1.简介
四spanins是一个四跨膜螺旋蛋白家族,在真核生物中广泛保守,有33个已鉴定的人类成员(Charrin等。, 2009). 四Spanin蛋白具有共同的结构,由四个跨膜螺旋(TM1–TM4)和两个细胞外环组成,TM1和TM2之间有一个短细胞外环(SEL),TM3和TM4之间有一个大细胞外环(LEL)(Zimmerman等。, 2016; 查林等。2014年). 大量研究表明,四spanin蛋白与其他功能蛋白相互作用,如粘附蛋白、细胞生长因子受体和细胞内支架蛋白,并组织一个“四spanin富集微域”(TEM),四spanins及其“伙伴蛋白”在细胞中形成信号平台(Hemler,2005); 亚涅斯·莫等。, 2009). 由于其多样的“伴侣蛋白”,四spanins参与了广泛的细胞功能(Hemler,2003; Levy&Shoham,2005年). 值得注意的是,由于四spanins在细胞增殖和丙型肝炎病毒(HCV)感染(Pileri等。, 1998),它们被认为是治疗癌症或防止HCV感染的药物靶点(Hemler,2014). 这个晶体结构最近报道了四spanin蛋白的CD81(Zimmerman等。, 2016)这揭示了该蛋白家族的基本结构,但还需要进一步的结构和功能研究,以阐明tetraspanin蛋白在细胞中的功能。
CD9是四spanins中最具特征的成员,在各种组织和细胞中表达(Reyes等。, 2018; 扬科维奇等。, 2015). 特别是,CD9在受精过程中起着至关重要的作用。CD9基因敲除雌性小鼠表现出由精卵融合失败引起的不育表型(宫中县等。, 2000; 勒纳乌尔等。, 2000; 卡吉等。, 2000). 尽管CD9具有生理重要性,但CD9调节细胞融合和其他信号转导途径的详细分子机制仍不清楚。为了理解这种机制,CD9的结构和基于结构的功能分析一直在等待。在本研究中,我们通过修改LEL的柔性环区域设计了CD9的各种结构,并揭示了LEL的截断有助于CD9在脂质立方相中的结晶。该方法可应用于其他四spanin蛋白,以促进对该独特蛋白家族的结构研究。
2.材料和方法
2.1、。高分子生产
这个智人CD9基因(UniProt登录P21926)被克隆到改良的pFastBac1表达载体(Invitrogen)中,该表达载体包括一个N末端His8标签、GFP标签和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位点。使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara)对编码CD9的DNA片段进行PCR扩增。将PCR产物插入载体的KpnI和EcoRI位点。CD9的五个细胞外环残基和三个C末端残基通过基于PCR的方法被删除。对于汞衍生,通过定点诱变引入半胱氨酸突变(表1).
源生物 | 智人 | DNA来源 | cDNA文库,人类乳腺(塔卡拉) | 表达式向量 | 修改的pFastBac1 | 表达式宿主 | Sf9昆虫细胞 | 所产生结构的完整氨基酸序列† | MPVKGGTKCIKYLLFGFNFI(C)FWLAGIAVLAIGLWLLRFDSQTKSIFEQETNNNSSFYTGVYILIGAGALMMLVGFCCGAVQESQCMLGLFFGFLLVIFAIIAAAIWGYSHKDEVIKEVQEFYKDTYNKTK DEPQRETLKAIHYALNCGCGVEQFISDICPKKDVLETFTVK公司SCPDAIKEVFDNKFHIIGAVVMIFGMIFSMILCCAIRR公司电动汽车 | | †截断残留物下划线。为了制备汞衍生的晶体,我们在Ile20引入了半胱氨酸残基,如括号所示。 |
使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)在Sf9细胞中表达修改后的CD9结构。CD9表达质粒转化为DH10Bac活性大肠杆菌细胞(Invitrogen)生成重组bacmid。将分离的bacmid DNA以约3×10的密度转染到50 ml的Sf9细胞中6 细胞ml−1使用FuGENE HD(Promega),在27°C下培养细胞四天。培养后,通过离心(2600克,5分钟),然后使用澄清的上清液进行后续蛋白表达。
对于蛋白质表达,在Sf-900 II培养基(Invitrogen)中培养的Sf9细胞以约3×10的密度感染6 细胞ml−1并在27°C下培养48小时。通过离心(5000)收集细胞克,12分钟),并在4°C或冰上执行以下程序。细胞在50米内重新悬浮M(M)HEPES pH 7.0,150 mM(M)含蛋白酶抑制剂的氯化钠(1.7µg ml−1抑肽酶,0.6µg ml−1亮普肽,0.5µg ml−1胃蛋白酶抑制素和1米M(M)苯甲基磺酰氟)。细胞被超声波破坏,细胞碎片被离心(4000克,10分钟)。上清液进行超离心(186000克1 h),收集膜部分并在50 m内重新悬浮M(M)HEPES pH 7.0,含150mM(M)氯化钠。
膜部分在10 m内溶解M(M)HEPES pH 7.0,150米M(M)氯化钠,1.5%(w个/v(v))n个-十二烷基-β-D类-麦芽糖苷(DDM),0.3%(w个/v(v))采用以下三个色谱步骤纯化胆固醇半琥珀酸酯(CHS)和可溶性蛋白。通过超速离心(186000)去除不溶性物质克,30分钟)。将上清液与TALON金属亲和树脂(Clontech)混合并孵育30分钟。孵育后,用7个10 m的柱体积清洗树脂M(M)HEPES pH 7.0,150 mM(M)NaCl,0.1%DDM,0.02%CHS,20米M(M)咪唑,pH 7.0。然后用三个10 m的柱体积洗脱蛋白质样品M(M)HEPES pH 7.0,150 mM(M)氯化钠、0.1%DDM、0.02%CHS、300 mM(M)咪唑,pH 7.0。将洗脱的样品与His-tagged TEV蛋白酶(内部纯化)混合,以裂解His8-GFP标签,并针对10 m进行透析M(M)HEPES pH 7.0,150 mM(M)氯化钠、0.1%DDM、0.02%CHS去除咪唑。隔夜透析后,将样品与5 ml Ni–NTA Superflow树脂(Qiagen)混合,并在4°C下培养10分钟,以去除His8-GFP标签和TEV蛋白酶。然后使用Amicon Ultra过滤器(30 kDa分子质量截止值,Millipore)对收集的流通部分进行浓缩,并通过凝胶过滤(Superdex 200 Increase 10/300 GL,GE Healthcare)在10 m内进一步纯化M(M)HEPES pH 7.0,150 mM(M)氯化钠、0.05%DDM、0.01%CHS。峰分数浓缩至约15 mg ml−1使用Amicon超滤器(分子质量截止50 kDa,Millipore)。截短的和半胱氨酸突变体使用与上述相同的程序进行纯化。
2.2. 结晶
通过将纯化的CD9样品与液化单油蛋白(Sigma)以2:3的比例混合,将其重组为脂质立方相(LCP)(w个以下为:v(v))使用双注射器混合方法的蛋白质:脂质比率(Caffrey&Cherezov,2009). 对于三明治滴结晶,将蛋白质-LCP混合物(50 nl)的等分试样分配到96孔玻璃板上,并使用Griffin LCP机器人(Art Robbins Instruments)用沉淀剂溶液(800 nl)覆盖。使用包括MemMeso(分子尺寸)在内的筛选试剂盒搜索初始结晶条件。通过改变每种成分的浓度来优化初始撞击(表2).
| 本机CD9晶体 | CD9(CD9)晶体120摄氏度 | 方法 | 脂质立方相 | 脂质立方相 | 板材类型 | 96-well塑料夹芯板 | 96-well塑料夹芯板 | 温度(K) | 293 | 293 | 蛋白质浓度(mg ml−1) | 15 | 15 | 储层溶液的组成 | 10–50米M(M)MOPS pH 6.5,32–38%PEG 200或10–50 mM(M)Tris pH 7.5,32–38%PEG 200 | 10–50米M(M)MOPS pH 6.5,36–38%PEG 200或10–100 mM(M)Tris pH值7.5,32–38%聚乙二醇200 | 共结晶化合物(与蛋白质溶液混合的最终浓度) | — | 2米M(M)氯化甲基汞 | 液滴体积(nl) | 50 | 50 | 水库容积(nl) | 800 | 800 | | |
使用MicroMounts(MiTeGen)或网格网格环(MiTeGen)收集晶体,并在液氮中进行闪蒸冷却。为了制备汞衍生物晶体,我们将CD9与氯化甲基汞共结晶。将氯化甲基汞溶解在二甲基亚砜中,并以2 m的最终浓度添加到蛋白质样品中M(M)在冰上培养20分钟后,按照上述LCP方法使样品结晶。
2.3. 数据收集和处理
所有衍射数据集均使用SPring-8(Hirata)BL32XU处的微聚焦X射线束收集等。, 2013). 通过光栅扫描和SHIKA公司(上野等。, 2016). 从单晶中收集小楔形数据集,每个数据集由5–30°组成。使用自动处理收集的数据集卡莫(山下等。, 2018). 所有数据集都是在1.000Ω的波长下收集的。从波长为1.000 Au的汞衍生物晶体中收集了异常衍射数据集。每个数据集都使用XDS公司(卡布施,2010年),然后使用数据集之间的归一化结构因子幅度的相关系数进行分层聚类分析。最后,使用XSCALE公司(卡布施,2010年). 表3总结了数据处理统计数据。一个汞原子位点被确定为SHELXD公司(谢尔德里克,2015年). 初始阶段计算如下自动共享(冯海因等。, 2007).
| 本机CD9晶体 | 汞衍生CD9晶体120摄氏度 | 衍射光源 | BL32XU,SPring-8型 | BL32XU,SP环-8 | 波长(Ω) | 1 | 1 | 温度(K) | 100 | 100 | 探测器 | 爱格X 9M | 爱格X 9M | 晶体到探测器的距离(mm) | 250 | 300 | 每张图像的旋转范围(°) | 0.1 | 0.1 | 每张图像的曝光时间(s) | 0.1 | 0.1 | 要合并的数据集数量 | 25 | 47 | 每个晶体的振动范围(°) | 10–180 | 10–180 | “空间”组 | C2221 | C2221 | 一,b条,c(c)(Å) | 45.18, 124.83, 129.23 | 45.18, 125.21, 129.40 | α,β,γ(°) | 90, 90, 90 | 90、90、90 | 分辨率范围(Ω) | 50–2.70 (2.86–2.70) | 50–3.17 (3.43–3.17) | 反射总数 | 604721 | 397058 | 独特反射次数 | 10454 | 17477 | 完整性(%) | 100.0 (100.0) | 100.0 (100.0) | 多重性 | 57.85 | 22.72 | 科科斯群岛1/2 | 0.998 (0.515) | 0.994 (0.740) | 〈我/σ(我)〉 | 15.79 (1.70) | 8.05 (1.70) | R(右)测量 | 0.526 (3.167) | 0.703 (2.651) | 总体B类Wilson图中的因子(λ2) | 48.84 | 51.34 | | |
致谢
我们感谢谷口赖亚博士在手稿准备和富有成果的讨论中提供的协助,以及日本兵库县SPring-8的BL32XU的光束线工作人员。经RIKEN批准,在SPring-8的BL23XU上进行了衍射实验(提案2015A1057、2015B2057、2016B2717和2017A2717)。
资金筹措信息
这项工作得到了对ON的MEXT特别促进研究拨款(16H06294)的支持。这项工作也得到了JSPS KAKENHI的支持(17H05000对TN的拨款)。TN由JST、PRESTO资助(授予JPMJPR14L8)。
工具书类
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国际标准编号:2053-230X
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