1.简介
基因组完整性在所有生物中至关重要。尤其是真核生物，要经历有丝分裂和减数分裂细胞周期才能增殖并产生下一代。染色体分离和DNA修复在这些过程中起着关键作用。CENP-S（MHF1）–CENP-X（MHF2）（CENP-SX）复合物（也称为MHF复合物）是一种保守的组蛋白折叠复合物，参与这些过程（Milletti等。, 2020
; Kixmoeller公司等。, 2020). 在染色体分离中，它与另一个动粒成分CENP-T–CENP-W形成复合物，形成异四聚体CENP-TWSX复合物（Nishino等。, 2012). 作为动粒机械的一部分，它在有丝分裂期间连接染色体和纺锤体微管（Kixmoeller等。, 2020). 在没有CENP-SX复合体的情况下，动粒结构变得异常，种族隔离问题变得突出（天野之弥等。, 2009). 在DNA修复过程中，CENP-SX复合体与FANCM相互作用，形成FANCM–CENP-SX复合体（Singh等。, 2010; 雁鸣声等。, 2010). FANCM是Fanconi贫血（FA）途径的核心成分，在其他蛋白质定位到DNA损伤位点（Milletti等。, 2020).
对纯化的CENP-SX复合物的生化分析表明，它形成了类似组蛋白H3/H4（Nishino）的异四聚体等。, 2012; 道等。, 2012). 它使用组蛋白折叠和CENP-S（Nishino）C末端的基本尾部与dsDNA结合等。, 2012). 有趣的是，CENP-SX复合物与DNA的结合模式表明，它形成了一个规则间隔的蛋白质-DNA复合物，并且蛋白质的数量随着DNA长度的增加而增加。有趣的是，将CENP-TW添加到CENP-SX–DNA混合物中会导致这些常规结合模式的丢失，而CENP-TWSX复合物更倾向于与～100 bp dsDNA结合。纯化的人类FANCM–CENP-SX复合物已被证明比dsDNA更倾向于与分支分子结合（Tao等。, 2012; 福克斯等。2014年). 低分辨率晶体结构人CENP-SX与26 bp dsDNA复合物的研究表明，CENP-SX利用其组蛋白折叠区和C末端基本尾部区域与dsDNA结合（Zhao等。2014年). 每个CENP-SX二聚体与单独的dsDNA双链结合，整体形状类似于分支DNA分子。然而，CENP-SX的规则间隔DNA结合和分支DNA结合机制仍不清楚。
在这里，我们使用鸡CENP-SX和FANCM-CENP-SX复合物，尝试对其与DNA的复合物进行高分辨率结构分析。我们使用不同长度的dsDNA获得了几个CENP-SX–DNA晶体，其中一些衍射分辨率为～3.2º。这些晶体可以分为两个不同的空间群，每个空间群包含多个分子非对称单元。这个空间组单位-细胞参数与报道的复杂晶体结构不同。因此，确定晶体结构应披露识别模式的详细信息。相位确定和进一步精炼CENP-SX的DNA结构目前正在进行中。
2.材料和方法
2.2. 结晶
为了形成蛋白质-DNA复合物，将蛋白质和DNA的混合物在20°C下培养60分钟。使用Natrix和Natrix 2（Hampton Research）在96-well格式结晶板中通过坐滴蒸汽扩散技术对FANCM–CENP-SX–dsDNA进行初始结晶筛选。滴液的最终体积为0.2µl，含0.1µl贮存溶液和蛋白质–DNA复合物，并在20°C的恒定温度下培养平板。初始晶体是在两种条件下获得的：Natrix条件No.12（25%MPD，20 mM（M）硫酸镁4，50米M（M）羧酸盐pH 6.0），使用31 bp DNA和Natrix 2条件29号（30%1,4-二氧六环，10 mM（M）氯化镁2，2米M（M）氯化钠2，50米M（M）MOPS pH 7.0），使用19–49 bp DNA。对于衍射分析，将1,4-二氧六环替换为30%的MPD，并使用30%的乙二醇对晶体进行冷冻保护。
使用29–31 bp DNA进行CENP-SX–dsDNA结晶。为了改善结晶，改变蛋白质和DNA的混合比例、DNA长度和悬垂结构。最佳结晶条件为20mM（M）MES–氢氧化钠pH 6.5，40%MPD，100 mM（M）氯化钠，使用20%乙二醇和15%二甲基亚砜（DMSO）进行低温保护。
表2中总结了具有改进衍射质量的CENP-SX–dsDNA晶体的生产条件.
| 方法 | 蒸汽扩散，坐滴 | 蒸汽扩散，坐滴 | | 板材类型 | CrystalQuick Greiner板，3孔，圆形 | CrystalQuick Greiner板，3孔，圆形 | | 温度（K） | 293 | 293 | | 蛋白质浓度（µM（M）) | 50（FANCM–CENP-SX五聚体） | 150（CENP-SX四聚体） | | DNA浓度（µM（M）) | 55 | 55 | | 蛋白质缓冲液成分–DNA溶液 | 10米M（M）MOPS–NaOH pH 7.0，110 mM（M）氯化钠，0.5米M（M）数字电视 | 10米M（M）Tris–HCl pH值7.5，110 mM（M）氯化钠 | | 储层溶液的组成 | 50米M（M）MOPS–NaOH pH 7.0，31%1,4-二恶烷，10 mM（M）氯化镁2，110米M（M）氯化钠 | 20米M（M）MES–NaOH pH 6.5，40%MPD，100 mM（M）氯化钠 | | 储液罐容积（µl） | 100 | 100 | | 跌落体积和比率 | 2微升（1:1） | 2微升（1:1） | | 收获溶液的组成 | 50米M（M）MOPS–NaOH pH 7.0，40%MPD，10 mM（M）氯化镁2，110米M（M）氯化钠 | — | | 防冻剂 | 50米M（M）MOPS–NaOH pH 7.0，30%MPD，10 mM（M）氯化镁2，110米M（M）氯化钠，30%乙二醇 | 20米M（M）MES–NaOH pH 6.5，40%MPD，100 mM（M）NaCl、20%乙二醇、15%二甲基亚砜 | | |
2.3. 数据收集和处理
衍射数据在光子工厂（PF）同步加速器设施（KEK）的BL-1A上收集，并用香港（HKL）-2000包（HKL Research）或XDS公司（卡布施，2010年). 数据分析使用摩尔代表来自中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011). 表3总结了数据收集和处理统计数据.
| 衍射光源 | BL-1A、PF | BL-1A、PF | | 波长（Ω） | 1.1 | 1.1 | | 探测器 | 爱格 | 爱格 | | “空间”组 | P（P）21 | C类2 | | 一,b条,c(Å) | 100, 81.6, 110 | 127, 81.5, 100 | | α,β,γ(°) | 90, 106, 90 | 90, 124, 90 | | 镶嵌度（°） | 0.095 | 0.095 | | 分辨率范围（Ω） | 44–3.6 (3.7–3.6) | 44–3.2 (3.3–3.2) | | 反射总数 | 69125 (7187) | 49154（5154） | | 独特反射次数 | 20200 (2012) | 14264 (1425) | | 完整性（%） | 98.7 (99.5) | 99.3 (99.4) | | 多重性 | 3.4 (3.6) | 3.4 (3.6) | | 〈我/σ(我)〉 | 13.0 (4.7) | 24.6 (7.2) | | R（右）合并 | 0.054 (0.23) | 0.031 (0.16) | | R（右）测量 | 0.065 (0.28) | 0.038 (0.19) | | R（右）下午。 | 0.035 (0.15) | 0.020 (0.10) | | 总体BWilson图中的因子（λ2) | 110.9 | 99.5 | | 科科斯群岛1/2 | 0.99（0.96） | 0.99 (0.98) | | 抄送* | 1 (0.99) | 1 (0.99) | | |
3.结果和讨论
鸡和人CENP-SX定期结合单个dsDNA，而人FANCM-CENP-SX更喜欢分支分子（Nishino等。, 2012; 福克斯等。2014年; 赵等。2014年). 为了更详细地比较结合模式，我们使用基于Widom 601序列的不同长度（19–97 bp）的合成dsDNA对鸡CENP-SX和FANCM–CENP-SX进行了EMSA。与之前的报告一致，CENP-SX–DNA带的数量随着DNA长度的增加而增加（图1; 西野等。, 2012). 考马斯染色证实，共有四条移位带[1（快速迁移带）至4（缓慢迁移带）]，其中包含CENP-SX或FANCM-CENP-SX。CENP-SX-DNA复合物的条带1在19bp的dsDNA中不存在，在25bp至97bp的dsDNA中开始出现微弱的条带。带2也从25 bp的双链DNA开始出现，其强度从49 bp的双序列DNA急剧增加，并在61 bp的双串DNA处达到峰值。有趣的是，波段2的强度比波段1的强度更强、更尖锐。带3与带2相似，从67 bp的dsDNA开始出现。带4只出现在97 bp的dsDNA上。FANCM–CENP-SX–DNA条带出现类似；然而，带1的强度比CENP-SX–DNA的强度更强、更尖锐。其他条带强度较低，并被涂抹。这些结果表明，在FANCM存在和不存在的情况下，CENP-SX的DNA结合模式和化学计量比不同。
![[图1]](nw5115fig1thm.gif)
| 图1
DNA结合模式(一)CENP-SX四聚体和(b条)FANCM–CENP-SX五聚体到不同长度的dsDNA。(一)CENP-SX的EMSA（1.25µM（M）)带有19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91和97 bp dsDNA（1.25µM（M）). (b条)FANCM的EMSA–CENP-SX（1.25µM（M）)具有相同的一组dsDNA（1.25µM（M）)如中所用(一). 蛋白质-DNA复合物带也相应编号。 |
为了描述这两种复合物之间DNA结合的差异，我们在dsDNA（19、25、31、37、43和49 bp）存在下进行了结晶实验。无论使用的DNA长度如何，FANCM–CENP-SX–DNA晶体在30%1,4-二氧六环的存在下出现。晶体的形状因DNA的长度而异（图2). 使用19、25和31 bp dsDNA形成矩形晶体。使用37、43和49 bp dsDNA出现针状晶体。用两种不同的方法分析晶体的含量。将DNA染色的绿色荧光染料添加到晶体滴中，导致晶体发出绿光（图3一). SDS–PAGE分析表明，晶体中含有CENP-S和CENP-X，而没有FANCM（图3b条). FANCM以薄膜状结构存在于晶体液滴的气液界面中。这种情况与之前的报告类似，其中观察到FANCM在有机溶剂和氧化条件下与CENP-SX分离（Ito&Nishino，2021). 因此，即使在DNA存在的情况下，FANCM在结晶过程中也与CENP-SX分离。使用具有相同沉淀剂的CENP-SX和DNA混合物复制CENP-SX-DNA晶体的尝试失败，结晶条件得到了优化。CENP-SX–DNA晶体在40%MPD存在下出现。
![[图2]](nw5115fig2thm.gif)
| 图2
使用不同长度的dsDNA获得的FANCM–CENP-SX–DNA复合物晶体。(一)19个基点(b条)25个基点(c)31个基点(d日)37bp(e（电子）)43个基点(（f）)49个基点。比例尺长度为0.2 mm。 |
![[图3]](nw5115fig3thm.gif)
| 图3
FANCM–CENP-SX–DNA复合晶体分析。(一)用荧光DNA染色染料分析晶体。荧光图像以灰度显示。箭头表示染色晶体。(b条)左图：通过15%SDS–PAGE对各成分进行分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。右：坐滴结晶装置示意图，显示晶体、溶液和薄膜。 |
初始晶体衍射至～7º分辨率，镶嵌性高。DNA和低温保护剂的优化提高了分辨率（图4). 数据分析表明，存在两种不同的晶体，具有不同的空间群和单位-细胞参数。这些晶体都是长方形的，根据形状无法区分。一个水晶属于空间组 P（P）21，带有单位-细胞参数一= 101,b条=84，c= 112 Å,α= 90,β= 105,γ= 90°. 另一块水晶属于空间组 C类2，带晶胞参数一= 128,b条= 81,c= 100 Å,α= 90,β= 124,γ=90°（表3). 这两种晶体的不对称单元的体积相差两倍。Matthews对这两种晶体的分析表明C类2和P（P）21晶体分别含有～80 000和～160 000 Da，计算出的马修斯系数为2.7º三 Da公司−1溶剂含量为60%。这些结果表明，多个CENP-SX异二聚体和DNA存在于非对称单元。这种情况类似于以前的低分辨率CENP-SX–DNA复合晶体结构，其中形成了几个不同的晶体，不对称单元中存在多个分子。
![[图4]](nw5115fig4thm.gif)
| 图4
X射线衍射图像P（P）21（左）和C类2（右）CENP-SX–日本光子工厂BL-1A上收集的DNA复合晶体。圆圈表示分辨率为3°。 |
为了分析CENP-SX的多个分子与晶体内DNA之间的关系，计算了自旋转函数。在这两个P（P）21和C类2个晶体，在交流电90°平面上的平面和四倍峰值（图5)观察到。这种双重对称性可能是由于CENP-SX四聚体的对称性。或者，可能存在一个双折叠对称的CENP-SX–DNA复合物，类似于所报告的复合物结构，其中CENP-SX-二聚体–dsDNA复合物通过双重对称性相关（Zhao等。2014年). 然而，对四倍峰值的解释仍然难以捉摸。EMSA分析显示，多个CENP-SX四聚体与离散长度的dsDNA结合。结构确定应该揭示识别机制的细节。模型建筑和结构精炼目前正在进行中。
![[图5]](nw5115fig5thm.gif)
| 图5
的自转功能P（P）21（顶部）和C类2（底部）CENP-SX–DNA晶体。摩尔代表用于计算。检查χ=180°和90°截面表明两种晶体中存在双重和四重对称性。 |
致谢
我们要感谢Takuji Oyama博士在晶体分析方面提供了有益的建议。我们要感谢KEK-PF同步加速器设施的工作人员在数据收集方面的帮助。同步加速器实验经光子工厂项目咨询委员会批准（提案编号：2016G180、2018G113和2020G116），并经日本同步辐射研究所（JASRI）批准在SPring-8的BL44XU进行；提案编号：2017A6737、2017B6737、2018 A6838、2018 B6838、2019A6935和2020A6535）。
资金筹措信息
本研究的资金由日本科学促进会提供（西野达也批准号16K07279和20K06512）；支持药物发现和生命科学研究的平台项目（BINDS；授予西野达也1739号）；NIG-JOINT（授予西野达也第6A2017、2A2018和85A2019号）；大阪大学蛋白质研究所合作研究项目（授予西野达也CR-17-05、CR-18-05和CR-19-05号）。
工具书类
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Zhao，Q.，Saro，D.，Sachpatzidis，A.，Singh，T.R.，Schlingman，D.，Zheng，X.-F.，Mack，A.，Tsai，M.-S.，Mochrie，S.，Regan，L.，Meetei，A.R.，Sung，P.&Xiong，Y.（2014）。国家公社。 5, 2987. 交叉参考 公共医学 谷歌学者
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