Evolution of the analytical scattering model of live Escherichia coli

Semeraro, E.F.; Marx, L.; Mandl, J.; Frewein, M.P.K.; Scott, H.L.; Prévost, S.; Bergler, H.; Lohner, K.; Pabst, G.

doi:10.1107/S1600576721000169

研究论文

的日志
应用
结晶学

国际标准编号：1600-5767

第54卷| 第2部分| 2021年4月| 第473-485页

https://doi.org/10.107/S1600576721000169

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带电体解析散射模型的发展大肠杆菌

^一格拉茨大学分子生物科学研究所，NAWI格拉茨，8010格拉茨，奥地利，^b条奥地利格拉茨8010号BioTechMed格拉茨，^c（c）卓越生物健康领域——奥地利格拉茨格拉茨大学，^天法国格勒诺布尔劳厄-朗之万学院，邮编38043^{e（电子）}田纳西大学环境生物技术中心，美国田纳西州诺克斯维尔
^*通信电子邮件：enrico.semeraro@uni-graz.at,georg.pabt@uni-graz.at

德国汉堡欧洲分子生物学实验室D.I.Svergun编辑(收到日期：2020年8月27日； 2021年1月5日接受；在线2021年3月3日)

一个先前报道的带电体（超）小角X射线（USAXS/SAXS）和（极）小角中子散射（VSANS/SANS）的多尺度模型大肠杆菌根据成分/代谢组学和超微结构限制进行了修订。如前所述，细胞体由带有多个壳的椭球体建模。然而，来自鞭毛的散射被一个术语取代，该术语解释了外膜脂多糖小叶的寡糖核心，包括其与细胞体的交叉项。这主要是由于（U）SAXS实验表明，在有无鞭毛或菌膜的情况下，细菌的散射无法区分。修正后的模型成功地拟合了USAXS/SAXS数据，并将VSANS/SANS数据进行了不同的对比大肠杆菌ATCC 25922长度标度超过四个数量级。具体而言，该方法提供了对细胞膜结构特征的详细了解，包括内外膜的距离，以及所有细菌隔室的散射长度密度。该模型也成功应用于大肠杆菌K12，用于作者的原始建模，以及其他两个大肠杆菌菌株。不同菌株在细菌大小、膜间距及其位置波动方面存在显著差异。这些发现证实了本文概述的方法的普遍适用性，即定量研究杀菌化合物对革兰氏阴性菌超微结构特征的影响，而无需使用任何侵入性染色或标记剂。

关键词：细菌超微结构;小角度散射;超小角度X射线散射;美国XS;甚小角中子散射;VSANS公司;成分建模。

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1.简介

大肠杆菌是生命科学中研究最多的革兰氏阴性菌菌株之一，有许多关于其结构和组成的报告（Breed&Dotterrer，1916 ; 留置权等。, 1955 ; Maclean&Munson，1961年 ; 奈哈特等。, 1990 ; Seltmann&Holst，2002年 ; 希尔豪维等。, 2010 ).透射电子显微镜（TEM）是获得细胞超微结构不可或缺的工具，即细菌细胞壁的几十纳米厚的结构（Milne&Subramaniam，2009 ). 然而，为了最大限度地减少这种技术的侵入性所带来的局限性，我们付出了巨大的努力（霍博特等。, 1984 ; 马蒂亚斯等。, 2003 ). 此外，TEM不允许在生理相关条件下对细胞超微结构进行动态研究，因此不允许实时了解大肠杆菌杀菌化合物，如抗菌剂肽。时间分辨小角度散射实验（赫胥黎等。1980年 )能够探测（亚）微米到亚纳米长度尺度上的结构异质性，而无需使用笨重标签或侵入性染色技术，是解决这个问题的可能方法例如Zemb和Lindner（2002年 )有关散射技术的概述]。例如，在静态平衡实验中，小角中子散射（SANS）被用来探测活叶绿体类囊体膜对外界刺激的反应（利伯顿等。, 2013 ; 纳吉等。, 2014 )，而小角度X射线散射（SAXS）数据的主成分分析用于定性了解抗生素对大肠杆菌（冯·冈德拉赫、加拉莫斯、戈尔尼亚克等。, 2016 ; 冯·冈德拉赫、加拉莫斯、威利等。, 2016 ).

然而，使用SAXS或SANS对活细胞的超微结构进行定量观察是一项挑战。这仅仅是因为这两种技术都提供了整个手机内容的全球平均值，因此很难挑选出单个贡献者（Semeraro等。, 2020 ). 这可以通过广泛使用SANS的对比度变化功能来解决。例如镍币等。(2017 )能够完全氘化枯草芽孢杆菌喂食精氘混合物脂肪酸，这使得他们能够使用SANS突出细菌细胞质膜内的纳米结构域。然而，在不需要在D区培养细菌的情况下，也有可能获得对细胞超微结构的见解₂O.特别是，我们最近报道了一个多尺度模型，它成功地描述了活的散射强度大肠杆菌K12源于五个D的超SAXS（USAXS）、SAXS和SANS实验₂运行/小时₂O比率（Semeraro等。, 2017 ). 具体而言，该模型应用了对细胞体的核-壳描述，由椭球形细胞质空间和多层细胞壁组成，并包括鞭毛在自排空聚合物链方面的贡献（Doi&Edwards，1988 ). 最后一个分量被发现在散射矢量的中高量级上有显著贡献q个。

继续努力使用弹性散射利用超微结构的技术大肠杆菌导致我们在大肠杆菌ATCC 25922具有规则或短鞭毛，以及ATCC无鞭毛突变体Δ飞行控制器具有基本上重叠的散射图案的令人惊讶的结果（参见支持信息中的图S1). 这促使我们在对细菌分子组成及其结构整合进行稳健估计的基础上，彻底修改了我们的分析形态因子模型。这些估计包括所有主要细菌成分的大小、体积、浓度和分布。

简言之，我们修正的细菌模型最重要的变化如下：（i）将构成大分子的大分子视为独立体，导出了不同细胞隔室的平均散射长度密度（SLD）的限制条件，包括代谢组和膜的SLD估计；（ii）鞭毛的贡献被脂多糖（LPS）的寡糖核心所取代，模拟为接枝聚合物；和（iii）膜间距离的变化由对数正态概率分布函数（PDF）建模，同时从模型中去除了细胞半径上可忽略的多分散性。

该模型根据USAXS/SAXS和甚小角中子散射（VSANS）/SANS数据在十种不同的对比度下进行了测试大肠杆菌ATCC 25922，在记录的散射矢量幅度（3×10⁻³<q个<7纳米⁻¹). 这些测试还包括一个更复杂的模型，考虑到异质结构的胞浆，特别包括核糖体的散射。然而，我们的分析表明，核糖体对整体散射的贡献被细胞壁的贡献所压倒。新模型也成功应用于的USAXS/SAXS数据大肠杆菌K12，之前用于设计我们的多尺度模型（Semeraro等。, 2017)以及无膜JW4283和Nissle 1917菌株，揭示了超微结构特征的明显差异。

本文结构如下。首先，我们简要总结了实验方法和样本，然后在第3节详细介绍了修改后的模型，包括支持信息中的成分数据的综合列表。第4节描述了核糖体从异质胞浆散射的分析模型和第5节总结了所涉及的参数和应用的优化策略。将模型应用于五种不同的实验数据的结果大肠杆菌应变在第6节中进行了描述和讨论，在第7节结束之前。

2.材料和方法

2.1. 细菌样本

细菌菌落大肠杆菌菌株ATCC 25922、K12 5K、K12 JW4283（Baba等。, 2006 )和日产1917（Sonnenborn，2016 )在310 K的溶原肉汤（LB）-琼脂（Carl Roth，Karlsruhe，Germany）培养皿中培养。通过在无菌聚丙烯锥形管（15 ml）中的3 ml LB培养基（Luria/Miller，Carl Rothe）中接种单个菌落，从这些菌落中获得过夜培养物（ONC），允许在有氧条件下生长12–16天在310 K的摇动培养箱中培养h。主要培养物通过悬浮等分的将ONC置于10 ml LB培养基中，置于50 ml无菌聚丙烯锥形管中，允许细菌在与ONC相同的条件下生长，直至指数生长期中期。然后立即清洗细胞两次，并将其重新悬浮在无营养和等渗磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中（磷酸盐缓冲液20 mM（M），氯化钠130米M（M）)pH 7.4（Sigma Aldrich，奥地利维也纳）。浊度测量用于控制细菌浓度。光学密度波长下的值λ=600 nm（外径₆₀₀)由分光光度计Thermo Spectronic Genesys 20（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司）获得₆₀₀= 1 ≃ 8 × 10⁸菌落形成单位（CFU）/毫升]。在这些样本中，1个CFU对应于一个单个细胞。如果样品中含有D₂O、细菌悬浮液用PBS或90 wt%D清洗两次₂O PBS溶液，以便在两种缓冲条件下获得两种浓缩储备溶液。将这两种原料混合并稀释至所需的细菌浓度和D₂O含量符合实验设置。

为了保持鞭毛的完整性，ATCC样品的制备过程非常小心。如特纳所述，通过配备22号针头的3 ml注射器将悬浮液剪切五次，制备具有机械破碎鞭毛的ATCC细胞等。(2012 ). 悬浮液在PBS中清洗，以清除上清液中的鞭毛碎片。

ATCC 25922Δ飞行控制器如Silhavy所述，通过噬菌体转导构建菌株等。(1984 ). P1vir噬菌体在菌株YK4516（Komeda等。1980年 )采用平板裂解法。YK4516包含Tn10插入飞行控制器（fliC5303:：Tn10），从大肠杆菌基因库中心（美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学）购买。ATCC 25922菌株作为受体。在含有四环素的平板上选择转导子（10µg ml⁻¹)和飞行⁻通过在半固体琼脂平板（0.3%琼脂糖）上点滴来确认表型。

2.2。实验装置

2.2.1. 美国XS

USAXS/SAXS测量是在法国格勒诺布尔ESRF的TRUSAXS光束线（ID02）上进行的。该仪器使用在针孔配置中准直的单色光束。测量波长为0.0995 nm，样品到探测器的距离为30.8、3.0和1.2 m，涵盖了q个范围为0.001–7 nm⁻¹（纳拉亚南等。, 2018 ). 在Rayonix MX170探测器上获得测量的二维散射图案，并将其归一化为绝对尺度和方位平均，以获得相应的一维USAXS/SAXS剖面。减去缓冲液、样品池和仪器的归一化累积背景，得到最终结果我(q个). 细菌浓度为～10的样品¹⁰ 细胞ml⁻¹在310 K下测量，并包含在直径为2 mm的石英毛细管中，安装在流通装置上，以最大限度地提高背景减影的精度。

2.2.2. VSANS公司

VSANS/SANS测量是在法国格勒诺布尔Laue–Langevin研究所（ILL）的D11仪器上用多线采集的^三256×256像素（3.75×3.75 mm）氦探测器。四种不同的设置（样品到探测器的距离为2、8、20.5和39 m，相应的准直分别为5.5、8、20、5和40.5 m）λ=0.56纳米(Δλ/λ=9%），涵盖了q个范围为0.014–3 nm⁻¹.达到很低q个，大波长的组合(λ=2.1 nm），双聚焦MgF₂使用透镜和镜子来消除有害的重力效应（准直中的中子损失和探测器上的重力污染导致的分辨率损失）；该设置由库比特描述等。(2011 ). 样品（浓度～10¹⁰ 细胞ml⁻¹)在310 K下测量，并包含在2 mm通道的石英Hellma 120-QS班卓形试管中。它们被安装在一个旋转的样品架上，防止细菌沉淀。数据减少了指示灯来自ILL的程序，执行平场、立体角、，停滞时间和传输校正，按事件进行标准化通量（通过监视器），并从空单元格中减去贡献。实验装置和数据可在https://doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-03-910。

2.2.3. 内部SAXS

SAXS空间紧凑型相机（奥地利格拉茨安东·帕尔）配备了Eiger R 1 M探测器系统（瑞士巴登·戴特维尔Dectris），用于实验室SAXS实验。铜K（K）α(λ=1.54º）X射线由30 W-Genix 3D微焦点X射线发生器提供（法国萨塞纳奇Xenocs）。在玻璃毛细管（直径：1mm；Anton Paar），并在使用Peltier控制样品台（TC 150，Anton Paard）进行测量之前，在310 K下平衡10分钟。总曝光时间为30分钟（6帧5分钟），将样品到探测器的距离设置为308毫米。使用该程序进行数据缩减，包括扇形数据整合以及样品传输和背景散射的校正SAXS分析（安东·帕尔）。

2.2.4. 动态光散射

使用Zetasizer Nano ZSP（英国马尔文市马尔文Panalytical）进行测量。ATCC 25922和K12 5K样品（浓度～10⁷ 细胞ml⁻¹)悬浮在1 cm路径长度的玻璃试管中，并在310 K下平衡。此细菌浓度提供了最佳信噪比，并避免了多重散射效应。数据由提供的软件（Malvern）自动分析，该软件通过标准累积量分析提供了细菌种群的单峰概率分布，作为流体动力半径的函数R（右）_H（H）由于生长和分裂过程中细胞长度的变化，每个分布的平均多分散指数为-0.25。平均R（右）_H（H）数值和相关误差由18个测量值（三个不同样本体积的六帧）计算得出。PBS中缺乏能量来源和样品剧烈的旋涡运动（鞭毛碎裂）使细胞运动最小化，使布朗随机行走成为该样品的主要动力学。

3.总体散射贡献和成分建模

整体描述弹性散射从复杂的革兰氏阴性原核细胞中，可以首先考虑其普遍存在的分子和超分子组分，每个组分都有明确的长度、体积和密度范围，这为构建一个全面的散射形态因子模型提供了指导。此处应用的散射贡献估计基于以下方面的最新实验和计算报告大肠杆菌包括孤立的细胞成分。具体来说，我们使用了关于大肠杆菌及其细胞壁（奈德哈特等。, 1990; Seltmann&Holst，2002年; 施瓦兹-利内克等。, 2016 ); 细胞质空间及其成分（Zimmerman和Trach，1991 ; 特威代尔等。, 1998 ; Prasad Maharjan和Ferenci，2003年 ; 贝内特等。, 2009 ; 郭等。, 2012 ; 列别杰夫等。, 2015 ); 细菌的超微结构（霍伯特等。, 1984; 贝弗里奇，1999 ; 马蒂亚斯等。, 2003); 脂质膜的组成和结构（De Siervo，1969 ; 乌塞尔等。, 2007 ; 洛纳等。, 2008 ; Pandit&Klauda，2012年 ; 库切尔卡等。, 2012 , 2015 ; 勒伯等。, 2018 ); LPS细节（Heinrichs等。, 1998 ; 缪勒-洛尼尼斯等。, 2003 ; 库切尔卡等。, 2008 ; 金等。, 2016 ; 罗德里格斯-卢雷罗等。, 2018 ; 米丘拉等。, 2019 ); 周质空间（伯格等。, 1977 ; 拉比申斯基等。, 1991 ; 粉红色等。, 2000 ; 甘等。, 2008 ); 和外部细菌成分（山下等。, 1998 ; Whitfield&Roberts，1999年 ; 斯图卡洛夫等。, 2008 ; 特纳等。, 2012). 所有这些信息都已浓缩到SLD中ρ，如图1所示。有关详细说明，请参阅支持信息（SI）。

图1
的示意图大肠杆菌结构和成分，包括典型尺寸，以及最相关成分的X射线和中子SLD。如Semeraro所述，细菌的形状很容易用椭球体建模等。(2017

当考虑到SANS对给定的分子实体，取决于应用的H₂O/天₂O比率。对于稀释状态下的均匀散射体，即当他们体积分数 $[\phi\ll 1]$ ，的前向散射强度，我（0）与散射不变量有关，问，作为

$[Q={\textstyle\int\limits_{0}^{\infty}{\rmd}Q\，Q^{2} 我（q） }=2\pi^{2}\phi\langle\Delta\rho^{2neneneep \rangle={2\pi^{2} 我（0）}\在{V}}上，\eqno（1）]$

哪里五是散射体的体积和〈Δρ²\9002；是散射对比度的平均平方（Porod，1982 ). 对于非均匀系统，例如复杂的活细胞，平均对比度可以计算为每个细胞室/物种对比度的体积分数加权平均值 $[\langle\Delta\rho^{2}\rangle\simeq\textstyle\sum_{i}\phi_{i{}\Delta\ rho_{ineneneep ^{2]$ ，其中ϕ_我是体积分数的我第个组件。因此，估计ϕ_我和Δρ_我使我们能够近似问所有细菌成分[图2; 另请参见尼克尔斯等。(2017)]。这种近似导致整个电池的“匹配”点约为40 wt%D₂O.较高D时₂O含量-总散射强度越来越由膜的酰基链控制脂质，因为它们缺水。朝下D₂O含量、细胞质成分，如核糖体和蛋白质，依次是主要的散射贡献者。

图2
估计Porod不变量的平方根问作为D的函数₂O wt%，使用方程式（1）计算每个成分

并乘以细胞体积。插图显示了LPS寡糖核心（实线绿色）和鞭毛（虚线粉色）的贡献之间的差异。

3.1. 多尺度散射模型

如前所述（Semeraro等。, 2017)，主体大肠杆菌可以用具有多个壳（多核-壳）的椭球体的散射振幅来描述：

$[{\波浪线{答}_{\rm CS}}（q，\psi）=\textstyle\sum\limits_{i=1}^{M}（\rho_{我}-\rho{i+1}）{{cal F}{rmell}}（q，R{1}+\Delta{i}，\varepsilon R{1{+\Delta i}（psi），\eqno（2）]$

哪里ρ_我是由成分给出的SLD大肠杆菌每个宽度壳的平均值Δ_我(ρ_M（M）+1是缓冲器的SLD）；ψ是与悬浮液中细长物的每个可能方向相关的角度；R（右）₁是细胞质核心（CP）的小半径ɛ>1是专业之间的比率，ɛR（右）₁和椭球的小半径。此外，

$[\eqaligno{{cal F}{\rm ell}（q，R{1}+\Delta{i}，\varepsilon R{1{+\Delta{i}，\psi）&=\left[4\pi u{i}）}\在{u{i{^{3}}}&（3）}]上$

是椭球体体积和归一化散射振幅的乘积（Pedersen，1997 )，其中

$[u_｛i｝=q[（R_｛1｝+\Delta_｛i｝）^｛2｝\sin ^｛2｝（\psi）+（R_｛1｝\varepsilon+\Delta_｛i｝）^｛2｝\ cos ^｛2｝（\psi）]^｛1/2｝。\等式（4）]$

尽管圆柱体将是更真实的细菌形状模型，但在拟合过程中，长线不会引起不稳定性，长线或圆柱体几何形状之间的差异可以忽略不计互易空间（塞梅拉罗等。, 2017). 与之前的模型（Semeraro等。, 2017)与ρ_我用作拟合约束的值。在这里，我们考虑到q个范围，每个大分子物种（蛋白质、核糖体、DNA）的散射贡献等.）分别用于计算平均SLD。与我们以前使用的值相比，这在本质上影响了ρ_我细胞质（现在基于代谢组分析）和磷脂膜的估计（图1). 与…对比弹性散射单脂模拟实验中，每个单层双层的结构参数无法在全细胞分析的背景下进行解析（Semeraro等。, 2020). 因此Δ_我和ρ_我两种膜的值被视为固定参数（见图1; 有关的更多详细信息Δ_我和ρ_我在硅).

这个体积分数细菌悬液的质量分数≤0.007；因此出现了细胞间结构系数相互作用的可能性不大。

可以说，与前一个模型相比，最明显的差异来自鞭毛，鞭毛的散射是以前添加的聚合物结构系数为我(q个)的q个>0.06纳米⁻¹（塞梅拉罗等。, 2017). 然而，令人惊讶的是，本地ATCC 25922的SAXS数据与物理断裂、短鞭毛的ATCC（特纳等。, 2012)而且没有鞭毛Δ飞行控制器ATCC突变体在q个以前被认为是鞭毛主导的范围(图S1). 因此，鞭毛对大肠杆菌散射信号。请注意，普通细菌培养物中鞭毛丝的完整性无法保证，因为过度离心或粗心的样品操作步骤很容易导致其破碎（Schwarz-Linek等。, 2016). 即使我们不能保证参考ATCC样品具有完全完整的鞭毛，但本研究中使用的细菌悬浮液的制备非常小心。相同的样品制备方案使我们能够获得运动细菌（Semeraro等。, 2018 )这表明鞭毛的完整性至少在某种程度上得到了保留。

试图纠正我们的多尺度模型中缺失的散射强度导致我们考虑了来自低聚糖（OS）内核和内核外部的贡献。最初，功能 $[\波浪线{答}_{\rm CS}]$ 被一个描述OS内核的新外壳修改，这导致了非物理结果(图S2). 特别地，ρ_X射线≃ 15 × 10⁻⁴ 纳米⁻²对于OS层，表明水被排出，这与支撑LPS层上的中子反射实验不一致，该实验表明，内部和外部岩芯的水合作用范围为40至80 vol%（Clifton等。, 2013 ; 罗德里格斯·劳雷罗等。, 2018; 米丘拉等。, 2019). 因此，我们决定根据细胞外表面的嫁接块对OS内核进行建模。每个核由高斯链聚合物近似，需要应用聚合物颗粒胶体形式主义（Pedersen&Gerstenberg，1996）). 这种系统的散射形状因子由（Pedersen，2000）给出 )

$[\eqaligno{P_{rm-deco}（q，\psi）&=|\波浪线{答}_{\rm CS}（q，\psi）|^{2}+N_{\rmOS}\beta_{\rmaOS}^{2} 克_{\rm S}（q，R_{\rmg}）\cr&\quad+2\波浪线{答}_｛\rm CS｝（q，\psi）N_｛\rm OS｝\β_｛\rm OS｝G_｛\rm A｝（q，R_｛\rm G｝）\ Phi（q，\psi）\cr&&quad+N_｛\rm OS｝（N_｛\rm OS｝-1）\β_｛\rm OS｝^{2} G公司_{\rm A}（q，R_{\rmg}）^{2}\Phi（q，\psi）^{2}，&（5）}]$

哪里N个_操作系统是操作系统内核的数量β_操作系统=五_操作系统(ρ_操作系统−ρ_高炉)是每个体积和SLD与缓冲区对比度的乘积，

$[G{\rmS}（q，R{\rmg}）=2{\exp（{-x}）-1+x}\在{x^{2}}}\eqno（6）上]$

是结构系数高斯链，以及

$[G{\rmA}（q，R{\rmg}）={{1-\exp（{-x}）}\over{x}}\eqno（7）]$

其散射振幅。x个= (qR（质量风险）_克)²，其中R（右）_克是回转半径操作系统核心的。术语Φ(q个, ψ)式（5）中与OS核沿单个细菌椭球表面均匀分布而产生的“交叉项”有关（Pedersen，2000)并由给出

$[\Phi（q，\psi）={{sin[q（\bar{r}+r{\rm g}）]}\over{q（\bar{r}+r{\rm g}）}}，\eqno（8）]$

其中，根据（4）, $[\bar{r}=[（r_{1}+\Delta_{\rm{outer}}）^{2}\sin^{2{（\psi）]$ + $[（R_{1}\varepsilon+\Delta_{\rm{outer}}）^{2}\cos^{2{（\psi）]^{1/2}]$ .给，R（右）_外面的=R（右）₁+Δ_外面的是描述外表面细胞的。

悬浮液的总散射强度大肠杆菌的单元格数密度 n个然后读取为

$[I{\rm{total}}（q）=n\langle P_{\rm}deco}}，（q，\psi）\rangle_{\psi，{\rm LN}}+{\rm-const.}，\eqno（9）]$

哪里 $[\langle\，f（x）\rangle_{\psi}=\textstyle\int_{0}^{\pi/2}f（x）\sin（\psi）\，{\rm d}\psi]$ 是方向平均值 $[\langle\，f（x）\rangle_{\rm LN}=\textstyle\int_{0}^{\infty}f（x$ 描述周质空间厚度的多分散性。具体来说，我们应用了对数正态分布功能L（左）(第页). 方程（9）中的常数考虑高散射背景q个来源于未经确认的捐款。这个对数正态分布周质厚度的变化考虑到了膜间距离波动的下限，这是由细胞壁结构的有限尺寸决定的。注意，由于过度参数化，未考虑单元大小变化；事实上，细胞半径上的多分散性在中到高的范围内带来了微不足道的变化q个范围，即 q个≥0.05纳米⁻¹。

4.考虑异质结构的胞浆

有理由质疑SAXS/SANS是否可以部分解决细胞内溶质结构。为了解决这个问题，我们推导了一个更复杂的分析散射函数，可以根据实验数据进行测试。

让我们首先考虑球体的一般情况（半径：R（右）₀; SLD（SLD）：ρ₀)悬浮在ρ_M（M），包含N个较小的相同球形珠子(R（右）₁,ρ₁)，其中两个珠子之间的相对距离第页_我<R（右）₀−R（右）₁该系统的散射振幅为

$[A（q）=β_{0}甲_{0}（q）+\beta_{1} A类_{1} （q）\textstyle\sum\limits_{m=1}^{N}\exp（{-i{\bfq}\cdot{\bfr}_{m}}），\eqno（10）]$

哪里β₀= (ρ₀−ρ_M（M）)五₀和β₁= (ρ₁−ρ₀)五₁、和五₀,五₁,A类₀和A类₁分别是球体和单个球体的体积，以及球体和球体的归一化散射振幅。向量第页_米定义内部珠子之间的所有相对距离。总外形尺寸[P（P）(q个) = |A类(q个)|²]然后读取为

$[\eqaligno{P（q）&=\beta_{0}^{2} A类_{0}^{2}（q）+\beta{1}^{2} A类_{1} ^{2}（q）\textstyle\sum\limits_{m=1}^{N}\sum\limits_{k=1}^}N}\exp[{-i{\bf-q}\cdot（{\bf r}_{米}-｛\bf r｝_｛k｝）｝]\cr&&quad+\beta_{0}甲_{0}（q）\β_{1} A类_{1} （q）\textstyle\sum\limits_{m=1}^{N}\left[\exp（{+i{\bfq}\cdot{\bfr}_{m}}）+\exp$

其中第一项是球体的形状因子；第二项是总散射强度N个内珠；第三个描述了球体和珠子之间的交叉项。报道了一种模拟“双相”内部结构的类似方法共聚物系统（Keerl等。, 2009 ). 这里，通过假设 R（右）₁<<R（右）₀和N个→ ∞, 我们可以近似地将这个球体的内部描述为一个宏观正则系统。这使得可以应用正则系综平均值 $[\langle\cdots\rangle_{N}]$ 方程式（11）的总和（克莱因和达古诺，1996年 )，导致

$[eqaligno{langleP（q）\rangle_{N}&=\beta_{0}^{2} A类{0}^{2}（q）+N\beta{1}^{2} A类_{1} ^｛2｝（q）S_｛\rm ss｝（q）+2\β_{0}甲_{0}（q）\β_{1} A类_{1} （q）\cr&\quad\times\textstyle\int\limits_{V}\，{\rm d}{\bf r}\cos{（{\bfq}\cdot{\bf-r}）}\left\langle\textstyle\sum\limits{m=1}^{N}\delta（{\bf-r}-{\bfr}_{m}）\right\rangle_{N}，&（12）}]$

哪里S公司_不锈钢(q个)对应于结构系数珠子之间的相互作用。积分中的总和定义了N个珠。它的系综平均值对应于单粒子密度，由于均匀体系的平移不变性，该密度等于平均粒子密度N个/五₀（Klein和D'Aguanno，1996）). 因此，整个积分简单地等于不适用₀(q个)，得出球形珠系统形状系数的最终形式：

$[eqaligno{langleP（q）\rangle_{N}&=\beta_{0}^{2} A类{0}^{2}（q）+N\beta{1}^{2} A类_{1} ^{2}（q）S_{\rm-ss}（q）\cr&\quad+2N\beta_{0}甲_{0}^{2}（q）\测试版_{1} A类_{1} （q）.和(13)}]$

因此，交叉项受到球体归一化散射振幅的调制，A类₀(q个)，相当于半径球体体积内均匀分布的珠子的卷积R（右）₀重要的是，交叉项的最终形式并不取决于承载小球体的球体的原始体积。也就是说，即使珠子被限制在球体的特定区域内（例如核糖体，核糖体主要分为细胞质的非核区），这个交叉项的标度也不会改变。

在下一步中，我们将球形珠系统转换为异质结构的细菌胞浆。这需要一些近似值。首先，由于散射强度与粒子体积的平方成正比，我们将重点放在核糖体的贡献上。更具体地说，具有体积的核糖体五_铷≃2800纳米^三，总数N个_铷≃ (1 − 6) × 10⁴和R（右）_克=8.77纳米（Zimmerman&Trach，1991年; 列别杰夫等。, 2015)在缺乏X射线或中子的情况下，应该是主要的细胞溶质散射体重水（图2和硅，用于细胞质组成和体积分数）。其次，我们将核糖体的散射近似为非常低q个,即在吉尼亚体系中，通过散射“有效”球体五_铷=2800纳米^三具有R（右）_铷=11纳米。第三，我们假设与不同大小、形状和净电荷的大分子（细胞溶质蛋白）的混合相互作用导致整体有效S公司_不锈钢(q个) ≃ 1. 此外，我们通过一个紧凑的椭球简化了交叉项调节，忽略了核糖体固存于非核苷酸区域，并且交叉项中不包括嫁接的OS核。

然后，考虑到核糖体的贡献，散射强度的最终形式由下式给出

$[\eqalinno{I_{rm{rib\hbox（肋骨盒）{-}单元格}}（q） &\simeq n\left[\langle P_{\rm deco}（q，\psi）\rangle_{\psi，{\rm-LN}}\right.+n_{\rm-rb}\beta_{\rma-rb}^{2} A类_{\rm-rb}^{2}（q）+\cr&\左。\四边形+2N_{\rm-rb}\beta_{\rm-rb}A_{\rma-rb}（q）\langle{\tilde{答}_｛\rm CS｝｝（q）A_｛\rm cyto｝（q）\rangle_｛\psi，｛\rm LN｝｝\right]+｛\rm const.｝，\cr&&（14）｝]$

哪里β_铷=五_铷(ρ_铷−ρ_细胞),A类_铷是核糖体的归一化散射振幅，近似于一个等效球体A类_细胞是描述细胞质空间的长线的归一化散射振幅(即只有核心-外壳系统的核心部分定义 $[\波浪线{答}_{\rm CS}]$ ).

5.参数化和优化策略

描述弹性SAS所需的所有参数大肠杆菌总结见表1通常，我们会区分是否依赖于单个实验的参数(例如样品浓度、散射对比度）。特定于实验的参数被称为“局部”，而其他参数被指定为“全局”参数。

表1
现场多尺度模型修正参数概述大肠杆菌散射，散射(囊性纤维变性.方程式9和14)

		参数	描述
细胞体	b条	n个（毫升⁻¹)	细胞数密度
	一	R（右）（纳米）	电池半径，以CM质量中心为中心
	b条	ρ_{人物配对关系}（纳米⁻²)	细胞质核心的平均SLD
	一	ɛ	大半径与小半径之比

超微结构剖面	一	D类_厘米（纳米）	CM中头部组层之间的中心到中心距离
	一	Δ_运行维护（纳米）	CM和OM之间的中心距
	一	σ_运行维护（纳米）	相关标准偏差Δ_运行维护
	一	D类_运行维护（纳米）	OM中头部组层之间的中心距
	一	Δ_PG公司（纳米）	PG层和OM之间的中心距
	一	W公司_我（纳米）	CM和OM的头组层宽度
	一	W公司_PG公司（纳米）	PG层的宽度
	b条	ρ_技术信息（纳米⁻²)	CM中尾组层的平均SLD
	b条	ρ_收件人（纳米⁻²)	OM中尾组层的平均SLD
	b条	ρ_聚丙烯（纳米⁻²)	周质层的平均SLD
	b条	ρ_我（纳米⁻²)	CM和OM头组层的平均SLD
	b条	ρ_PG公司（纳米⁻²)	PG层的平均SLD
	b条	ρ_高炉（纳米⁻²)	缓冲溶液的SLD

OS嫁接	一	N个_操作系统	操作系统内核数量，即LPS分子
	b条	β_操作系统（纳米）	β每个操作系统核心的价值
	一	R（右）_{g、操作系统}（纳米）	每个操作系统内核的有效回转半径

核糖体	c（c）	N个_铷	每个细胞的核糖体数量
	c（c）	五_铷（纳米^三)	核糖体的体积
	c（c）	ρ_铷（纳米⁻²)	核糖体的SLD
	c（c）	R（右）_铷（纳米）	描述核糖体的“有效”球体半径
(一)全局参数。(b条)局部参数。(c（c）)全局和本地混合，但未针对SANS数据进行测试。有关详细信息，请参阅正文。

描述细胞质膜（CM）和外膜（OM）结构细节的参数是根据在细胞膜模拟系统上的实验和模拟结果确定的大肠杆菌细胞膜（De Siervo，1969; 乌塞尔等。, 2007; 洛纳等。, 2008; Pandit&Klauda，2012年; 库切尔卡等。, 2012, 2015; 勒伯等。, 2018)，详见表2（另请参见图1和硅). 由于缺乏明显的散射特征，这一决定可以合理化q个>0.27纳米⁻¹对应于～20 nm的距离。因此，≤20 nm的结构特征虽然有助于整体散射，但很难以适当的精度进行解析。请注意，膜蛋白的处理方式与其他隔室中的蛋白类似，因为机体单独增加分散的强度，因此不会对内外膜的平均SLD产生影响。与细胞体产生的总散射相比，它们的总贡献可以忽略不计。类似地肽聚糖层（PG），W公司_PG公司、和回转半径操作系统核心的，R（右）_{g、操作系统}，固定为表2中报告的值在分析了他们的贡献之后。W公司_PG公司报告了～6 nm的值（Matias等。, 2003)，以及2.5–7.5 nm范围内的模拟（Labischinski等。, 1991)导致了ρ_PG公司此外，我们的估计表明R（右）_{g、操作系统}<1 nm（参见硅). 然而，在该约束内其值的变化不会导致散射模型中的显著变化，因为R（右）_外面的≫R（右）_{g、操作系统}。

表2
固定参数值列表

参数	值
D类_厘米（纳米）	3.73
D类_运行维护（纳米）	3.33
W公司_我（纳米）	0.75
ρ_技术信息 × 10⁻⁴（纳米⁻²)	8.31†/0.022‡
ρ_收件人 × 10⁻⁴（纳米⁻²)	8.86†/0.012‡
ρ_我 × 10⁻⁴（纳米⁻²)	12.9†/1.24–4.11‡§
ɛ	2.0/1.75¶
W公司_PG公司（纳米）	6
R（右）_{g、操作系统}（纳米）	0.45

†X射线SLD。
中子SLD。
§这两个值分别指具有0和100 wt%D的水合头部组SLD₂O缓冲成分，占可交换H原子的比例。
¶ɛ=ATCC 25922和ɛK12 5K菌株=1.75。

最后，大椭球半径和小椭球半径之比，ɛ为ATCC和K12菌株固定。这一选择是由可用的最低成本驱动的q个范围，该范围未达到细菌散射的吉尼亚高原，因此无法准确测定细胞长度。因此，我们使用了动态光散射首先估计平均长度，L（左）_c（c），来自 $[R{\rm g}^{2}\simeq R{\rm{外}}^{2]/2+L_{\rmc}^{2/12]$ ，使用R（右）_克 ≃ R（右）_H（H）和报告的典型值R（右）_外面的在文学作品中。这导致了 $[L_{\rm-c}^{\rm-ATCC}\simeq 1660]$ nm和 $[L_{\rm-c}^{\rm K12}\simeq 1390]$ 纳米。产生的结果ɛ =L（左）_c（c）/(2R（右）_外面的)随后，在USAXS/SAXS数据优化程序的一些测试运行中，使用R（右）_外面的作为可调参数，然后固定用于详细的USAXS/SAXS和VSANS/SANS分析，得出表2中报告的值。

由于系统的复杂性和参数的数量较多，采用蒙特卡罗遗传选择算法（Banzhaf）对可调参数进行优化等。, 1998 ). 简言之，该算法以一系列在每个循环中重复的步骤为例(一代). 作为步骤零，为每个参数创建了九个低偏差序列（准随机数）(基因)在特定边界内，基于成分估计（参见硅). 九组参数(个人)然后将其用作输入，以测试相同数量的可能散射强度曲线（步骤1，评价). 这包括计算九个标准加权二次方值

$[\chi^{2}={{1}\over{N_{\rm{free}}-1}}\sum_{i}\left[{{i{i}（q_{i{）-i{\rm数据}，i}}\ over{\sigma{i}}}\right]^{2{，\eqno（15）]$

哪里N个_自由的是自由参数的数量σ_我是与测量值相关的误差吗我_数据，我在给定的q个_我.只有四个个人用最低的χ²然后选择值（步骤2，选择)生成第一个后代，包括八个新的个人通过随机移动基因四个选定的父母（步骤3，复合). 新的第九个人是最低的父级的副本χ²值（规则1:继承最好的). 在重组，每个基因被改变的概率有限（步骤4，突变). 此外，替换整个个人用一套全新的随机创建基因（规则2：陌生人). 新的后代结束了第一个周期，每个周期个人再次根据χ²值（跳回到步骤1）。重复该过程，直到最低 $[\chi（中国）^{2}_{\rm{最佳}}]$ 连续25次低于0.5%世代。

这个突变步骤和规则2允许算法跳过χ²景观，而规则1可以使拟合快速收敛。请注意，除了创建个人，在整个算法中使用了伪随机数，用于决策过程复合和突变步骤，以及规则2。还应注意，较大的初始人口（>9个人)没有增加计算时间。每个新的伪随机基因始终限制在初始边界内，以确保保留结果的物理意义。总的来说，每个散射曲线拟合了500次，只有收敛拟合（收敛准则 $[\chi（中国）^{2}_{\rm{best}}/\chi^{2}_{\rm{best}，\rm{min}}\，\lt\，1.15]$ )用于检索每个参数的平均值和标准偏差。

对于SANSq个-另外还考虑了依赖性仪器涂片。这是通过标准卷积实现的

$[I_{rm{fit}}（q）=I_{rm{total}}$

哪里 G公司(q个)是宽度的归一化高斯分布Δq个(q个). 这个Δq个(q个)值作为q个拟合期间的参数是固定的，由D11主要数据处理提供。相反，仪器涂片对SAXS数据的影响可以忽略不计。

6.结果和讨论

6.1. SAXS/SANS全球分析

根据USAXS/SAXS和VSANS/SANS数据对修订后的多尺度模型进行了测试大肠杆菌菌株ATCC 25922。收集了10个具有不同对比条件的SANS数据集，不同的D₂O从0到90 wt%（增量为10 wt%）。SAXS/SANS组合数据分析结果如图3所示和表3和S1（第一阶段）.图3(一)强调了多核-壳模型、操作系统内核和两个交叉项之和的不同贡献[见等式（5）]在USAXS和SAXS制度中。核-壳函数的散射贡献，即由于质量上的巨大差异，细胞体加细胞壁在OS核的散射强度中占主导地位。然而，作为整个细胞表面的函数，交叉项主要负责调节OS核之间的散射强度q个≃0.1纳米⁻¹和q个≃0.3纳米⁻¹。这导致在q个^−1.5和q个⁻²这是嫁接系统的典型特征，也称为“斑点散射”（Pedersen，2000). 以前，这种状态被认为是由鞭毛控制的，用一个自排走聚合物术语（Semeraro等。, 2017). 然而，这并不能描述q个≃0.04纳米⁻¹和散射特征q个≃0.1纳米⁻¹，似乎是ATCC菌株特有的（参见图S3)但不是K12（见下文）。因此，OS-core交叉项可以对q个范围在0.03到0.2纳米之间⁻¹。

表3
描述USAXS/SAXS和VSANS/SANS的全球参数的拟合结果大肠杆菌ATCC 25922菌株

误差是根据收敛配件集合的标准偏差计算得出的。请参见表S1获取局部参数的结果。

	美国XS/SAXS	VSANS/SANS
R（右）	371±3纳米	369±3纳米
ɛ	2†
Δ_运行维护（纳米）	34.3 ± 1.0	32.0 ± 1.0
σ_运行维护（纳米）	7.4 ± 0.7	7.8 ± 0.3
Δ_PG公司（纳米）	17.8±0.2	16.7 ± 1.7
N个_操作系统	(4.7 ± 0.3) × 10⁶	(6.2 ± 0.6) × 10⁶

†固定参数。

图3
(一)USAXS/SAXS数据分析大肠杆菌ATCC 25922使用方程式（9）

，突出显示不同项的贡献（未显示交叉项的负值）。(b条)使用等式（14）对相同数据进行替代分析

显示核糖体的贡献。使用方程式（9）与拟合进行比较

（黑色虚线）显示可忽略的差异。(c（c）)选定D处相同菌株的VSANS/SANS数据₂O对比度（参见图S4更多中子数据）。散射曲线被缩放以获得更好的可见性。

试图用更复杂的核糖体模型拟合相同的数据[方程式（14)]证明了大分子的散射贡献微不足道[图3(b条)]。特别是，在分析误差范围内，普通可调的拟合优度和结果是相同的。因此，与细胞壁贡献相比，核糖体项及其相关交叉项可以忽略不计。请注意，只有SAXS或SANS数据位于D的最低wt%₂O对测试此贡献很敏感。SANS数据以较高重水含量下的酰基链贡献为主（图2). 此外，核糖体是由氨基酸和RNA组成的，它们将不同程度地匹配，因此对分析提出了挑战。请注意N个_铷是该分析中唯一可调整的参数。五_铷和R（右）_铷按照第4节中的详细说明确定值有趣的是，这项测试的结果导致核糖体数量大大减少(N个_铷≃500）比我们估计的N个_铷至10⁴继Zimmerman和Trach（1991）之后)（请参见硅). 这可能与这些分子在局部细胞质环境中的低对比度有关。由于缩放比例与N个_铷(ρ_铷−ρ_{人物配对关系})²有效对比度的微小差异很容易影响大分子数量的测定。

重要的是，这一分析不仅表明来自核糖体的有效散射信号可以忽略不计，而且类似的考虑也可以应用于其他细胞层成分。然而，由于它们的体积较小（蛋白质）或更小体积分数（DNA和RNA），它们对整体分散强度的贡献更小。因此，弹性散射技术不适用于区分活细菌细胞中胞浆内不同结构的隔室。这同样适用于膜蛋白（见上文）或周质空间和肽聚糖层。

图3显示了选定对比度下选定VSANS/SANS数据的分析(c（c）)（整套中子散射数据和拟合见图S4). 显然，使用方程（9）拟合巧妙地捕捉到D变化时散射强度的所有变化₂O浓度，为我们的建模方法提供了有力支持。图4总结了形成细菌包膜X射线和中子SLD剖面的结果参数，同样在选定的中子对比度下（参见图S5对于所有中子SLD轮廓）。X射线和中子剖面中的距离以及全局参数之间的微小差异（表3)，是由于样品的生物可变性，但除N个_操作系统，仍在结果的置信范围内。10 wt%D时₂O、不同平板之间的对比差异与SAXS数据中获得的对比差异具有可比性。在这些情况下，散射强度在q个≃0.1和0.3纳米⁻¹（图3). 反过来，在40 D时₂O wt%（同样高达90 wt%D₂O）高水分细菌亚室（PG层）的对比等）远低于两种膜疏水区域的主要对比度[图4(b条)]。此特性导致散射特性从q个≃0.27纳米⁻¹到q个±0.2纳米⁻¹[图3(c（c）)]这主要与膜间距离有关。这与不变量估计在质量上是一致的（图2)这表明散射强度主要由D的酰基链区域的贡献决定₂O≥40 wt%。

图4
(一)ATCC 25922菌株细菌超微结构的X射线SLD剖面图，对应于图3所示的拟合

(一). 小组强调了细胞质和外膜的平均位置，以及肽聚糖层。横坐标描述了沿小半径距离单元中心的距离R（右）. (b条)选定的相同应变的中子SLD剖面[囊性纤维变性.图3

(c（c）)]。另请参见表S1。

为了测试我们的建模策略，我们报告了不同SLD随D的变化₂O含量。由于溶剂可以自由地进入细胞质和周质空间，因此这些图应该显示出线性依赖性。事实上，趋势遵循了预期的行为，这也使我们能够计算各个隔间的匹配点[图5(一)–5(c（c）)]。注意，水合磷脂头部组的SLD值是固定的（表2). 在以下情况下β_操作系统，散射贡献被源于膜间距离D的信号所取代₂O<60 wt%。线性趋势β_操作系统因此，在0−50 wt%范围内确定，然后外推到更高的D₂O浓度使用置信边界 $[\pm 20\%]$ 。该分析的结果用于导出作为D函数的测量有效不变量₂O wt%[图5(天)]。与估计值的比较问显示了从估计的40 wt%到测量的50 wt%D的最小偏移₂O、可能是因为在D处占主导地位的成分贡献较大₂O≤30 wt%（图2). 另一方面，这些组分是被证明具有可忽略散射贡献的高分子。

图5
(一), (b条)细胞质图（红色圆圈）、周质图（绿色方块）和肽聚糖（橙色三角形）SLD，以及线性配件和匹配点。磷脂头部组层的SLD为固定参数（蓝色三角形）。(c（c）)图β_操作系统（紫色圆圈）值，以及线性拟合和匹配点。(天)估计的散射不变量和外推的前向散射之间的比较。

这个悖论的答案可以在单个分散并包含在SLD平均值中的大分子之间没有净尺寸差异的情况下找到。从细胞溶质蛋白质的凝胶过滤转化分子质量分布（Zimmerman和Trach，1991年)在我们的实验中检测到的最小蛋白质尺寸处，概率分布函数产生最大值（参见硅). 因此，参数中可能需要包含最小细菌蛋白质的一部分ρ_{人物配对关系}.我们的拟合值ρ_{人物配对关系}事实上，大于SAXS和SANS分析中代谢物的估计SLD（比较图1和表S1). 无论如何，估计的不变量只是作为我们建模的一个有价值的指南。显然，方程式（1）在悬浮液密集和拥挤的情况下，将失去其有效性，并且会有一个新的公式来解释每种悬浮液体积分数应用于改进估算（Porod，1982).

6.2. ATCC与K12相关菌株的比较

在成功验证了我们的现场多尺度模型之后大肠杆菌ATCC，我们测试了新模型是否也适用于其他大肠杆菌菌株。图6显示了K12 5K、JW4283和Nissle 1917菌株与ATCC相比的USAXS/SAXS数据。引人注目的是，K12 5K、JW4283（无流苏）和Nissle 1917的散射模式在q个>0.06纳米⁻¹表明这些菌株的主要超微结构特征是保守的，并证实菌毛的存在对SAXS没有贡献。还要注意，我们以前的模型将完全适合所有K12菌株。低层散射强度的不同最小位置q个相反，这些值是由于不同菌株的大小不同。

图6
对ATCC、K12、无菌毛K12 JW4283和Nissle 1917菌株的USAXS/SAXS数据进行多尺度分析。插图显示了的对数正态PDF图Δ_运行维护ATCC（红色实线）和K12（绿色虚线）应变值。JW4283和Nissle 1917的PDF与K12相当，因此未显示。

重要的是，我们的新模型能够拟合所有应变，与实验数据的总体一致性证明了这一点（图6). 表4中报告了该分析得出的结构参数和第2页这些参数大多具有可比的量级。显著差异与细胞大小有关(R（右）,ɛ)–在散射极小值的不同位置观察到（图6)、操作系统内核数(N个_操作系统)和膜间距离(Δ_运行维护,σ_运行维护). 最后一个与实际周质空间厚度有关，通过Δ_运行维护= (2W公司_我+D类_厘米+D类_运行维护)/2（参见图S6X射线SLD剖面）。K12相关菌株的周质厚度及其波动均小于ATCC菌株。请注意Δ_运行维护K12 5K与我们之前报告的类似菌株（Semeraro等。, 2017). 尽管不同Δ_运行维护和σ_运行维护对于ATCC和K12应变，相对波动的幅度σ_运行维护/Δ_运行维护≃（0.16–0.22）大致保守。

表4
ATCC 25922、K12 5K、JW4283和Nissle 1917菌株USAXS/SAXS分析的局部自由参数集的拟合结果

自由参数	ATCC 25922型	K12 5公里	JW4283型	日产1917
R（右）（纳米）	371 ± 3	363 ± 3	471±4	397 ± 3
ɛ	2†	1.75†	1.71 ± 0.03	1.75†
Δ_运行维护（纳米）	34.3 ± 1.0	23.8 ± 0.6	26.5 ± 0.8	23.4 ± 0.6
σ_运行维护（纳米）	7.4 ± 0.3	4.2 ± 0.2	5.4 ± 0.3	3.7 ± 0.2
Δ_PG公司（纳米）	17.8±0.2	16.8 ± 0.2	17.8 ± 0.2	17.3 ± 0.2
N个_操作系统(×10⁶)	4.7±0.3	4.10 ± 0.12	6.0 ± 0.6	4.09 ± 0.17

†固定值。

考虑到细胞大小的差异，根据细胞表面，我们发现一个遵循K12 5K（2.8×10⁶ 纳米²)<Nissle 1917（3.3×10⁶ 纳米²)≃ATCC 25922（3.4×10⁶ 纳米²)<JW4283（4.5×10⁶ 纳米²). 细胞大小的差异预计与支配细胞膜外叶的脂多糖分子数量有关。的确，N个_操作系统大致遵循细菌外表面的观察顺序（表4). 规格化N个_操作系统细菌外表面的数值导致LPS表面密度1.3–1.5纳米⁻²然而，由于每个LPS的横截面积为～1.6 nm²（克利夫顿等。, 2013; 米丘拉等。, 2019; 金等。, 2016)，预期的表面密度为～0.6纳米⁻²。这两个估计值之间的差异很可能是由于通过考虑长线近似值低估了细菌表面，或由β_操作系统，比如N个_操作系统，缩放散射贡献低聚糖及其交叉项[方程式（5）]. 另外一个因素可能与细菌表面的粗糙度有关（Alves等。, 2010 )，这导致有效表面比我们简单估计中考虑的更大。

最后，PG层和OM之间的中心距Δ_PG公司~17 nm，带X射线SLDρ_PG公司≃ 10.2 × 10⁻⁴ 纳米⁻¹对于目前研究的所有人大肠杆菌菌株。此前，我们报告Δ_PG公司≃11 nm（Semeraro等。, 2017)，这似乎与脂蛋白交联肽聚糖绞合到外层膜。与预期值的偏差可能是由于Δ_PG公司与Δ_运行维护，此处由对数正态分布功能。为以下变量设计单独/部分耦合的分布函数Δ_PG公司然而，它超出了当前的实验分辨率。相比之下，我们的新价值 $[\rho_{\rm PG}^{\rm{X\hbox{-}射线}}]$ （以及 $[\rho_{\rm PG}^{\rm{中子}]$ 对于ATCC），现在与报告的肽聚糖层，即80–90 vol%（Labischinski）等。, 1991; 粉红色等。, 2000). 之前报告的值，～11.6×10⁻⁴ 纳米⁻¹包括SLD平均值中存在的大分子物种。

7.结论

天然与无鞭毛/菌毛SAXS数据的相似性大肠杆菌菌株使我们修正了先前报道的散射形态因子模型（Semeraro等。, 2017)革兰氏阴性菌大肠杆菌.鞭毛的贡献被替换为考虑到寡糖的内外核的散射脂多糖，根据接枝聚合物模型。这里提出的模型基于对每个细胞成分的特征长度、体积和散射长度密度的详细成分和结构估计，从而统一了几十年来对大肠杆菌超微结构和分子组成成单一的综合散射函数。导出的模型适用于X射线和中子散射实验，因此可以使用强大的对比度变化技术，以突出或消除特定细菌室的贡献。

有趣的是，我们发现（U）SAXS/（V）SANS联合实验对细胞质的结构异质性不敏感，因为其组成大分子的散射信号被细胞膜的贡献所淹没。同样，综合分析无法报告亚纳米范围内的差异，尤其是细胞质或外膜的差异，例如厚度或成分不对称等等。因此，CM和OM的潜在SLD变化固定在表2中详述的值，以及肽聚糖层和有效R（右）_克每个低聚糖核心。反过来，我们的技术对整体细胞大小、细胞质和周质空间的平均对比度以及细胞膜的结构高度敏感。最后一个包括细胞质和外膜之间的距离，以及其平均波动，以及肽聚糖层和外层膜。我们模型的一个潜在警告是参数β_操作系统,N个_操作系统和Δ_PG公司只能定性地确定。具体来说，LPS分子的总数（寡糖核心）受到椭圆表面近似细菌外壳的影响，而肽聚糖层和外膜似乎取决于所用的膜间距离分布函数。总的来说，我们模型的稳健性通过导出的参数与大量有关大肠杆菌超微结构。

总之，弹性散射现场实验大肠杆菌提供特定超微结构细菌特征的集合平均值，无需侵入性标记，并与透射电子显微镜或光学显微镜。这里我们报告了五个变量之间的差异大肠杆菌菌株，主要是由于整体大小和膜间距离（表6). 未来的研究可能会利用该平台来检测不同样品生长条件的影响或抗生素等杀菌化合物的影响。特别是，我们的分析与毫秒时间分辨（U）SAXS相结合，可以对其活动进行动态检测。我们的实验室目前正在探索这种抗菌方法肽。我们还注意到，为不同菌株（包括革兰氏阳性菌、其他简单生物和细胞）设计类似模型需要类似质量的补充信息，以便为可调参数设置适当的物理约束。然而，本文提出的模型提供了如何进行此类努力的方法和指南。

支持信息

链接https://doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-03-910

支持信息文件。内政部：https://doi.org/10.107/S1600576721000169/vg5126sup1.pdf

致谢

ESRF–欧洲同步加速器（European Synchrotron）和劳厄-朗之万研究所（Institute Laue–Langevin，ILL）分别获得了SAXS（提案LS-2869）和SANS（扩展8-03-910）波束时间。作者还感谢来访者在格勒诺布尔EMBL的实验室支持，他们在SAXS和SANS实验期间提供了细菌样本制备的实验室设备。作者感谢T.Narayanan对USAXS/SAXS测量的支持，以及富有成果的讨论和建议，并感谢N.Malanovic分享她在细菌培养方面的专业知识。最后，作者感谢分子生物科学研究所的工作人员、束线ID02和D11仪器的支持和可用性。

资金筹措信息

这项工作是在奥地利科学基金（FWF）项目P30921（授予KL）的框架内进行的。

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