1.简介

在X射线晶体学中，反射强度与其结构系数振幅的平方成正比( ). 根据测量强度计算结构系数振幅时，需要考虑几个因素，例如洛伦兹，极化，样品照明、衰减和吸收校正（摩纳哥和阿蒂奥利，2002). 远离吸收边缘，样品吸收与波长的立方近似成正比（Arndt，1984). 它取决于包括晶体在内的样品的化学成分、密度、形状和尺寸，以及样品架、母液或用于安装晶体的油和胶水等周围材料。高质量结构测定取决于准确的结构系数振幅。因此，通过计算吸收校正因子来校正测量强度至关重要。对于没有被母液包围或安装在环中的晶体，吸收校正后的布拉格强度由下式给出，以及吸收修正系数用于反射小时在结晶学实验中

哪里L（左）₁(x个, 年, z（z）)以及L（左）₂(x个, 年, z（z）)（以下简称L（左）₁和L（左）₂)是每个晶体元素d的入射和衍射X射线路径长度V（V）、和μ是吸收系数水晶（Albrecht，1939). 由于由此产生的体积积分计算对于不规则形状的晶体来说是难以处理的，因此采用数值方法对多面晶体进行了吸收校正（Busing&Levy，1957; 德蒂塔，1985年). 作为另一种方法，可以将晶体划分为基本四面体，以计算整个四面体的积分（Howells，1950; de Meulenaer&Tompa，1965年; 克拉克和里德，1995年). 分析和数值吸收校正都需要准确描述晶体的形状和尺寸。来自4月3日软件（Bruker，2012)是目视确定和索引所有晶面，并进行分析吸收校正。然而，当晶体的形状不是正多面体时，这是很困难的。此外，晶体周围存在其他材料，如母液和样品架，这进一步增加了复杂性：这些具有不同吸收系数的材料只会产生吸收效应，而不会产生衍射。半经验方法（北方等。, 1968; Kopfmann&Huber，1968年)基于强度测量和对入射光束和衍射光束的假设，并不依赖于对样品形状的了解。然而，它们需要多轴测角仪，方位扫描所需的额外数据可能会对现代同步加速器光源的辐射损伤产生重大影响。独立于样品几何形状的经验方法是基于入射和衍射光束的傅里叶级数（片山等。1972年; Walker&Stuart，1983年)或使用球面谐波（Blessing，1995)以最小化对称相关反射强度之间的残差。随着大面积探测器的引入，这些获得吸收经验修正的数值方法变得流行起来。球面谐波现在是大多数高分子晶体学（MX）数据简化软件包中吸收校正的基础，例如无AIMLESS（Evans和Murshudov，2013年),3000港元（次要等。, 2006),SADABS公司（谢尔德里克，1996年)以及刻度盘（冬季等。, 2018; 贝尔斯滕·德曼德等。, 2020)，同时XDS公司使用无球面谐波的替代数值方法（Kabsch，2010). 然而，经验方法的有效性取决于具有大量对称等效反射，这在数据多重性较低时可能很难实现，例如在低对称空间群中的辐射敏感晶体的情况下。

由于分析吸收校正不依赖于细化参数来最小化对称相关反射的结构-系数振幅之间的差异，因此其成功与否并不取决于数据的多重性。为了分析计算形状不规则样品的吸收校正因子，必须详细描述其形状和方向。先前使用光学显微镜重建包含晶体、样品架和母液的样品三维模型的工作表明，吸收校正在较低的数据多样性水平上是可行的和有利的（Leal等。, 2008; Strutz，2011年). 获得样品3D模型的另一种方法是X射线断层扫描，它已被应用于表征或可视化晶体（Merrifield等。, 2011; 沃伦等。, 2013). Brockhauser曾建议使用断层重建和分割作为吸收校正的基础等。(2008). 这样可以计算穿过样品中不同材料（晶体、样品架和母液）的X射线路径长度，如图1所示.

图1 用于计算晶体体素吸收校正因子的光线追踪方法示意图n个. L（左）(n个)米1和 L（左）(n个)米2表示通过材料的入射和衍射X射线束的路径长度米（回路、液体和晶体）。

虽然X射线吸收在MX的标准波长下通常不被认为是一个问题，但它是长波晶体学中的一个主要限制因素。英国钻石光源光束线I23（Wagner等。, 2016)是一种独特的同步加速器仪器，工作波长范围在1.1至5.9欧之间，可以接触到钙、钾、氯、硫和磷等具有生物意义的几种轻元素的吸收边缘。硫的最大异常信号预计接近吸收边缘(λ= 5.02 Å). 然而，校正超长波长样品吸收增加的困难影响了整体数据质量，导致测量的异常信号减少。应用标准吸收校正协议，发现基于硫的单波长反常衍射实验（S-SAD）的最佳波长为λ=2.75奥米等。, 2023)这清楚地表明需要更复杂的方法来充分发挥长波晶体学的潜力。

在本文中，我们介绍AnAC或这是一个计算机程序，它使用光线追踪方法估计入射和衍射X射线通过层析重建样品的路径长度，以计算长波X射线衍射数据的吸收校正因子。的有效性AnAC或对于在3.54℃下收集的长波长数据集，在膜蛋白OmpK36 GD的晶体上，以及在4.13℃下收集到的血红素结合酶亚氯酸歧化酶（Cld）的晶体上。OmpK36-GD，简称“OmpK36”，是一种373氨基酸的外膜孔蛋白肺炎克雷伯菌参与革兰氏阴性菌（Wong等。, 2019)而Cld是血红素-b条-含有来自氰藻纲PCC7425，每个单体包含181个氨基酸。选择这两个样品进行本研究是因为它们在低对称空间群中结晶，这对标准X射线衍射定标程序中使用的传统吸收校正方法提出了挑战。

2.方法

2.1. 实验工作流程和数据准备

如前所述，制备OmpK36晶体并进行低温保护，未进行任何修改（Wong等。, 2019). OmpK36结晶为棒状空间组 C类2，在非对称单元。较大的样品间变化需要对晶体进行广泛筛选。本研究选择的晶体尺寸为260×30×30µm。Cld晶体是根据先前报告的条件使用协议生产的（沙夫纳等。, 2017)第S2节支持信息中提供了更多详细信息。本研究中使用的晶体尺寸为190×150×90µm，索引为空间组 P（P）1，在不对称单元中有两个单体。

所有实验都是在英国钻石光源的长波长MX光束线I23上进行的。真空取样环境包括圆柱形P12M探测器和多轴测角仪，以便能够从低对称空间群中的晶体收集完整的衍射数据，即使是最长波长的晶体。光束线采样环境中集成了一个层析成像相机，可以在两种实验模式（Kazantsev等。, 2021). 真空数据采集的样品制备遵循光束线I23（Duman）的标准协议等。, 2021). 对于OmpK36晶体，在波长为λ=3.54º，每0.1°旋转角曝光0.1 s，光束传输率50%，顶帽X射线束调整为240×150µm。为了确保数据的完整性，使用卡帕测角仪收集了三组数据中的两组，卡帕轴旋转至−70°，φ轴定位于0°和−120°。三组数据中的每一组都用光子通量1.36×10¹¹ 光子⁻¹计算得出，每个数据集的总吸收剂量为6.5 MGy辐射剂量3D（泽尔丁等。, 2013). 由于Cld晶体的衍射分辨率高于OmpK36晶体，我们选择了低剂量的数据收集策略。在波长为λ=4.13º，使用350×350µm的顶帽光束，每0.1°曝光0.1 s。当光束传输率为5%时光子通量6.7×10⁹ 光子⁻¹每个数据集的吸收剂量为0.1 MGy。22个数据集中的两个数据集是在kappa和phi角度计轴为0°的情况下收集的，而其余数据集是在κ=−70°和20个不同的φ值，介于−120°和120°之间。衍射数据被索引并与刻度盘（冬季等。, 2018)，提供kappa/phi定向矩阵、原始强度、入射矢量、散射矢量和测角仪角度。

衍射实验之后，立即在相同X射线波长下采集层析数据。为每个晶体收集一个180°层析成像数据集，kappa和phi轴设置为0°，光束尺寸为700×700µm，100%传输，闪烁体和样品之间的传播距离为4.9 mm。对于OmpK36 1800投影，收集了30个平场图像（无样品）和30个暗图像（无X射线），每0.1°旋转曝光0.15 s。被测量的通量这个数据集是1.5×10¹² 光子⁻¹导致总吸收剂量为4.8 MGy。对于Cld晶体，收集了900个投影、20个平场和20个暗图像，每0.2°旋转曝光0.28 s，并测量了通量第4.3×10页¹¹ 光子⁻¹，产生0.8 MGy的总吸收剂量。

使用SAVU公司管道（Kazantsev等。, 2022)，处理程序包括标准平场校正，然后去除环形伪影（Vo等。, 2018)和重建。对于OmpK36，通过迭代方法通过ToMoBAR公司中的模块SAVU公司（哈萨克斯坦）等。, 2021)，因为其边缘增强性能提高了结果。对于Cld，数据显示出更好的对比度，滤波备份投影(TomoPy公司)模块（Gürsoy等。, 2014)改为使用。在处理过程中未应用对比度传递函数校正。两个样品的平场图像、原始投影和平场校正投影如图2所示为了便于分割，对裁剪后的数据进行了重建，以尽可能地消除背景并减小图像的大小。OmpK36数据从1600×1200×1200体素的初始体积裁剪为1220×1001×1001体素，而Cld数据缩减为1310×1181×1181体素。根据之前的光束线校准确定的层析图像中的像素大小为0.3×0.3µm。使用可视化软件进行手动分割阿维佐（Thermo Fisher），提供了一个3D模型，其中每个体素都被注释为不同的样本材质之一。基于样本3D模型，计算吸收校正因子并导出到中的缩放模块刻度盘（贝尔斯滕·德曼德等。, 2020)以进一步校正衍射强度。已发布结构，蛋白质数据库（PDB）ID6立方厘米（王）等。, 2019)用于OmpK36和PDB ID5英里（沙夫纳等。, 2017)对于Cld，被用作酒窝管道(https://ccp4.github.io/imple/). “阳极”选项（Thorn&Sheldrick，2011)用于计算异常差值傅里叶图和异常峰高，以及Refmac公司 精炼（穆尔舒多夫等。, 1997)步骤确保相同R（右）_自由的所有吸收校正策略的标志。这个曲柄2分阶段管道（Skubák&Pannu，2013)采用不同策略的相同输入参数，通过单波长反常衍射（SAD）进行实验定相：为F选择AFRO和PRASA模块_A类估计和下部结构测定步骤分别为，后一步骤使用4000次试验，Cld和OmpK36的分辨率截止值分别为2.7º和3.4º。

图2 背景层析投影图像[(一)和(d日)]，示例[(b条)和(e（电子）)]和平场校正图像[(c（c）)和(（f）)]OmpK36（顶部）和Cld样品（底部）。

2.3. 吸收系数

使用平场校正层析图中的强度值通过实验确定吸收系数[图2(c（c）), 2(（f）)]作为入射强度与透射强度之比的估计值。计算所需的穿过每种材料的距离是从3D分割模型中获得的。OmpK36和Cld样品在不同方向的3D模型如图3所示为了确保层析图上的传输强度和来自分割模型的路径长度对齐，使用Python脚本将模型的二维投影叠加到层析图上。通过应用形态收缩，分析中排除了受相位对比度影响的平场校正层析图区域。透射值取自平场校正投影图像中仅存在溶剂的区域，使用穿过母液的50%最长线性路径长度的像素。接下来，逐像素应用比尔-兰伯特定律来计算吸收系数。母液吸收系数然后定义为产生的吸收系数的中位数。该值用于计算其他材料的吸收系数(例如晶体或蛋白质/洗涤剂骨料）。基于空回路层析重建的回路吸收系数库可用于I23波束线上使用的不同回路。测量的吸收系数如表1所示蛋白质/洗涤剂聚集体的组成和密度未知，但最大吸收系数所有材料的平面场校正投影图像与图2所示的平面场校正投影图像一致(c（c）).

表1 线性吸收系数（µm−1)不同材料在OmpK36（λ=3.54á）和Cld（λ=4.13á）样品中的含量 样品 水晶 母液 循环 蛋白质/洗涤剂骨料 OmpK36型 0.01053 0.01208 0.00931 0.0322 氯化物 0.0160 0.01856 0.01724 不适用

图3 OmpK36分段的体绘制[(一)–(c（c）)]和Cld[(d日)–(（f）)]. 透明蓝：母液；黄金：环；粉红色：水晶色；绿色：蛋白质/洗涤剂聚集物。

3.结果

在结晶学中，各种度量，例如R（右）因素（Weiss和Hilgenfeld，1997; Diederichs&Karplus，1997年; Weiss，2001年)，相关系数（Karplus&Diederichs，2012)和信噪比用于评估数据质量。此外，对于长波晶体学而言，相位反常差傅里叶图中的峰高是重要的质量指标（杨等。, 2003). 这些指标与SAD实验阶段化的成功结合使用，以评估三种不同的吸收校正策略，并将其与无吸收校正的缩放进行比较。

合并和细化统计（基于OmpK36的三组数据和Cld的22组数据）如表2所示正如预期的那样，对于这两个样本，所有四种策略都会产生相似的分辨率范围、完整性和独特反射的数量。处理吸收的所有三种方法都会在不进行校正的情况下显著提高数据质量，这一点不足为奇。

对于OmpK36，分析吸收校正（AC）给出了等效合并R（右）球面谐波校正（SH）系数，整体R（右）_合并两者均为0.119。值得注意的是，AC策略导致平均值增加我/σ(我)从16.42（SH）到21.37（AC），以及由异常斜率测得的更强的异常信号（AC为1.69，而SH为1.31）。异常斜率（Evans，2006)是异常差异正态概率图中心区域的斜率：斜率大于1表示异常差异大于其总不确定性。AC和SH校正（ACSH）的结合进一步改进了合并R（右）因素、信噪比和异常信号，以及R（右）_合并降至0.105，平均值我/σ(我)增加到24.92，异常斜率增加到1.91。在图4中(一)，将三种校正策略的硫原子反常峰高与OmpK36的无吸收校正进行了比较。共发现12个硫原子，来自三聚结构中的两个蛋氨酸残基和两个硫酸盐。使用所有三种吸收校正方法都观察到峰值高度的显著增加。AC通常比SH给出更好的结果，但链B中MET310和链C中SO4-1的高度除外，后者在SH数据中更大。总的来说，ACSH策略进一步改善了峰高，但最弱的异常峰SO4-2除外，其中AC和ACSH的表现相似。OmpK36异常峰值的详细信息见支持信息中的表S3–S6。这个细化统计所有策略都遵循与合并统计相似的趋势R（右）ACSH因子最低。SAD阶段化是对分析吸收校正效果的进一步测试。尝试使用一个、三个中的两个以及所有三个可用的数据集进行阶段化。结果总结见表3，表明ACSH策略优于其他策略，只需要两个数据集即可成功分阶段，尽管总体完整性为89.2%，多重性为8.3。AC和SH都需要所有三个数据集（总体完整性为98.9%，多重性为11.0），而NO策略不成功。在三种成功的策略之间，自动构建到实验地图中的正确残数是相同的，这表明地图的质量具有类似的标准，ACSH方法使用的较低数据完整性没有影响。

图4 峰值高度（>5σ)OmpK36中异常散射体的异常差分傅里叶图(一)和Cld(b条)在ACSH数据中按峰值高度的降序绘制，由阳极（Thorn&Sheldrick，2011年). 原始数据见支持信息表S3至S6（OmpK36）和S7至S10（Cld）。

对于Cld，合并R（右）因素，我/σ(我)与SH相比，AC的异常斜率明显好于SH。所有合并统计数据都表明，组合ACSH校正得到了进一步改进。与OmpK36相比，后者的数据质量指标在SH和AC策略之间变化不大，对于Cld，分析吸收校正策略（AC）与SH相比提供了更好的数据统计。例如，在合并方面R（右）因素，我们观察到R（右）_合并SH为0.163，AC为0.112，ACSH治疗后进一步降至0.095。总体平均值也有所增加我/σ(我)从SH的20.22到ACSH战略的44.73，采用高分辨率外壳我/σ(我)遵循这一趋势。异常斜率值从SH的1.36增加到AC和ACSH的2.48和2.5。这表明，由于应用了分析吸收校正，异常信号得到了显著改善。

Cld不同吸收校正策略的异常峰高如图4所示(b条). 除了三个蛋氨酸和每个多肽链一个半胱氨酸外，每个Cld单体还结合一个含铁血红素配体和一个Cl⁻阴离子。单个SO₄²⁻二聚体可以鉴定为阴离子，使反常散射体总数达到13个。与没有吸收校正相比，SH导致更高的反常峰高。根据改进的合并统计，AC和ACSH的异常信号比SH的强。ACSH给出了最高的异常峰值高度。虽然对于OmpK36，AC和ACSH策略相对于SH给出的峰值高度改进相当温和，但对于Cld，从SH增加到AC/ACSH的幅度更大。对于最大的峰MET99和CYS132，我们观察到峰高从14增加到17和18σ分别用于AC和ACSH。关于Cld异常峰高的更多详细信息，请参阅表S7–S10中的支持信息。该样品的实验阶段结果（如表3所示)表明AC和ACSH策略的执行情况非常相似，成功的分阶段结果只需要22个数据集中的两个，总体完整性为83.3%，总体多重性为4.4。对于SH策略，需要三个数据集，整体完整性较高，为94.7%，多重性为5.8。这些结果遵循与上述数据质量指标相同的模式，其中AC策略优于SH方法。对于没有吸收校正的Cld数据，即使在合并了所有22个数据集之后，实验定相也是不成功的。

为了说明AC和SH校正的范围，通过反射分析吸收校正因子的直方图()和球面谐波校正项()如图5所示用于OmpK36和Cld。对于这两个数据集，当采用SH校正策略时，得到的球面谐波项()分布范围很大（0.5-1.5）。当采用ACSH策略时，吸收修正系数的包含()（如图5右侧所示)导致单峰分布范围较窄（0.7–1.3），以1为中心。由于SH模型的“无修正值”为=1.0，在ACSH策略中拟合额外的球面谐波项，与单独AC相比，可进一步改善内部一致性，允许对数据中存在的额外系统影响进行校正。

图5 吸收系数直方图和球谐项用于OmpK36(一)和Cld(b条).（绿色）AC和ACSH策略中使用的是绝对量表，而对于SH（橙色）和ACSH（紫色）是相对比例。

4.讨论和结论

在本研究中，我们证明了基于X射线断层成像三维重建的分析吸收校正在AnAC或我们描述了通过光线追踪方法从3D模型计算路径长度的算法。来自蛋白质OmpK36和Cld晶体的两个超长波长实验表明，与基于球面谐波的标准缩放协议相比，该方法大大提高了数据质量和实验相位调整的成功率。没有任何吸收校正的缩放被视为一种控制，毫不奇怪，它会产生最差的数据质量统计数据和异常峰高，并且对于这两个样品，实验定相都不成功。这清楚地表明，数据质量受到吸收效应的严重影响，表明需要进行吸收校正。

OmpK36的数据，它在单斜晶系中结晶空间组 C类在波长为λ=3.54Å。一个明显的趋势是可见的：分析吸收校正（AC）优于球面谐波校正（SH），两者的结合（ACSH）进一步改善了数据。虽然统计数据的总体改进很小，但在ACSH校正后，仅使用AC和SH策略所需的2/3数据即可解决OmpK36结构，这一事实清楚地表明了这种改进的重要性。对于Cld数据(P（P）1,λ=4.13º）观察到相同的趋势。然而，虽然AC和ACSH之间的差异很小，但它们优于球形谐波校正。这尤其反映在实验定相的结果中，其中两个数据集对AC和ACSH都足够，而从SH校正的数据中求解结构需要三个数据集。通常，ACSH的组合方法对两个样本/波长都给出了最佳结果，因为它可以模拟实验数据中存在的其他系统效应。

X射线吸收随着波长的立方增加而增加，所以λ=1.0Å至λ=4.13？导致吸收系数增加70倍。解析吸收校正补偿了这种增加，反映在产生的球面谐波项的窄单峰分布中在两个ACSH病例中以1.0为中心。本研究中使用的两种样品都在单斜晶系（OmpK36）或三斜晶系（Cld）空间群中结晶。这与长宽比为2:1的圆柱形P12M探测器的不对称性相结合，导致OmpK36的总体数据多重性较低，为5，Cld的情况下仅为3，并且单个360°数据集的数据完整性较差。与球面谐波相比，解析吸收校正不依赖于多次观测，因此非常适合于低对称空间群中的晶体或长波辐射敏感晶体。

AnAC或能够在多个晶体方向以及光束小于样品的情况下校正数据。未来的工作将允许使用实验确定的光束轮廓，并提高软件的效率和速度。目前，瓶颈是创建3D模型的手动分割步骤。长波长相位对比度的增加和当前光束线硬件的限制，特别是测角仪的混淆范围，导致层析重建中的边界模糊。分段3D模型中产生的不准确会影响路径长度和吸收系数计算。因此，这项工作的下一阶段是了解、量化和减少这些影响3D模型的错误。分析吸收校正不仅有利于长波长大分子晶体学，也有利于化学晶体学中的高吸收样品。在这项工作中，分段三维模型是通过X射线层析成像在钻石光源的光束线I23上获得的。然而，AnAC或也可以用于其他来源的数据的分析吸收校正，只要提供带有注释体素的文件，并且知道3D模型的坐标系与衍射实验之间的关系。