1.简介
在过去的二十年里,X射线晶体学,特别是大分子X射线晶体学,在自动化和生产量方面取得了巨大的进步。这在一定程度上是由于新一代同步加速器设施以及现代探测器(Leonarski等。, 2018; 弗尔斯特等。,2019年; 欧文等。, 2016). 此外,自动化整个过程的尝试已经导致结晶筛选技术、机器人辅助的同步加速器束线样品安装、半自动化或完全自动化数据采集以及或多或少完全自动化的数据处理和精炼收集数据的程序(Shaw Stewart和Mueller-Dieckmann,2014; 杜安加马特等。, 2014; 保龄球等。, 2016; 鲍威尔,2017年). 还致力于实现晶体处理和晶体采集的自动化,以解决高通量晶体学的这一瓶颈(Deller&Rupp,2014; 库蒂塔等。, 2015; 赖特等。, 2021; 西普里亚尼等。, 2012). 这些设备大多是专门为某些光束线或实验室制造的,或者已经商业化,但由于涉及材料、机械和电机,成本相当高。因此,它们仅被有限数量的设施和实验室使用。
如果手头没有这样的设备,水晶处理仍然主要是手工操作和耗时。在收集数据之前,生长的晶体需要单独采集并在液态氮中闪蒸冷却。冷却之前,通常在结晶板环境中对晶体进行进一步操作。这种操纵,即晶体留在液滴中的后结晶处理可能包括重金属衍生化以进行阶段化实验、脱水以提高衍射质量或用配体浸泡实验(Heras&Martin,2005; Rould,2007年). 特别是对于药物发现项目,称为片段的小分子化合物的晶体筛选最近被确立为一种高通量技术,需要采集和制备大量样品(Schiebel等。, 2016; 克罗杰等。, 2017; 利马等。, 2020).
衍射实验用晶体样品的采集和制备的整个过程通常包括切开密封结晶板的箔,以便进入单个井,根据实验目的操作特定井的晶体,然后重新密封各个井进行孵化。在随后的阶段,重新打开井以采集样本。总之,这一过程繁琐、耗时,并且限制了实验者在给定时间内可以处理的晶体数量。由于样品操作所需的大多数步骤通常涉及组成结晶液滴的液体的部分蒸发,因此任何优化过程的尝试都必须考虑蒸发。在此背景下,需要提及两个最新发展:第一个是带孔的平板盖(拉链等。, 2014). 这主要是为了减少实验中滴落部分的蒸发。第二个开发是水晶移位器(Wright等。, 2021)一种电动XY显微镜工作台,用于加速晶体处理,同时减少蒸发。
在这里,我们介绍了一种小型且价格合理的设备,它可以减少晶体操作步骤中的蒸发,同时允许轻松处理晶体。因此,它有助于快速晶体处理和收获。它用作放置在结晶板顶部的临时盖子,可以与任何典型的实验室显微镜结合使用。目前,它是为3透镜96-well MRC低调结晶板定制的,但该设计易于调整,可以修改以适应任何符合标准SBS足迹的96-weall结晶板。
2.设计和装配
该设备的设计灵感来自一个滑动拼图:即单个垂直可移动的方形瓷砖可以进入结晶板上的各个井。同时,瓷砖保护其他井,这些井必须保持覆盖,从而防止蒸发,理想情况下需要几个小时。
该装置由一个框架、一个杆、滑动夹、一个由3D彩色塑料制成的杠杆工具和96块丙烯酸玻璃砖组成(图1). 该套装由一个两件式钢笔工具完成,其手柄也是3D打印的。顶部设计用于容纳具有圆形尖端的弯曲套管。所有3D打印塑料部件都是使用Objet30 Pro打印机由热塑性塑料(VeroBlackPlus、stratasys)制成的。瓷砖由0.8 mm厚的丙烯酸玻璃板制成,并使用通用激光系统M20激光器进行切割。激光还用于雕刻中间的瓷砖,即添加直径为1.63 mm的小凹陷。当使用钢笔工具时,这些用作可选手柄。在生产和清洁零件后,将瓷砖插入框架的凹槽中,以便它们可以垂直移动。横杆可防止瓷砖意外掉落或从框架上滑下。因此,瓷砖通过凹槽和横杆保持在框架内。瓷砖可以用指尖移动,也可以用钢笔工具移动,以避免用手触摸。框架的生产,包括丙烯酸玻璃砖的激光处理、所有3D涂漆部件的打印和清洁,以及将96块丙烯酸玻璃砖插入框架,每套大约需要10小时。
| 图1 设备的零件和组件。(一)框架所有部分以及丙烯酸玻璃砖和笔和杠杆工具的示意图概述。(b条)完全组装框架的照片。它被放置在一个3透镜96毫米MRC低轮廓结晶板上,并由四个夹子固定。(c(c))从另一侧看,该装置为示意图横截面显示侧面可用的凹槽。在提升框架时,可以通过拇指使用较大的凹槽来固定板;较小的凹槽适合杠杆工具,以便在完全抬起框架之前松开框架。在特写视图(圆形)中,可以看到插入丙烯酸玻璃砖的凹槽。 |
框架边缘标有相应的井号和字母,帮助实验者跟踪每个位置。在目前的设计中,该镜框仅适用于3透镜96英寸MRC低姿态结晶板。取下相应的密封箔后,将框架放置在准备好的结晶板上。使用提供的夹具,无需粘合剂或油脂即可将其固定在板上。为了从板上安全拆卸框架,左右两侧都有凹槽。提供大凹槽,用拇指固定板。这些小凹槽可以与杠杆工具结合使用,通过简单的转动动作将框架从结晶板上提起。从板上移除框架不会受到之前移除的结晶箔上残留的任何微量粘合剂的不利影响。在结晶板上设置框架的整个处理过程、瓷砖移动的可能方式以及从结晶板上移除框架的方式都在支持信息.1
3.应用
通过将框架放置在结晶板的顶部,每个孔被单独密封,并且可以一次访问一个孔。透明的丙烯酸玻璃砖允许在其密封隔间中观察每个实验。丙烯酸玻璃砖上雕刻的凹陷不会影响水滴的视线。由于框架的高度,可以在3透镜96-well MRC低轮廓结晶板内达到结晶滴的工作角度减少了不到三度(图2). 在典型的实验室显微镜下,这样的角度仍然适合处理/采集晶体。通过考虑蛋白质晶体在结晶板透镜上的通常位置来估计角度。假设操作和收获将从右侧进行,因为这样可以在有和无组装设备的情况下提供最大的空间。如果很难从这一侧操作或收获蛋白质晶体,当然可以将带有框架的板组件移动/旋转到便于搬运的位置。
| 图2 设备可用空间的示意图。图中显示了一个3透镜96-well MRC低轮廓结晶板(紫色)的一个孔的侧视图,该结晶板没有或带有框架(灰色)。板内的半圆代表结晶板的透镜之一。通常蛋白质晶体会朝向透镜的底部,因此角度是从这一点测量的。由于用户通常会选择最舒适的一侧工作,并为操作和收割提供最大空间,因此会比较右侧的角度。(一)没有框架的板。所示的角度描述了在没有54.6°框架的情况下可能的工作角度。(b条)当框架(灰色)置于结晶板顶部时,角度略微减小至52.2°。使用该框架,实验者必须接受角运动范围仅减少2.4°。 |
4.减少蒸发
该设备的目的是用于大多数溶液,但不包括含有挥发性物质作为主要成分的溶液。可在1-6小时内实现可靠的蒸发减少,即达到蒸发平衡后的典型工作会议。如果实验需要更长的孵育时间,则应移除框架,并用高分子晶体学中使用的标准箔重新密封结晶板。为了评估该装置的性能,进行了蒸发实验。评估工作时间,同时用丙烯酸玻璃砖保护实验。通过观察不同溶液的蒸发来测试框架。测试了来自已执行结晶碎片筛选(CFS)活动的浸泡溶液和来自由96种不同结晶溶液组成的典型结晶筛(JSCG Core Suite II,Quiagen)的溶液,以获得可用性范围的概述。
4.1. 减少蒸发–CFS浸泡溶液
在有关浸泡溶液蒸发的实验中,使用了一个3透镜96微米MRC低轮廓结晶板,在测试孔中使用40µl储液罐和0.4µl滴。在板被框架覆盖之前,用吸管吸出储液罐。在用框架覆盖板并通过适当的瓷砖移动进入各个井后,手动设置滴水器。每种溶液都在三个单独的实验中进行了测试,同时小心地将用过的微孔分布在整个板上(角对边对中心)。随后,在固定的放大倍数和焦距下,随着时间的推移肉眼观察滴状物。将平板放置在显微镜镜头下方的电动XY工作台上,允许平板在显微镜下以明确且可复制的方式移动。作为蒸发程度的量度,使用了水滴的直径。照片是通过透明瓷砖拍摄的,而实验是密封的,在整个过程中保持原状。
CFS浸泡溶液通常含有相同的结晶条件组分,此外还含有一定量的二甲基亚砜(DMSO)和低温保护剂。在CFS活动中,要么将晶体转移到浸泡溶液中,要么在结晶液滴中添加DMSO和低温保护剂。晶体通常会浸泡30分钟至24小时左右,具体取决于环境。就我们的目的而言,需要将晶体转移到浸泡液中,浸泡约16小时过夜。在箔密封板中进行一夜浸泡。根据实验者的经验和晶体的质量/坚固性,搬运或收获96颗晶体通常需要1到2小时。这意味着解决方案应在该时间窗口内保持最佳状态,以允许使用该框架在一个会话中传输和采集96个晶体。之前活动中的两种CFS浸泡溶液(Wollenhaupt等。, 2020)作为示例进行测试(图3). 溶液1含有17%(w个/v(v))PEG 4000,180米M(M)Tris pH值8.5,180 mM(M)锂2SO公司4,5%(v(v)/v(v))1,2-丙二醇和8%(v(v)/v(v))二甲基亚砜;溶液2含19.8%(w个/v(v))聚乙二醇4000,68米M(M)醋酸钠pH 4.6,68 mM(M)乙酸铵,19.3%(v(v)/v(v))甘油和9%(v(v)/v(v))二甲基亚砜。液滴在6小时的过程中显示出最小的蒸发,这是进行晶体浸泡和收获约300个晶体的合理时间框架。结果与板上使用的孔的位置无关。BESSY II,柏林Helmholtz-Zentrum(HZB),已经成功使用该设备进行了几次CFS活动。用户通常会报告舒适的使用和水晶处理的显著加速。
| 图3 装置蒸发试验与示例性CFS浸泡溶液对比。描述了HZB BESSY II CFS活动中使用的两种不同浸泡溶液。两种溶液(溶液1和溶液2)都已含有二甲基亚砜和低温保护剂。在将框架放在平板顶部并设置好所有滴液后,立即在0分钟时拍摄每滴的图像作为起点。蒸发观测在几个中间时间点进行了6小时以上。每次使用相同的显微镜和设置拍摄图像。此处描述了两种测试条件下的30分钟和360分钟时间点。即使在360分钟后,也观察到几乎没有变化,因此表明框架对溶液具有很高的蒸发保护作用。 |
6.总结
本文介绍了一种新型的蒸发保护装置,我们方便地称之为EasyAccess框架,它最大限度地减少蒸发,以便于晶体处理和采集。它又小又轻,因此非常适合运输。当前版本的EasyAccess Frame设计用于安装3透镜96-well MRC低调结晶板;然而,该设计将来可以适用于任何其他SBS格式的96 well结晶板。
在大分子晶体学中广泛应用的实验是,例如,重原子衍生化用于相位调整和滴脱水实验用于改善晶体的衍射特性。所有这些应用都可以使用这里提供的新工具方便地执行。还可以在一定程度上为不同的应用程序定制框架。例如,在感光蛋白质晶体的情况下,透明的无色丙烯酸玻璃砖可以换成有色玻璃砖,保护晶体免受特定波长的光的照射,同时仍然允许用户观察附带的实验。对于惯用左手的用户,可以设计一个框架,安装在水平旋转180°的板上。总而言之,EasyAccess框架减少了微量滴定板中的蒸发,同时方便了对平板上单个实验的访问。通过这种方式,它加快了蛋白质晶体的手动操作和采集,从而使X射线结晶学实验总体上受益,尤其是提高了筛选实验的吞吐量。它不需要任何特殊设备,可用于许多不同的实验,因此是每个实验室的理想选择。
7.披露
柏林Helmholtz–Zentrum已向德国专利和商标局提交了关于所报告框架装置的专利申请(注册号DE 10 2018 111 478.8)。此外,通过PCT途径,利用德国专利的优先权,提交了一份国际专利申请。此外,钢笔工具的手柄受到注册设计(注册号DE 40 2018 100 962-0001)的保护。
鸣谢
我们感谢EasyAccess框架的所有用户,他们在几个开发阶段提供了宝贵的反馈。我们还感谢柏林亥姆霍兹-Zentrum建筑部在3D打印和使用3D-print设施方面的帮助。Projekt DEAL支持并组织开放获取资金。
资金筹措信息
我们感谢德国联邦教育和科学部(BMBF)通过Frag2Xtal和Frag4Lead项目(批准号:05K13M1;05K16M1)提供的支持。此外,我们还感谢iNEXT-Discovery(项目编号871037)提供的支持,该项目由欧洲委员会地平线2020计划资助。
工具书类
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