SP数据的EMC分析计划。

10.展望

随着用于模拟的更强大的计算机以及许多新成像技术和光谱的发明，从核磁共振到激光镊子，低温电子显微镜和超分辨率光学显微镜中的捕获实验，分子生物学的研究重点从结构转移到动力学，XFEL在一个有利的时刻出现在了现场。对于光敏蛋白质（以及可以制造的蛋白质）来说，减少辐射损伤、原子分辨率（可以使用晶体样品）和飞秒时间分辨率的无与伦比的组合非常适合光合作用和许多其他光化学过程的早期阶段的研究。例如，对水分裂事件的成像可能会形成这样一个“重大挑战”项目。对于较慢的过程，混合注射方法正在经历令人兴奋的发展，有望阐明酶学中涉及的原子机制，这可能与使用中间物种作为药物靶标有关，这是另一个挑战（Johnson等。, 2013). 单粒子项目将需要进一步发展；然而，高分辨率的时间分辨单粒子成像将一下子消除集合平均的所有复杂性，而集合平均使许多其他方法变得如此复杂，并可能揭示出其他方法无法观察到的大的速率线性构象变化。最后，目前正在开发一系列新的触发器，用于使用XFEL进行快速分子成像，这是参与这一快速发展领域的最激动人心的时刻，未来几年，全球将有许多新机器上线。正如汉弗莱·戴维（Humphrey Davey）在1806年所评论的那样，“没有什么比发明一种新仪器更能促进科学的进步”。