High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure

Shimazu, Y.; Tono, K.; Tanaka, T.; Yamanaka, Y.; Nakane, T.; Mori, C.; Terakado Kimura, K.; Fujiwara, T.; Sugahara, M.; Tanaka, R.; Doak, R.B.; Shimamura, T.; Iwata, S.; Nango, E.; Yabashi, M.

doi:10.1107/S1600576719012846

研究论文

第页，共页
应用
结晶学

国际标准编号：1600-5767

第52卷| 第6部分| 2019年12月| 第1280-1288页

https://doi.org/10.107/S1600576719012846

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大气压下连续飞秒晶体学的高粘度样品注入装置

^一RIKEN SPring-8 Center，1-1-1 Kouto，Sayo-cho，Sayo-gun，Hyogo 679-5148，日本，^b条日本同步辐射研究所，1-1-1 Kouto，Sayo-cho，Sayo-gun，Hyogo 679-5198，日本，^c（c）京都大学医学研究生院细胞生物学系，日本京都606-8501，坂尾县吉田县，^d日日本东京大学科学研究生院生物科学系，地址：2-11-16 Yayoi，Bunkyo，Tokyo 113-0032^{e（电子）}马克斯·普朗克医学研究所，Jahnstrasse 29，69120 Heidelberg，Germany
^*通信电子邮件：tono@spring8.or.jp,e.nango@mfour.med.kyoto-u.ac.jp

美国门罗公园SLAC国家加速器实验室S.Boutet编辑(2019年5月4日收到； 2019年9月16日接受； 2019年10月17日在线)

在SPring-8埃紧凑型自由电子激光器（SACLA）上开发了一种样品注入装置，用于大气压力下的串行飞秒晶体学（SFX）。嵌入高粘度载体中的微晶借助同轴气流和抽吸装置从毛细管喷嘴稳定输送。卡式样品贮存器易于更换，便于重新装载或更换样品。储液罐位于具有温度调节水流的冷却套中，这有助于防止数据采集期间样品温度的剧烈变化。这项工作表明，注射器在人类A的SFX中成功工作_2安培腺苷受体与拮抗剂ZM241385在脂质立方相中复合，并在油脂载体中用于鸡蛋清溶菌酶微晶。该注射装置还应用于多种蛋白质，不仅用于静态结构分析，还用于使用泵-探针技术的动力学研究。

关键词：连续飞秒晶体学;X射线自由电子激光器;室温晶体学;微晶注入.

PDB参考：6jzh号;6jzi号

类似文章

1.简介

系列飞秒结晶术（SFX）是最近发展起来的一种利用X射线自由电子激光（XFEL）测定蛋白质晶体结构的技术（查普曼等。, 2011 ; 布泰等。, 2012 ). 虽然使用同步辐射源的传统X射线衍射数据采集需要在低温下进行测量以防止辐射损伤，但SFX允许在室温下进行数据采集，因为强烈的飞秒XFEL脉冲在辐射损伤开始之前从蛋白质微晶中提供衍射图案（Neutze等。2000年 ). 考虑到微晶被单个XFEL脉冲破坏，补充完整的晶体对于SFX中的数据收集是必不可少的。通常，将晶体悬浮并使用载体介质（如缓冲溶液）注入，作为数微米到几十微米的薄样品流。晶体浓度决定XFEL脉冲击中载体介质中晶体的概率。给定测量效率，晶体密度为10⁷–10⁸晶体ml⁻¹需要获得完整的SFX数据集，该数据集包含来自随机取向晶体的静止衍射图案。然而，高晶体浓度会导致喷油器喷嘴堵塞。此外，由于大多数晶体不与XFEL脉冲相交，这种方法消耗了大量样品。将微晶稳定地输送到XFEL的交互点，该交互点消耗相当少量的蛋白质，仍然是一项技术挑战。为了克服样品输送问题，已经开发了几种样品注入方法。气动虚拟喷嘴（GDVN）利用氦鞘气流聚焦缓冲溶液中由晶体悬浮液组成的液体射流，以减少样品消耗（DePonte等。, 2008 ). 在另一种液体喷射注射方法中，微流体电动样品架（Sierra等。, 2012 )基于静电纺丝中使用的原理。或者，使用高粘度载体介质，例如脂质立方相（LCP），以低速挤压样品（Weierstall等。, 2014 ).

使用高粘度载体的注入方法具有能够减少SFX样品消耗的巨大优势，因为它们的流速比液体喷射方法低。通常，浓度为10的高粘度样品⁷–10⁸晶体ml⁻¹以0.25–0.5µl min的流速输送⁻¹，而GDVN通常需要10µl min的样品流速⁻¹以产生浓度为10的稳定晶体悬浮液射流⁸–10⁹晶体ml⁻¹例如，人类5-羟色胺的SFX结构_第2页仅使用LCP中结晶的300µg蛋白质测定受体（Liu等。, 2012 ). LCP结晶法脂类例如，单油精适合生产高度有序的膜蛋白微小晶体（Landau&Rosenbusch，1996 ; Caffrey&Cherezov，2009年 ). LCP中的晶体可以加载到样品注射器因为凝胶状LCP材料作为高粘度载体而产生。对于通过蒸汽扩散或分批结晶生产的挤压样品，润滑脂（Sugahara等。, 2015 )是一种通用的憎水介质。例如，溶菌酶的结构是通过油脂基质法从100微克蛋白质（Sugahara等。, 2015). 凡士林（博萨等。, 2015 )也可用作SFX中样品输送的疏水性载体介质。为了降低背景噪音和/或扩展高粘度载体方法的适用性，亲水介质如琼脂糖（Conrad等。, 2015 )，透明质酸（Sugahara等。, 2016 )纤维素衍生物（Sugahara等。, 2017 ; 科瓦斯科娃等。, 2017 )，Pluronic F-127（Kovácsová等。, 2017)和高分子量聚环氧乙烷（Martin-Garcia等。, 2017 )也用于SFX实验。

为了注入高粘度样品，Weierstall开发了LCP注射器等。(2014). 该喷油器由一个由高性能液相色谱法（HPLC）泵、样品储罐和喷嘴部分。沿着喷嘴部分内毛细管的同轴气流使LCP流保持在轴线上。在Linac相干光源LCP注入器的初始应用中，LCP中的微晶在～10℃的真空室中被挤压⁻³ Torr，其中环境气体的背景散射被完全抑制。然而，样品在真空下的蒸发冷却导致LCP转变为片状晶相，提供了强衍射环（Weierstall等。, 2014). 这个相变通常通过添加7.9单酰基甘油[MAG:1-（7Z轴-十六碳烯酰基）-rac公司-甘油]或9.7 MAG[1-（9Z轴-十六碳烯酰基）-rac公司-甘油]到样品（刘等。, 2014 ). 然而，这些脂类被认为是珍贵的脂类因为它们的价格是单油精的五到九倍。因此，最好在注射过程中抑制样品温度的急剧变化。此外，真空环境为安装设备或安装样品注射器。最近，SFX实验引入了大气压环境（氦气或空气），以增加灵活性（Tono等。, 2015 ; 齿状山脊等。, 2019 ).

在这里，我们描述了在大气压下用于SFX实验的高粘度样品注入装置的开发。样品注入装置由高粘度筒式（HVC）注射器和抽吸装置组成。为了证明样品注入装置的性能，使用LCP生长的人类A微晶进行了SFX实验_2安培腺苷受体（A_2安培AR）与非黄嘌呤拮抗剂ZM241385络合，并在SPring-8埃紧凑型自由电子激光器（SACLA）（石川）的油脂载体基质中的鸡蛋白溶菌酶微晶上等。, 2012 ). 样品注入装置在恒定的样品温度下稳定挤出嵌入高粘度载体中的微晶。

2.大气压下高粘度样品注入装置

2.1. 高粘度筒式注射器

HVC注射器设计用于SACLA（DAPHNIS）（Tono）硬X射线衍射多样性应用平台的衍射室等。, 2015). 其结构和工作原理基于Weierstall开发的LCP注射器等。(2014). HVC喷油器由液压缸、样品储罐、冷却套和喷嘴组成（图1). HPLC泵（LC-20AD，岛津）向气缸提供调节的水流，以便向液压缸中的柱塞施加输入压力。柱塞使用活塞推动高粘度样品，使其从喷嘴的内部毛细管中连续挤出。通常，使用内径（ID）为75µm的毛细管喷嘴，施加0.2–0.4 MPa的液压来挤压LCP或油脂嵌入晶体。该喷嘴包括一个内部毛细管喷嘴（34 mm长）和一个用于同时流动气体的外部金属喷嘴。内喷嘴的标准ID为75和100µm，适用于5–30µm微晶。对于较小或较大的晶体，也可以使用不同ID（50、125和150µm）的内喷嘴。具有不同ID的每个喷嘴的共同外径（OD）为360µm。在所有喷嘴中，内毛细管的下游端被锐化为小锥角（<10°），并从外喷嘴伸出约500µm，以防止挤压样品卷曲，如支持信息.氦鞘气由外喷嘴供应，以保持样品流平直，并由放置在实验柜外的流量计（FSM2-NVF050-H063N，CKD Corporation）进行调节。通常，空气转换的流速在0.3至0.5升之间⁻¹对于所有喷嘴，取决于高粘度介质的类型。氦的实际修正流量大约是其六倍。温度调节水流经冷却套，以保持样品温度恒定。尽管由于实验箱内设备的热量，注射器经常受到高温（300–303 K）的影响，但冷却水可以防止数据采集过程中样品的变质。具体而言，LCP载体对温度变化敏感，并且在较高温度下经常改变其粘度，这可能导致液滴形成或样品流不稳定。因此，温度控制对于从注射器中稳定挤出样品至关重要。

图1
横截面示意图(一)和照片(b条)HVC注入器。

HVC注射器最显著的特征之一是一个筒式样品贮存器，它便于样品的装载（图2). 药筒储液器由聚甲基丙烯酸甲酯制成；之所以选择这种材料，是因为它具有化学耐久性、耐高压性和透明度，可以观察内部样品。使用了两种类型的滤芯，内径为4 mm（内部容积为200µl）或2 mm（内部体积为70µl(一)]. 特氟龙插头，如图2所示(一)，用于在200µl滤筒中形成紧密密封。筒形塞长8mm，直径4mm，两端各有一个O形圈（内径2mm，外径4mm）。对于70µl药筒，与无导线心脏起搏器注射器类似，使用两个聚四氟乙烯球形成密封（Weierstall等。, 2014). 丙烯酸滤筒可以承受1 MPa的最大液压，这相当于70µl滤筒内样品的64 MPa。可以使用图2所示的连接器工具将100µl气密注射器（编号81065，Hamilton）中的高粘度样品装入筒中(b条). 或者，可以通过连接到注射器的针头装载样品。断开注射器后，应对药筒进行离心（10–20 s，8000克)去除载体介质中的气泡，如图S2所示。装载的样品通过离心作用沉降到药筒的下游端，如果药筒用柔性薄膜（如Parafilm）密封，则可以储存以备日后使用。最后，将滤芯插入喷油器体的冷却套中，在测量期间通常设置为293 K。使用设置为293 K的冷水机组，将实验箱中丙烯酸筒内的样品温度保持在293.2–293.4 K，温度为301 K。通过改变循环水的温度，可以将样品温度从277 K控制到313 K。

图2
筒式样品贮存器。(一)插入聚四氟乙烯零件（底部）以形成紧密密封的套筒的截面示意图（顶部）和照片。70µl筒式储气罐的两个特氟龙球的直径为2 mm。200µl盒式储气瓶的筒形零件由一个特氟隆零件（长8 mm，直径4 mm）和两个O形圈（外径4 m，内径2 mm）组成。(b条)用于将样品从Hamilton注射器装入样品贮存器的连接器工具。连接器工具由两个金属部件组成，一个金属环形垫片（外径12 mm，内径10 mm）、一个O形环（外径6 mm，内径4.5 mm）和一个聚四氟乙烯注射器适配器（长度8 mm，直径7 mm）。零件A和B长11 mm，直径23 mm。如下图所示组装每个零件，然后用细棒将聚四氟乙烯球移动到左端。随后，将装有样品的100µl气密注射器（编号81065，Hamilton）连接至工具。样品从注射器通过工具装入筒中，直到聚四氟乙烯球到达右端。在俯视图中，用红色墨水涂色的油脂作为样品。HVC注射器也可使用未充满的样品储罐进行样品注入。

在使用内径为75µm的喷嘴进行的SFX实验中，样品流速通常设置为0.24µl min⁻¹在以30 Hz工作的XFEL脉冲之间传输30µm样品。最小流速约为0.1µl min⁻¹取决于晶体载体。喷油器可以使用200µl连续工作14小时⁻¹样品盒。另一方面，光学激光泵浦和XFEL探针实验要求泵浦激光束之间保持足够的间隔，以避免任何光污染。例如，以5.6µl min的流速挤压混有油脂的光系统II晶体⁻¹使用内径为150µm的喷嘴进行泵-探针测量，使用纳秒激光。最大的ID喷嘴用于防止堵塞，因为光系统II晶体的尺寸高达100µm，可以对X射线进行2.1º的衍射。5.6µl min的高流速⁻¹有必要避免泵引起的光污染光散射在样本流上。在这种情况下，储液器中的样品在36分钟内被消耗掉（Suga等。, 2017 ).

2.2. 样品抽吸装置

除了来自外部金属喷嘴的氦鞘气体外，还有一个样品抽吸装置[图3(一)]用于保持来自注射器喷嘴的直样品流。高强度XFEL脉冲通常会切断高粘度微流；因此，样品容易卷曲。抽吸装置可防止样品卷曲，这与鞘气体的作用类似。

图3
(一)样品抽吸装置安装在HVC注射器下方。(b条)样品抽吸装置的截面示意图。吸嘴外径为4 mm，内径为2 mm，并呈锥形，以防止晶体衍射干扰。

抽吸装置由抽吸管、带海绵过滤器的样品接收器和连接至真空泵（DA-60S，ULVAC）的排气口组成，最大抽吸速度为72 l min⁻¹，如图3所示(b条). 吸嘴位于注入器喷嘴正下方约1.8 mm处，用于在X射线照射后吸取高粘度样品。喷嘴内径（2 mm）已经过优化，以获得足够的吸力。抽吸装置通过一根柔性真空软管（约17米长）与实验小屋外的真空泵相连。将流量计（FSM2-NVF050-H063N，CKD公司）插入真空泵前，以从机柜外部调节吸入管线中的气体流速。通常，空气转换流量为0.5–1 l min⁻¹（氦的实际流量为3–6 l min⁻¹). 虽然气体流速取决于高粘度介质的类型，但它不受喷油器喷嘴内径的影响。收集废样品的样品接收器可以很容易地更换。接收器中的海绵过滤器可防止吸入管被废样品堵塞。样品接收器的容量为～10 ml，但由于在累积4–5 ml废弃样品后，吸液能力通常开始下降，因此应在24小时内更换接收器一次或两次，以进行需要较高样品流速的SFX实验，例如最小5.6µl⁻¹.

3.实验

3.1. A的结晶_2安培AR与ZM241385复合

A类_2安培AR是通过用一种热稳定的脱细胞色素b562替换第三个细胞内环来进行工程的，该脱细胞色素b 562是使用杆状病毒系统在食果夜蛾Sf9昆虫细胞，然后如前所述进行纯化（刘等。, 2012; 日本阪岛中根等。, 2016 ). A的晶体_2安培AR与ZM241385[4-（2-{7-氨基-2-（2-呋喃基）[1,2,4]三唑[2,3的配合物-一][1,3,5]三嗪-5-基氨基}乙基）苯酚]。约50 mg ml⁻¹使用连接至注射器耦合器的汉密尔顿注射器将纯化蛋白溶液与熔融脂质混合（Caffrey&Porter，2010 )并在含有54%的LCP中重组(w个/w个)单油精（Sigma）和6%(w个/w个)胆固醇（阿凡提极性脂质）。LCP中的晶体通常使用刘开发的方法在注射器中生长等。(2014)用于SFX实验。然而，在这项研究中，使用了另一种使用薄金属丝的结晶方法。该方法最初是为LCP-SFX（Nango等。, 2016 ). 简言之，在重组成LCP后，取下耦合器和特氟隆套圈，并将清洁线（～2 cm长）插入注射器内的蛋白载LCP中。将带蛋白的LCP直接从注射器挤出到0.6 ml Eppendorf管中，形成直径为1.5 mm的柱，如图S3所示。将圆柱形LCP浸入含有27%的沉淀剂溶液中(v（v）/v（v）)聚乙二醇400，50米M（M）硫氰酸钠，2%(v（v）/v（v）)2,5-己二醇和100 mM（M）柠檬酸钠（pH 5.0），然后在293 K下培养。一周内出现无数小晶体[图S4(一)]. 金属丝有助于固定圆柱形LCP。在SFX测量之前，向LCP基质中添加单油酸，以吸收沉淀剂并将其均匀化至最终浓度～20%。使用两个相互连接的注射器将混合物均质化，直到其变得透明，然后通过连接到其中一个注射器的ID为400µm的针头将其装入HVC注射器的70µl样品筒中，然后在2000年进行离心分离克在没有注射器的情况下持续几十秒。

3.2. 油脂分散溶菌酶微晶的制备

如前所述，在290 K下通过分批结晶法结晶四方蛋清溶菌酶（Sugahara等。, 2015; 南戈等。, 2015 ). 含有溶菌酶微晶（2.3×10）的100µl结晶溶液⁸晶体ml⁻¹)使用台式离心机离心10 s，然后去除90µl上清液。根据之前报告的程序（Sugahara），将浓缩微晶与90µl Super Lube核级润滑脂（编号42150，Synco Chemical Co.）混合在塑料板上等。, 2015). 使用抹刀将晶体直接转移到200µl样品盒中。在装载样品后，对滤筒进行离心以去除混合物中的气泡，然后将滤筒设置到HVC注射器主体中。

3.3. SFX数据采集

数据收集于SACLA（石川）的BL3等。, 2012; 托诺等。, 2013 )使用7.0 keV X射线脉冲持续时间小于10 fs，重复频率为30 Hz。XFEL光束聚焦于1.5µm FWHM的光束直径，带有两个Kirkpatrick–Baez几何形状的椭圆镜。样品位置的X射线光子数为～2×10¹¹ A的每脉冲光子数_2安培AR晶体。对于溶菌酶晶体，光束被衰减到约6×10¹⁰ 每个脉冲的光子数，以避免探测器饱和。HVC注射器安装在DAPHNIS装置（Tono）的He-gas填充衍射室中等。, 2015). 尽管试验箱温度相对较高（299–300 K），但使用注射器的冷却套将样品保持在293 K。抽吸装置位于注射器的正下方。由抽吸装置吸入的氦气从真空泵的排气管返回腔室。使用带有八个传感器模块（Kameshima）的多端口CCD探测器记录衍射图案等。, 2014 )样品到探测器的距离为50 mm.a_2安培以0.24µl min的流速挤出LCP基质中的AR晶体（20×3×3µm）⁻¹以0.42µl min的流速从75µm ID的喷嘴中喷射出嵌入油脂的溶菌酶晶体（大小约为5µm）⁻¹ID为100µm的喷嘴。

3.4. 数据处理和结构确定

使用猎豹软件包（Barty等。, 2014 )修改后用于SACLA（Nakane，Joti）的SFX数据处理等。, 2016 ). 击中图像被定义为包含至少20个布拉格峰的图像。探测器的几何形状由地质学家在里面CrystFEL公司（版本0.6.3；白色等。, 2013 , 2016 ); 使用执行自动索引和集成CrystFEL公司和DirAx公司（杜伊斯伯格，1992年 ). 假设A的分辨率截止值为2.25°_2安培CC中溶菌酶的AR和2.0º_1/2和R（右）_分裂.

这个结构测定第页，共页_2安培AR由执行分子置换使用程序MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，2010年 )，是CCP4型软件包，使用A_2安培AR结构（PDB ID4eiy公司; 线路接口单元等。, 2012)作为搜索模型。溶菌酶结构由刚体求解精炼使用5转（苏加哈拉等。, 2017)使用凤凰套房（亚当斯等。, 2002 ). 所有优化均使用菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012 )然后手动检查和重建中的精确坐标库特（埃姆斯利等。, 2010 )，这导致R（右）_工作/R（右）_自由的=18.3/21.8（A_2安培AR）和R（右）_工作/R（右）_自由的=15.9/20.2（溶菌酶）。数据收集和细化统计总结见表1.图4是使用创建的PyMOL公司（德拉诺科学公司；https://www.pymol.org).

表1
结晶统计

括号中的值是最高分辨率外壳的值。

	A类_2安培邮编：41385	溶菌酶
数据收集
承运人	单油酸混合物	润滑油
分辨率范围（Ω）	44.90–2.25 (2.29–2.25)	39.6–2.00（2.03–2.00）
“空间”组	C类222₁	P（P）4_三2₁2
单位-细胞参数
一(Å)	40.2	79.1
b条(Å)	179.6	79.1
c（c）(Å)	142.1	38
收集的图像数量	190 041	94 061
点击次数	10 816	40 962
索引图像的数量	10 510	28 779
点击次数索引率（%）	97.2	43.5
总反射次数	3 487 348	5 059 907
独特反射次数	25 057	8615
完整性（%）	100 (100)	100 (100)
多重性	139（71.9）	587 (82.6)
R（右）_分裂(%)†	13.8 (37.4)	5.3 (21.3)
科科斯群岛_1/2(%)	97.0 (81.1)	99.5 (90.3)
〈我/σ(我)〉	5.9 (2.5)	16.8 (4.7)

精炼
R（右）/R（右）_自由的(%)	18.3/21.8	15.9/20.2
R.m.s.与理想值的偏差
粘结长度（Ω）	0.003	0.005
结合角（°）	0.652	0.746
PDB代码	6jzh号	6jzi号

† $[R_｛\rm split｝=（1/｛2^｛1/2｝｝）\｛|{我}_{\rm偶数}-I{\rm-奇数}|}）/[{（1/2）\textstyle\sum_{hkl}|{我}_{\rm偶数}+I_{\rm-奇数}|}}]\}。]$

图4
(一)人类A的结构_2安培腺苷受体与ZM241385复合，显示2F类_o个−F类_c（c）密度（蓝色，轮廓为1.0σ). 拮抗剂ZM241385显示为带有黄色碳原子的棒状模型。41到66之间的残基显示为带有氰碳原子的棒状模型。电子密度图涵盖了残留物和ZM241385。(b条)鸡蛋白溶菌酶的结构，显示2F类_o个−F类_c（c）密度（蓝色，轮廓为1.0σ)对应于89到101之间的残基。

4.结果

A类_2安培与ZM241385络合的AR在LCP中结晶，平均尺寸为20×3×3µm[图S4(一)]. 共收集到190041个衍射图案加利福尼亚州30µl A_2安培嵌入LCP中的AR晶体，其中10816个被识别为命中图像，平均命中率为5.7%。由于晶体密度低，命中率相对较低[图S4(一)]这在LCP结晶过程中很常见。其余图像显示了来自脂类没有强衍射环（图S5）。在命中的图像中，索引了10510个图案。索引率高达97%。尽管在数据采集过程中，样品流被XFEL光束切断，但抽吸装置和同向流动的鞘层气体将样品输送至相互作用点，而没有卷起。中提供的电影S1支持信息显示了数据采集期间HVC注射器的样本流。带有冷却套的HVC注射器成功地防止了任何样品劣化，包括温度变化引起的相变引起的粘度变化，使我们能够在114分钟的数据采集期间保持几乎恒定的命中率。通常，LCP中的晶体对温度变化很敏感，这可能导致晶体溶解。此外，常压下的样品注射不需要向LCP中添加7.9 MAG或9.7 MAG，以防止由于蒸发冷却而转变为层状结晶相（Liu等。, 2014). A的结构_2安培与ZM241385复合的AR用10 510个索引图像以2.25º的分辨率求解[图4(一)].

还收集了油脂分散溶菌酶晶体（大小约为5µm）的完整数据集。共获得94 061个衍射图案加利福尼亚州40µl样品。命中率和索引率分别为43.5%和70.3%，即索引了28779个模式（表1). 由于溶菌酶晶体浓度高，命中率高[图S4(b条)]. 由于晶体密度高，多晶体的衍射图案经常记录在一张图像中，因此索引率相对较低。连续54分钟收集数据，无需喷嘴堵塞或更换样品。溶菌酶结构以2.0？的分辨率测定[图4(b条)].

5.讨论

以前曾报道过在同步辐射X射线源中使用高粘度样品的连续晶体学（博萨等。, 2015). 高粘性微流由氦鞘气体引导，并在大气压下传递到X射线束相互作用点。与抽风机相连的捕集器仅用于收集挤压样品。在XFEL实验中，强烈的X射线脉冲会在流体样品中产生冲击波（Stan等。, 2016 )干扰样品的稳定流。此外，高粘性载体介质是粘性的，一旦挤压受到干扰，就会导致喷嘴周围的卷曲。在本文所述的装置中，除了氦鞘气体外，我们还使用抽吸装置在大气压力下协助样品注入，从而在数据采集期间产生稳定的样品流。

HVC注射器已应用于其他蛋白质晶体，允许结构测定人类食欲素-2受体（Suno等。, 2018 )，甲型流感的M2质子通道（托马斯顿等。, 2017 )、细菌光敏色素（Edlund等。, 2016 )细胞色素c氧化酶（Andersson等。, 2017 )和光系统II（Suga等。, 2017). HVC注射器不仅适用于LCP和润滑脂，还适用于其他载体介质，如羟乙基纤维素（Sugahara等。, 2017; 托沙等。, 2017 ). 使用SFX实验中的注射器的成功结果总结在支持信息.

HVC注射器也已成功用于根据时间分辨SFX数据确定动态蛋白质结构（表S1；Nango等。, 2016; 菅原等。, 2017; 托沙等。, 2017). 使用HVC注射器的第一个泵-探针SFX实验是使用在SACLA的LCP中结晶的细菌视紫红质（Nango等。, 2016). 在实验中，泵浦激光被样品流散射，导致细菌视紫红质晶体中的光污染。因此，更快的样品流对于确保样品照明点之间的足够分离以避免光污染至关重要。即使在2.5µl min的高流速下，注射器也能保持稳定的样品注入⁻¹.虽然由于样品消耗量高，每小时需要更换一次或两次样品，但由于样品盒有助于样品装载，因此可以顺利进行。因此，在48小时的光束时间内进行光照射后，可以在从纳秒到毫秒的13个时间点收集来自细菌视紫红质晶体的完整数据集。

6.总结

我们的高粘度样品注入装置能够在常压下稳定挤压SFX实验中嵌入在各种载体介质中的晶体。注射器的样品贮存器是一个透明的筒，可以方便地装载样品并进行目视检查。注射器可以很容易地组装并安装在衍射室中。这意味着喷油器系统与其他XFEL/同步电子辐射设施的大气压力SFX仪器高度兼容，这些设施通常提供喷油器操作所需的部件(例如HPLC泵、真空泵、标准管道组件和调节氦气供应）。样品温度由注射器上的冷却套控制在恒定值，以避免改变样品属性。抽吸装置非常适用于稳定的样品注入以及收集样品中的废物。该注射装置已应用于多种蛋白质，实现了结构测定通过时间分辨SFX分析蛋白质的动态结构。

支持信息

3D视图

PDB参考：6jzh号;6jzi号

数据采集过程中来自HVC注射器的样本流。DOI（操作界面）：https://doi.org/10.107/S1600576719012846/te5044sup1.mp4

支持图和表。DOI（操作界面）：https://doi.org/10.1107.S1600576719012846/te5044sup2.pdf

脚注

‡现住址：英国剑桥CB2 0QH医学研究委员会分子生物学实验室。

致谢

我们感谢RIKEN SPring-8中心工程团队的成员提供技术支持。我们感谢SACLA HPC系统和Mini-K超级计算机系统的计算支持。我们感谢A.Yamashita和L.Fangjia在手稿准备方面提供的帮助。作者的贡献如下：SI、MY、EN和KT构思了这项研究；YS、RBD、EN和KT开发了这些设备；YY、CM、KTK、TF和TS制备的人A微晶_2安培腺苷受体；EN、TT和MS制备溶菌酶微晶；TN处理数据；EN和MS分析数据；TT、YY、TF、MS、TS、RT、EN和KT进行了数据收集。

资金筹措信息

经日本同步辐射研究所（JASRI）批准，XFEL实验在SACLA的BL3进行（提案编号：2014A8032、2014B8050、2015A8048、2015B8042、2016A8041、2016B8060）。SI、TS和KT感谢教育、文化、体育、科学和技术部（MEXT）的X射线自由电子激光优先战略计划提供的财政支持。SI承认日本医学研究与发展署（AMED）的支持药物发现和生命科学研究平台项目[支持创新药物发现和生物科学研究的基础（BINDS）]。

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