1.简介
所有生物体都需要应对活性氧（ROS）的存在，这些活性氧通过破坏细胞完整性来威胁细胞核酸，蛋白质，脂类和其他生物分子。这当然是属于生活在火山温泉中的磺藻类的嗜热嗜酸古菌的情况（布鲁克等。, 1972
)是强氧化性栖息地。此外，这些生物体的新陈代谢完全依赖于有氧呼吸，因此会产生额外过量的有毒ROS作为副产物（She等。, 2001; 陈等。, 2005). 因此，磺藻属物种中含有多种防御酶和抗氧化分子，负责ROS的解毒。尽管没有过氧化氢酶，但名为过氧化物酶类（Prxs）的抗氧化酶普遍存在于生命的所有三个领域（Schröder&Ponting，1998）; 木材等。, 2003)是ROS防御系统的重要组成部分磺藻属物种（Limauro等。, 2006). Prx蛋白减少过氧化氢和有机物过氧化物到水和相应的酒精，分别通过使用涉及催化半胱氨酸残基的硫醇依赖机制（Wood等。, 2003). 基于活性位点分析（Soito等。, 2011). 古Prx属于两个亚家族之一，BCP/PrxQ或Prx6（Soito等。, 2011)后一亚家族通常为1-Cys-Prxs，其特征为过氧化半胱氨酸残基（C对)，是唯一的氧化还原活性半胱氨酸，因此缺乏分解半胱氨酸（CR（右）)存在于2-Cys-Prxs中，并与氧化碳形成二硫键对.
磺藻属物种通常有四种不同的Prxs，最初命名为Bcp1、Bcp2、Bcp3和Bcp4（Limauro等。, 2006)，其中Bcp2属于1-Cys Prxs的Prx6亚家族，其他成员为BCP/PrxQ成员（表1; 索伊托等。, 2011). 所有四种Prxs都在索尔法塔利沙门菌（利马罗等。, 2006, 2008, 2010). 1-Cys-Prx-Prx6成员在古生菌中高度保守，在群岛S.islandicusBcp2（此处称为1-Cys SiPrx）及其来自薰衣草（ApPrx），霍里克希热球菌（PhPrx）和柯达热球菌（TkPrx）（图1). 此外，细菌、人类、，拟南芥和酵母细胞（Lee等。, 2015). 与来自BCP/PrxQ亚家族的古代2-Cys Prxs相反，例如来自磺藻属spp.，1-Cys Prxs，如TkPrx和索尔法塔利沙门菌Bcp2不是组成性表达，而是在氧化应激（Limauro等。, 2006; 李等。, 2015). 保守的N-末端半胱氨酸被证明是过氧化物C对负责H2O（运行）2解毒（利马罗等。, 2006; 李等。, 2015; 图1). 除了过氧化物酶活性外，古生物1-Cys-Prxs是兼职酶，也具有伴侣活性，从而保护蛋白质和DNA免受氧化和热应激（Limauro等。, 2006; 李等。, 2015). 对于TkPrx，已经证明两个C末端半胱氨酸负责二聚体和更高寡聚体状态之间的氧化还原依赖性转换，前者主要起过氧化物酶的作用，后者主要起分子伴侣的作用（Lee等。, 2015). 有趣的是，尽管这些C-末端半胱氨酸在所有其他古生1-Cys-Prxs中高度保守磺藻属Prx6亚家族1-Cys-Prx蛋白缺乏这两者，并且只有一个半胱氨酸，即C对（图1)从而引发人们对其低聚物状态的质疑。
| 中的名称索尔法塔利沙门菌（利马罗等。, 2006) | Prx亚家族（Soito等。, 2011) | 群岛S.islandicus15a雷亚尔 | 索尔法塔利沙门菌第2页 | 嗜酸链球菌DSM639标准 | 东京S.tokodaii应变7 | | Bcp1公司 | 业务连续性计划/PrxQ | 锡雷_0725 | SSO2071号机组 | 萨西_2227 | ST0721型 | | Bcp2公司 | Prx6系列 | 锡雷_0346 | SSO2121号机组 | — | ST2442型 | | Bcp3公司 | 业务连续性计划/PrxQ | 硅橡胶_0067 | SSO2255号 | 萨西_0058 | ST2102型 | | Bcp4公司 | 业务连续性计划/PrxQ | 硅Re_2592 | SSO2613号 | 萨西_1125 | ST1785标准 | | |
![[图1]](ow5014fig1thm.gif)
| 图1
古菌Prx6亚家族1-Cys过氧化物酶的氨基酸序列比对。S.isl公司,冰岛硫化叶菌15a雷亚尔（ADX84439.1）；S.sol公司。,硫矿硫化叶菌P2（P95895；95%序列一致性）；A.根据。,薰衣草K1（Q9Y9L0.1；61%序列同源性）；P.hor公司。,霍里克希热球菌OT3（NP_143112.1；57%序列同源性）；T.kod公司。,柯达热球菌KOD1（YP_182950.1；55%序列一致性）。（高度）保守的残基用红色表示，保守的基序用方框表示。对过氧化物酶活性重要的残留物用绿色星号表示（过氧化半胱氨酸标记为C对)，而残留物显示参与（氧化还原敏感）齐聚蛋白质的含量用蓝色星号表示。序列比对使用ClustalW公司（拉金等。, 2007)并以图形方式准备矢量绘图工具. |
ApPrx和PhPrx的结构特征（Mizohata等。, 2005; 中村等。, 2006, 2010, 2013). 相反，在磺藻属在这里，我们描述了结晶和结构测定1-Cys SiPrx的群岛S.islandicus，Bcp2的一个高度保守的同源物（95%序列同源性）索尔法塔利沙门菌.
2.材料和方法
2.1. 1-Cys-SiPrx的异源表达及纯化
的编码顺序群岛S.islandicus1-半胱氨酸SiPrx(锡雷_0346)克隆到pET-28b的NcoI和XhoI限制性位点以生成pET-28 bxSiRe_0346表达载体（表2).大肠杆菌用此质粒载体转化Rosetta细胞，并在添加60µg ml的溶原肉汤（LB）培养基中培养−1卡那霉素在310 K下。通过添加0.1 mM（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）光学密度（外径600纳米)0.7，然后在310 K下进一步孵育过夜。离心后，细胞重新悬浮在缓冲液中A类（20米M（M）纳2高功率放大器4，500米M（M）氯化钠，40米M（M）咪唑（pH 7.4），并以20%的最大振幅（750 W VibraCell声波仪，Bioblock Sciences）进行超声裂解15分钟。在15000下离心10分钟后克，将上清液加载到与缓冲液平衡的5 ml HisTrap FF柱（GE Healthcare）上A类蛋白质用线性梯度洗脱到500mM（M）在同一缓冲液中使用一个KTA FPLC系统的咪唑（GE Healthcare）。最后，对10 mM（M）Tris–HCl pH值7.5或50 mM（M）纳2高功率放大器4pH值7.4，150米M（M）NaCl，取决于下游分析。
| 源生物 | 群岛S.islandicus15a雷亚尔 | | DNA来源 | 基因组DNA | | 正向底漆 | 5′-类CCATGG公司TGAGTGAGGGAGAATTCAATTAATAG-3′ | | 反向底漆 | 5′-连铸CTCGAG公司tgtcgttttaacttctttatagtgaac-3′ | | 克隆载体 | pET-28b（诺瓦根） | | 表达式向量 | pET-28b（诺瓦根） | | 表达式宿主 | 大肠杆菌罗塞塔 | | 所产生结构的完整氨基酸序列 | MVSEGRIPLIGEKFPEMEVITTHGKIKLPDDYKGRWFVLFSHPGDFTPVCTTEFYSFSKYEEFKLNTELIGLSVDHIEWVMWIEKVNLKVEVPFPPIIADPMGNVAKRLGMIHAESSTATVRAVFIIDDKGTVRLILYYPMEIGRNIDEILRAIRALQLVDKAGVVTPANWPNNELIGKVINPAPRTIKDAKMRGQPFTYKEVKTTLEHHHHH | | |
2.2. 结晶
使用HT指数（汉普顿研究）和JCSG，通过在两个96 well板中的坐滴蒸汽扩散，对结晶条件进行筛选-加（分子尺寸）在293K下进行筛选。各种条件导致结晶，其中大部分含有MgCl2·6小时2O作为沉淀剂，PEG作为拥挤剂。通过悬滴蒸汽扩散法优化1-Cys-SiPrx的结晶条件，其中2µl蛋白质溶液（7.5 mg/ml−110米M（M）将Tris–HCl pH 7.5）与2µl储液溶液混合，并与200µl相同的储液溶液进行平衡，然后在283 K下培养。发现最佳储液溶液为10 mM（M）Tris–HCl pH值7.5，15%(w个/v（v）)聚乙二醇1500，0.1M（M）氯化镁2使用该条件，经过两周的培养后获得衍射晶体。
2.3. 数据收集、处理和结构确定
1-Cys SiPrx晶体浸没在原始储层溶液中，浓度为35%(w个/v（v）)PEG 1500用于100 K下的低温保护和液氮中的闪蒸冷却。使用PILATUS 6M探测器在法国格勒诺布尔ESRF的光束线ID29上收集衍射数据。数据集是从四种不同的晶体中获得的，但只有单晶中的数据用于结构确定。收集数据的前1500幅图像使用AutoPROC公司（冯海因等。, 2011). 由于衍射数据是各向异性的，斯塔兰尼索（搔痒等。, 2018)用于处理和缩放最终数据。椭圆分辨率截止值一*,b条*和c（c）*轴分别为3.65、2.76和2.55º。基于这些信息，选择了2.75Å的分辨率截止值。因此，球形完整性在整体和最高分辨率外壳中都很低。然而，在分辨率为3.4º的所有外壳中，完整性都超过95%。
分子替换用相位器（麦考伊等。, 2007)，包含在菲尼克斯套房（亚当斯等。, 2010)，使用来自的ApPrx结构A.秘鲁（PDB条目3a2伏; 中村等。, 2010)以61%的序列一致性作为模型。使用ApPrx单体作为搜索模型，第一轮搜索结果为非对称单元十份单体副本。初始SiPrx模型是使用自动编译（亚当斯等。, 2010)并使用库特（埃姆斯利等。, 2010).精炼使用执行菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)使用非晶体学约束和TLS精细化。结构质量分析摩尔概率（陈）等。, 2010). 考虑到N端和C端缺乏电子密度，前四个和最后两个残基没有建模，包括His标签。数据收集和细化统计总结见表3. The晶体结构已保存在蛋白质数据库（PDB）中，并带有登录代码6 q5伏。所有显示蛋白质结构的图形均使用PyMOL公司（德拉诺，2002)和UCSF奇美拉1.12（彼得森等。, 2004).
| 数据收集 | | X射线源 | ID29、ESRF | | 探测器 | 皮拉特斯6M | | 波长（Å） | 0.976 | | “空间”组 | 对212121 | | 单位-细胞参数（Ω，°） | 一= 86.8,b条= 159.1,c（c）= 189.3,α= 90.0,β= 90.0,γ= 90.0 | | 分辨率范围，球形（Ω） | 76.19–2.75 (2.86–2.75) | | 分辨率范围，椭球（Ω） | 一= 3.65,b条=2.76，c（c）= 2.55 | | R（右）合并 | 0.095 (0.957) | | 完整性，球形（%） | 74.6（33.0） | | 完整性，椭球形（%） | 94.5 (93.9) | | 总反射 | 285938 (14834) | | 独特的反射 | 51577 (2580) | | 多重性 | 5.5 (5.7) | | 〈我/σ(我)〉 | 12.7 (1.9) | | 威尔逊B类系数（Ω2) | 66.2 | | 科科斯群岛1/2 | 0.999 (0.776) | | 精炼 | | 分辨率范围（Ω） | 76.2–2.75 | | 反射次数 | 51522 (2221) | | R（右）晶体/R（右）自由的(%) | 21.3 (38.6)/22.8 (40.6) | | 蛋白质原子 | 16820 | | 水分子 | 0 | | R.m.s.d.，粘结长度（Ω） | 0.102 | | R.m.s.d.，粘结角（°） | 1.60 | | 平均B类系数（Ω2) | 62 | | Ramachandran图，残留物（%） | | 有利地区 | 93.2 | | 允许的区域 | 6.8 | | |
2.4. 尺寸排除色谱法
对于尺寸排除色谱法（SEC），将约2 mg 1-Cys Prx蛋白与0.5 mg蓝色右旋糖酐混合，并使用50 m长的ALA KTA FPLC系统（GE Healthcare）在Superdex 200色谱柱（GE HearthcareM（M）纳2高功率放大器4pH值7.4，150米M（M）NaCl作为运行缓冲液。使用以下蛋白质获得分子量标准曲线：甲状腺球蛋白（670 kDa），γ-球蛋白（158 kDa）、卵清蛋白（44 kDa。
3.结果和讨论
3.2. 溶液中1-Cys SiPrx的寡聚状态
SEC分析表明，在溶液中，1-Cys SiPrx以一个主要242 kDa物种（峰1）和一个次要506 kDa品种（峰2）的异质种群存在（图5一和5b条). 考虑到单体分子量24.7kDa，我们得出结论，1-Cys SiPrx主要以十元低聚物形式存在，对应于第四纪构造在中观察到晶体结构，并且存在一种高阶低聚物，可能是一种20亚单位蛋白质，其数量较少。在未经处理（非还原）的条件下，ApPrx、PhPrx和TkPrx也在溶液中形成十聚体低聚态（Nakamura等。, 2006, 2013; 李等。, 2015). TkPrx在还原条件下形成二聚体，而对于TkPr x和PhPrx，已经证明过氧化导致十二碳结构（Lee等。, 2015; 中村等。, 2017).
![[图5]](ow5014fig5thm.gif)
| 图5
溶液中1-Cys-SiPrx的寡聚状态以及参与寡聚的残基。(一)证券交易委员会色谱图表示对应于蓝色右旋糖酐（BD）的峰值，用于测定空隙体积V（V）0和1-Cys SiPrx峰值1和2。(b条)校准曲线用于计算1-Cys SiPrx峰的分子量。(c（c）)1-Cys-SiPrx、ApPrx和PhPrx结构的二聚体部分的叠加。对于每一个二聚体，一个单体用灰色表示，另一个用黄色（SiPrx）、蓝色（ApPr）或绿色（PhPr）表示。如图所示，参与蛋白质关键功能的残留物被着色。 |
古生1-Cys Prxs的特征是CX（X）C末端臂结构域中的DWWFC基序（Mizohata等。, 2005; 李等。, 2015; 中村等。, 2017). 这两种半胱氨酸在古生物酶中高度保守，并有助于二聚体与高阶低聚物的氧化还原依赖性结合（Lee等。, 2015; 中村等。, 2017). TkPrx的突变分析就是一个例证：当两个半胱氨酸中的一个突变为丝氨酸时，蛋白质的低聚物状态变为二聚体而不是十聚体（Lee等。, 2015). 此外，当H过度氧化时2O（运行）2在PhPrx（Nakamura等。, 2017). 可以假设，二硫键的形成将氧化应激信号转化为影响低聚物状态的细微构象变化。例外地，磺藻属1-半胱氨酸-脯氨酸缺乏这两种半胱氨酸，但仍能形成十聚体，这表明它已失去氧化还原传感功能，并且能够独立于臂域半胱氨酸形成更高的寡聚状态。
除了两个半胱氨酸残基外，所有其他有助于二聚体和更高低聚物状态（Nakamura等。, 2017)除了在对应于Lys24的位置处的残基之外：ApPrx和PhPrx在同源位置处含有缬氨酸。
总之，尽管未经处理的1-Cys SiPrx主要表现为十聚体，与其他古老的Prx6亚家族蛋白一样，但可以假设该蛋白对低聚物状态转换的氧化还原信号不太敏感，并且十聚体是主要形式。由于TkPrx的研究表明，较高的非二聚低聚物形式不仅作为过氧化物酶发挥作用，而且主要作为伴侣（Lee等。, 2015)可以假设，1-Cys-SiPrx的伴侣功能比TkPrx更专业。
资金筹措信息
BelSPO（ESA-Prodex AO-2004-070）向SS和DM提供了资金。EP实验室的研究得到了布鲁塞尔Vrije大学研究委员会（启动基金）和FWO-Vlaanderen（研究项目G021118和研究拨款1526418N）的支持。
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