1.简介

X射线晶体学是蛋白质的首选方法结构确定。蛋白质数据库中超过95000个结构中的近90%(https://www.rcsb.org; 伯曼等。, 2000)已通过X射线方法解决。然而，标准晶体学管道存在各种瓶颈。其中最严重的一个问题是难以生长出适当大且衍射良好的晶体，这是在X射线照射下获得足够衍射信号所必需的，而X射线照射受到该照射引起的结构紊乱开始的限制。

晶体尺寸和辐射损伤是内在联系的。由于以下原因造成的损坏电离辐射取决于剂量（即单位质量吸收的能量），在运动衍射的情况下，剂量与入射通量（单位面积光子数）成正比。给定入射X射线注量的衍射信号与有序晶体的照明体积成比例，因此较小的晶体需要较高的剂量才能获得类似的衍射信号。一个典型蛋白质晶体在低温下的耐受剂量约为每盎司分辨率10 MGy(即蛋白质结构的典型3Å分辨率为30 MGy）（Howells等。, 2009; 霍尔顿，2009; 欧文等。, 2006). 在此剂量下，由光吸收引发的结构无序导致最高分辨率衍射强度降低一半。室温测量的容许剂量约为30倍。然而，室温下的损伤过程取决于液体中辐射分解的复杂过程，并且可能取决于剂量率（布莱克等。, 1962; 索斯沃斯·戴维斯等。, 2007; 欧文等。, 2012; 沃肯廷等。, 2011, 2013).

当大晶体不可用时，在剂量限制内工作的常见策略是从许多小晶体收集数据，然后缩放数据并将其合并为一组结构因子。在同步辐射设施的多条束线上进行微晶照相，这些束线提供直径约为10µm的单色光束，通常具有10µ¹² 光子⁻¹（史密斯等。, 2012). 在这样的束线下，在几秒钟的曝光中可以达到10MGy的剂量。微晶照相光束线的典型实验包括安装一个带有一个或多个晶体的样品环，这些晶体的体积通常不小于1000µm^三。然后将晶体定位在光束中并居中，以便在仔细监测剂量的同时收集部分数据集。该过程可以在多个样本循环上重复，以获得足够的数据来形成完整的数据集。已开发出在单晶上使用多个位置的数据采集方案（Riekel等。, 2005)将传递的能量分布在更大体积的晶体上，或用于从多个晶体收集部分数据集（布罗德森等。, 2003). 这种方法产生了体积小至约100µm的微晶结构^三（库利巴利等。, 2007)并允许测量膜蛋白微晶的衍射，而无需将其从结晶板上移除（Axford等。, 2012).

近年来，开发了一种新的微焦点光束线样品安装系统，用于测量蛋白质晶体就地室温下（Axford等。, 2012; 平克等。, 2013; 古哈等。, 2012; 王等。, 2012). 具体来说，Guha等。建立了一个X射线兼容的多层微流控蛋白质结晶平台，并用它结晶三种模型蛋白质，并从中收集高分辨率衍射图案，Pinker等。开发并测试了用于反扩散结晶和X射线分析的微流控芯片。这些方法简化了对许多单个微晶的少量衍射图案的测量。

X射线自由电子激光器（FEL）的发展能够产生持续数十飞秒的强脉冲，从而能够在疾病快速发作之前从室温晶体中收集数据（Barty等。, 2012)，剂量远远超过同步加速器辐射的耐受剂量。这种串行飞秒晶体学（SFX）方法（查普曼等。, 2011; 布泰等。, 2012)引入了一些创新，例如从液体喷射器中连续流动的纳米晶悬浮液中收集数据（德庞特等。, 2008; 夏皮罗等。, 2008)带高帧频探测器（Philipp等。, 2011)，以及处理数百万个探测器帧的软件（Barty等。, 2013)并合并来自数十万标记的“静止快照”单晶衍射图案的数据（白色等。, 2012, 2013). 该方法首先在膜蛋白复合物光系统I上进行了演示，分辨率受到6º长波长的限制，最初可在Linac相干光源（LCLS）（Chapman）上获得等。, 2011)，并很快使用溶菌酶微晶（Boutet等。, 2012). 自那时以来，SFX已应用于解决新结构，如布氏锥虫组织蛋白酶B的2.1°分辨率体内生长的微晶（科普曼等。, 2011; 雷德克等。, 2013)以及来自脂质立方相基质中微晶悬浮液的5-羟色胺受体5HT2B（Liu等。, 2013). 从大量先前未曝光和未表征的晶体中收集衍射图案的一般范式最近被应用于同步加速器光束线（Gati等。, 2014)在那里，在低温冷却的悬浮液上，通过光栅螺旋扫描收集了近29000个衍射帧体内生长的晶体布氏锥虫组织蛋白酶B。每个晶体只有9µm^三体积。这个CrystFEL公司软件（白色等。, 2012, 2013)用于识别和索引数据流中的单晶衍射图案。对同一晶体上连续采集的强图案进行分组，并将其作为常规旋转数据处理，从而使结构测定与LCLS达到的2.1º分辨率相比，分辨率为3.3º。

在此，我们证明，通过从悬浮在其生长介质中的室温微晶收集大量短曝光，串行晶体学范式可以成功应用于同步加速器束线。在我们的改进中，当晶体悬浮液在薄壁毛细管中连续流过光束时，以恒定的速度采集了数百万个探测器帧。光束在两次曝光之间不会关闭，因此晶体的实际曝光时间（以及它所接受的剂量）是由该晶体通过X射线焦点所需的时间设定的。调整探测器帧速率、样品流速和晶体浓度，以确保更可能在探测器帧中记录单晶衍射，而不是多晶衍射。探测器框架使用与SFX类似的管道进行处理，首先搜索框架是否存在晶体衍射，然后索引并合并为一组结构因子。这组结构因子是通过对索引点的蒙特卡罗积分获得的，这些索引点平均了晶体尺寸、形状、质量、取向和其他变量的变化。

与X射线自由电子激光衍射的飞秒快照不同，同步加速器的曝光时间足够长，晶体在曝光过程中会轻微旋转（取决于携带它们的介质的粘度）。这种旋转允许在单个曝光中完全记录一些布拉格峰。

一种可视化连续晶体学的方法是粉末衍射，一次记录一个晶粒。收集单个晶体快照可以确定每个晶粒的方向，并在求和之前从每个帧提取背景。与粉末衍射一样，分辨率极限是指许多单个晶体的衍射信号之和在背景噪声之上无法观察到。然而，与粉末衍射不同，数据帧是从单个晶体中收集的。与将整个样品暴露在单个粉末图案中的情况相比，这可以通过拒绝不包含晶体衍射的探测器框架来减少背景的贡献。在选定的框架中，背景与含晶体介质和毛细管壁的厚度以及曝光时间成正比。因此，通过在薄片或柱中提供悬浮液，并将探测器记录时间设置为不超过晶体渡越时间，可以改进该方法。

本文概要如下：第2节我们描述了我们在汉堡DESY的PETRA III设施的P11光束线上对直径约5µm的溶菌酶晶体进行的串行晶体学实验演示，在高达0.3 MGy的剂量下测量，晶体传输时间为几毫秒。如§3所述，分辨率为2.1º的结构是从一百多万个探测器帧中选择的40 233个索引图案中获得的我们检查了数据质量、结构的依赖性细化统计以及索引模式数量的分辨率。我们的实验还强调了有待改进和进一步发展的地方，这在§4中进行了讨论这些实验是对一种方法的基本证明，该方法可扩展到使用升级的高亮度同步加速器源和探测器进行更快的数据采集，这些源和探测器正在许多设施中进行或计划进行。例如，1.5%带宽的强光束（“粉色光束”）可能很快会在PETRA III和ESRF上出现，其强度比此处显示的高几个数量级。在这样的光束线上，可以使用适当速度的液体射流以几十微秒的晶体渡越时间快速收集数据（DePonte等。, 2008; 魏尔斯塔尔等。, 2014)和高帧率检测器（Henrich等。, 2011; 贝克尔等。, 2013). 该方法固有的连续样品输送非常适合在与晶体传输时间匹配的时间尺度上进行不可逆反应的时间分辨研究，为测量大分子晶体结构的动力学和动力学提供了一种新方案。

2.材料和方法

我们使用Falkner描述的改进方案，以批处理模式制备了鸡蛋清溶菌酶微晶等。(2005)，省略最后的交联步骤。通过添加三份沉淀剂[14.7%，在室温下获得微晶(w个/v（v）)氯化钠，22%(w个/v（v）)PEG 8000，均来自德国Sigma Aldrich，距离500米M（M）pH为3的乙酸盐缓冲液]至一份溶菌酶（Sigma-Aldrich，德国，100 mg/ml⁻¹然后立即彻底搅拌两分钟。所有溶液均使用超纯水制备，并在结晶前通过0.1µm过滤器（德国Sartorius Stedim）过滤。约5×10的高浓度悬浮液⁷ 微晶ml⁻¹孵育12小时后获得。使用NanoDrop 2000c（美国Peqlab）在280 nm波长下进行吸收光度测定，结果显示小于0.05 mg ml⁻¹溶菌酶结晶后仍留在溶液中。在收集数据之前，通过离心将晶体浓度增加两倍，并将悬浮液的PEG浓度调整为28%(w个/v（v）)防止在测量过程中沉淀在样品贮存器和毛细管中。我们观察到晶体是棱柱体，边缘长度约为3µm，长轴约为6µm。因此，平均体积约为135µm^三，对应约5×10⁸单位单元格。图1(一)显示了经过类似处理的晶体的扫描电子显微镜（SEM）显微照片，除了为了电子显微镜，根据福克纳给出的方案进行交联等。(2005).

图1 (一)用于连续晶体学测量的溶菌酶微晶的SEM显微照片。(b条)PETRA III P11光束线蛋白质序列晶体学实验装置示意图。(c（c）)单晶衍射图案。圆圈显示了布拉格峰的预测位置。布拉格斑点可以观察到探测器的中心边缘，如红色箭头所示，该箭头指示位于2.05Å分辨率的布拉格斑点。DECTRIS有限公司提供的Pilatus 6M探测器照片。

数据采集是在第三代同步辐射源PETRA III（汉堡DESY）的P11束线上进行的。在我们的实验中，同步加速器以60束团模式工作。122极波荡器产生的光束被单色化至0.01%带宽，并使用菲涅耳波带片（焦距600 mm）聚焦至水平方向约9µm，垂直方向约6µm。X射线能量为9800 eV（1.27Ω波长）通量焦点为2×10¹² 光子⁻¹.

晶体悬浮液由注射泵（KDS LEGATO 200）通过100µm内径的熔融石英纤维（Polymicro，美国）推送到100µm内径的玻璃毛细管（W.müller，德国），其中10µm厚的壁，以三个正交运动安装在机动工作台上，水平放置在X射线相互作用区域。使用在线显微镜将毛细管对准光束并观察晶体流动。实验装置示意图如图1所示(b条)在测量过程中，样品以恒定的速度被推动，但在此期间，毛细管被额外扫描，以避免X射线照射区域的壁上积聚蛋白质。扫描覆盖毛细管内的一个长矩形区域，该区域距离内壁顶部和底部至少10µm，以避免从毛细管边缘散射。快速扫描轴与毛细管轴平行。扫描速度低于0.1毫米秒⁻¹大多数测量是在2.5µl min的液体流速下进行的⁻¹，对应于5mm/s的平均流速⁻¹在直径100µm的毛细管中。对于完全层流，速度分布范围为3mms⁻¹距离内壁10µm至10 mm s⁻¹在毛细管的中心。因此，晶体在9µm宽X射线束上的渡越时间估计在1到3 ms之间变化，并且不受扫描速度的显著影响。我们使用的溶液的计算雷诺数为0.0115，很好地处于层流状态。即使如此，悬浮晶体也会通过碰撞、翻滚和沉积影响流动轮廓，从而导致流动中的湍流成分，从而进一步增加过境时间的不确定性，并在暴露期间引发额外的晶体旋转。事实上，偶尔会观察到绕平行于光束方向（滚动）的轴旋转，其形式是布拉格峰扩展为约5°的近似恒定半径弧。这远远超过了布朗运动（估计在3ms内小于0.01°），并与非均匀流动引起的感应转矩的估计值一致。

使用Pilatus 6M探测器收集衍射图案，该探测器放置在距离相互作用点300 mm的位置，在探测器中心边缘的分辨率为2.1º。在不使用机械快门的情况下收集探测器框架。探测器的曝光时间为10 ms，但由于探测器的读出时间（75%的死区时间），帧速率被限制为25 Hz。考虑到9µm×6µm的束流尺寸，如使用程序估计的那样，在3 ms内累积0.1 MGy的剂量放射性核素（派哈扎尔等。, 2009). 晶体的剂量当然不超过0.3 MGy，这是一个上限，假设晶体在整个10 ms探测器曝光时间内保持在光束中。

3.结果

3.1. 数据收集和处理

在我们的研究中，我们收集了将近1.5×10⁶单独的衍射框架。这对应于约17小时的有效测量时间，平均流速为2.5µl min⁻¹这导致样品消耗约2.5 ml结晶浆或250 mg蛋白质。然后使用CrystFEL公司（白色等。, 2012, 2013)版本0.5.3。这个CrystFEL公司软件套件用于自动索引每个图案，提供实验室框架中定向晶体的晶格矢量。在CrystFEL公司然后，利用该信息预测布拉格反射的位置，并获得这些位置的积分光子数和背景吸收光子数。为了最大限度地增加适当指数化衍射图案的数量，仔细调整了寻峰阈值和积分参数。更详细地说，在Zaefferer（2000）之后，峰值查找算法使用了简单的梯度搜索)阈值为25个光子计数。每个反射的强度是通过将距离预测峰值位置中心2个像素半径内的强度相加，然后减去从内径为4个像素、外径为8个像素的环形区域估计的背景信号来计算的。

共有40233个模式被成功索引，占所获得模式总数的2.7%。然而，只考虑被认为是最强的模式（布拉格峰超过15个的模式）和不太可能是多晶体点击的模式（小于200个布拉格峰；参见支持信息图S1)，索引模式的百分比为24%。

晶格参数的直方图如所示图S2这些参数的平均值（见表1)与已知值一致(例如布泰等。, 2012; 索特等。, 2001)0.5%以内。使用蒙特卡罗积分方案（Kirian等。, 2011)实施于CrystFEL公司对于每个索引图案，该程序基于模型和确定的晶格参数预测布拉格峰的位置，并确定背景吸收衍射强度，而不管是否检测到布拉格峰。假设探测器距离相互作用点300 mm，光子能量为9800 eV，带宽为0.01%，光束发散度为1 mrad，预测峰值位置。

表1 数据统计，包括分辨率高达2.1º的炮弹 数据收集   光源，光束线 PETRA III，第11页 最大剂量（MGy） 0.3 “空间”组 P（P）4三212 单元格尺寸一,b条,c（c）(Å) 79.5 ± 0.3, 79.4 ± 0.3, 38.4 ± 0.2 V（V）M（M）(Å三 Da公司−1)/溶剂含量（%） 2.07/40.6 分辨率范围（Ω） 39.65–2.09 威尔逊B类系数（Ω2) 44.1 完整性（%） 93.4 (82.0) R（右）分裂 7.65 (53.98) 我/σ(我) 8.1 (1.9) 0.9986 (0.9007) 冗余 1755 (1281)   精炼   PDB ID 4到34岁 分辨率范围（Ω） 39.65–2.09 细化中使用的反射数 6411 用于的反射数R（右）自由的 709 R（右）工作/R（右）自由的 0.18/0.23 (0.28/0.30) 原子数量  蛋白质 1000  离子 三  水 12 B类因子（λ2)  蛋白质 51.7  离子 59.1  水 45.1 R.m.s.偏差  粘结长度（Ω） 0.007  结合角（°） 1.08 Ramachandran图（%）  最受欢迎 97.6  允许 2.4  不允许的 0

然后平均所有分度图案中独特反射的衍射强度。如上所述，这平均了不同晶体的许多变化，包括尺寸、形状、曝光（过渡）时间和反射的偏度。虽然这些因素导致每个反射的测量值分布广泛，但比率我/σ(我)可以使用单个强度测量值的方差（白色等。, 2012).我/σ(我)用这种方法计算的值如图2所示(c（c）)作为分辨率的函数。这种方法不涉及数据的任何缩放，也不考虑样本可能缺乏同构等因素，这可能是由于孪生或不同晶体构象的存在。样品（和光束）的不均匀性会影响数据质量，但由于强度的蒙特卡罗积分，在足够大的数据量范围内，所有随机变量都被“积分”出来，并成为同等影响所有强度的常数因子（白色等。, 2012).

图2 R（右）分裂(一)和(b条)绘制为分辨率和索引图案数量的函数。这些都是数据内部一致性的度量标准。可以看出，在给定的分辨率下，一致性随着索引模式数量的增加而提高，而对于给定数量的索引模式，一致性则通过将数据限制为较低的分辨率而提高。(c（c）)信噪比[我/σ(我)]合并数据的平均值，作为分辨率函数绘制。我/σ(我)将每个反射的平均计数除以这些计数的标准误差（白色等。, 2012).

3.3. 电子密度测定

通过以下方法获得的合并强度CrystFEL公司从40 233个索引模式转换为MTZ格式进行进一步处理。如表1所示、威尔逊家族B类我们的数据因子是44.1º²（由确定phenix.x分类)，这高于单晶室温数据通常获得的值。这么高B类这一因素可能是因为我们选择了将预测斑点位置的所有索引图案的强度合并到检测器边缘（即，散射角通常超过图案中观察到的最高分辨率的斑点）。这种选择可以通过对弱信号进行平均来提高结构因子的准确性，但与仅对给定阈值以上的计数进行平均相比，在高分辨率下肯定会降低估计的积分强度。

数据分阶段进行分子置换（MR）与相位器（麦考伊等。, 2007)使用由人类溶菌酶（PDB条目）生成的搜索模型2 zil个)使用phenix.pdb工具（亚当斯等。, 2010)（LLG=629，TFZ=17.6）。作为模型的人溶菌酶和鸡溶菌酶之间序列的差异导致电子密度图中出现明显的差异（2米F类_o个−D类F类_c（c）覆盖着米F类_o个−D类F类_c（c），如图3所示一). 自动模型（重新）构建，带初始和开关定相（Terwilliger，2004)然后使用菲尼克斯汽车（特威利格等。, 2008)生成一个完整的溶菌酶模型(R（右）_工作= 18.5%,R（右）_自由的= 24.0%). 这进一步受到以下迭代循环的影响约束细化使用模拟退火菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012)和模型构建库特（埃姆斯利等。, 2010)然后是决赛精炼用执行PDB_REDO公司（乔斯顿等。, 2011)使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011). 它产生了一个完善的模型(R（右）_工作= 17.6%,R（右）_自由的=23.0%），分辨率为2.1º。这个精炼表1给出了结构验证统计数据电子密度如图3所示(b条)。使用生成迭代构建合成映射菲尼克斯汽车（见图S4）来评估我们收集的数据的质量。

图3 (一)显示2的电子密度图细节米F类o个−D类F类c（c）(1.0σ)覆盖米F类o个−D类F类c（c）(2.5σ). 左侧面板显示了以人类蛋白质的Leu12和Trp34残基为中心的特写镜头。右侧部分显示，当这些残基突变为鸡肉蛋清溶菌酶中存在的那些残基，即Met12和Phe34时，可以获得更好的电子密度拟合。(b条)电子密度图（2米F类o个−D类F类c（c）在1σ覆盖着米F类o个−D类F类c（c）在2.5σ)根据40233个单晶索引衍射图样计算出溶菌酶的2.1°分辨率。电子密度图涵盖了33到55之间的残基。

我们进行了进一步分析，以确定精炼通过生成随机选择模式的子数据集，确定合并索引模式的数量。为了避免这些比较中的偏差，我们以相同的方式处理了所有子数据集，没有任何手动操作精炼电子密度的变化。的值R（右）_工作和R（右）_自由的在之后获得约束细化图中绘制了不同数量的图案图S5这些图表明，至少需要5000个图案，在当前的实验条件下，可以在不到2小时的时间内测量到，才能获得令人满意的图案R（右）_工作和R（右）_自由的值。

4.讨论和结论

这里所介绍的工作是一个基本的证明，即室温连续晶体学测量可以在高亮度同步加速器上进行，并且可以用于从数万个索引单晶衍射图案中求解蛋白质的结构。我们的工作是朝着采用最近为自由电子激光源开发的串行结晶学方法，用于室温同步加速器数据采集迈出的一步。这里描述的方法同样适用于任何系列样品输送技术，包括无毛细管的自由流动液体喷射、嵌入脂质立方相介质中的膜蛋白挤压到X射线焦点中，以及沉积在通过X射线束扫描的固定靶上的微晶。

改进样品输送系统和光束线设置将允许使用此方法从更小的晶体中采集数据，从而提高样品消耗效率，缩短数据采集时间，缩短晶体曝光时间。例如，可以通过更好地将检测器暴露时间与晶体渡越时间匹配，或者通过使用内径较小的聚碳酸酯毛细管来进行改进，以减少测量中的背景(另请参见支持信息中的§1和图S6). 其他输送系统，如粘性介质的挤压射流（刘等。, 2013; 魏尔斯塔尔等。, 2014)或X射线兼容微流控芯片（Brennich等。, 2011; Weinhausen&Köster，2013年; 尼尔森等。, 2012; Emamzadah公司等。, 2009; 海曼等。, 2014; 平克等。, 2013; 古哈等。, 2012)也可能产生比我们实验中低得多的背景。我们注意到，由于测量是在空气中进行的（相对于X射线自由电子激光系列结晶学实验的真空），样品可以很容易地收集并可能回收。

与传统方法相比，串行方法有几个优点。假设错误主要由光子计数和背景，估计结构系数提高了可以平均的更多测量值。流动晶体而不是将其安装在测角仪上的策略可能导致结构测定以完全自动化的方式，使用类似于连续X射线溶液散射的仪器分配样品（Franke等。, 2012). 该方法可扩展到更快的数据收集，随着第三代同步加速器设施的升级，这将成为可能。例如，欧洲同步辐射设施（ESRF）计划增加辐射源亮度乘以1000倍。这种改进对传统晶体学几乎没有帮助，但可以在更高的流速下进行串行晶体学，晶体渡越时间为微秒，整个测量时间也相应缩短。事实上，我们进行这项工作的P11光束线很快将通过实施一种高达10倍的粉红色光束高通量工作模式进行升级¹⁵ 光子⁻¹。在此设置中，晶体的容许曝光时间为微秒量级，要求流速约为1ms⁻¹这可以通过气动虚拟喷嘴（DePonte等。, 2008)例如。在这种情况下，衍射数据将以超过100个像素的计数采集⁻¹秒⁻¹，因此需要高帧频积分检测器。一种可能的选择是正在开发的自适应增益积分像素检测器（AGIPD），用于欧洲XFEL（Henrich等。, 2011; 贝克尔等。, 2013). 此外，与单色光束相比，粉红色光束的更高带宽（1.5%）将允许测量每个图案中的更多反射，并减少反射偏心对数据的影响（Dejoie等。, 2013; 白色等。, 2013)从而减少了所需的模式数量。

我们的方法避免了深冷，深冷会导致结构伪影或衍射数据的过度解释（弗雷泽等。, 2011). 虽然低温冷却通常不会改变蛋白质的整体结构，但蛋白质的动态特性可能会改变（拉斯穆森等。, 1992)并且在100 K下收集的结构可能与生物相关的活性形式有显著差异。此外，室温测量不需要使用低温保护剂，因此允许晶体在其天然缓冲液中使用，而无需进一步操作。

有证据表明，在室温下，快速接触会产生较大的耐受剂量（布莱克等。, 1962; 索斯沃斯·戴维斯等。, 2007; 欧文等。, 2012; 沃肯廷等。, 2011, 2013). 欧文等。(2012)研究了室温下剂量率对可溶性蛋白、病毒和膜蛋白晶体的影响。在这三种情况下，他们都观察到随着光束强度（每次每面积的光子数）的增加和曝光时间的相应减少，晶体的寿命剂量增加。他们将这种效应归因于羟基自由基在晶体中传播之前收集衍射数据的能力，从而扰乱了晶体结构。沃肯廷等。(2011)研究表明，整体损伤发生在秒级的时间尺度上，并且在X射线被关闭后，损伤会随着时间增加，这种效应称为“暗进展”。我们的方法非常适合进行一系列非常短的曝光，从微秒到几毫秒，以利用较高的剂量率。还值得注意的是，通过将晶体尺寸减小到微米尺寸，可以显著降低辐射损伤，因为二次电子来自水晶（Nave&Hill，2005; 霍尔顿和弗兰克尔，2010年; 萨尼什维利等。, 2011).

最后，串行晶体学方法自然非常适合毫秒级的时间分辨实验（如果可能的话，曝光时间更短，则速度更快），包括测量不可逆反应中的结构变化（Aquila等。, 2012). 不可逆反应的研究要求每个时间点和方向都有一个新的晶体，这可能使标准实验不切实际。此外，较小的晶体可以缩短基质分子在晶体中完全扩散的时间，从而在混合实验中获得更快的时间分辨率（Schmidt，2013).