2.1. 生产F.有核娜娜

基因编码F.有核如前所述，NanA（FnNanA）被克隆到pET300/NT-DEST载体中（Bairy等。, 2018)并转化为大肠杆菌蛋白质表达用BL21（DE3）细胞（Novagen）（表1). 细胞培养物生长到OD_600 纳米0.6，用100诱导 µM（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。细胞生长于289岁 K代表16 h诱导后。培养物在6000℃下离心收集克用于15 277时的最小值 K、将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中[50 米M（M）Tris–HCl pH 8.0，500 米M（M）氯化钠，20 米M（M）咪唑和一片cOmplete EDTA游离蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）]。在138℃时，通过细胞分裂器（恒定系统）三次传代将细胞溶解 兆帕。细胞裂解物在18℃离心 000克对于35 min以清除细胞碎片和未溶解的细胞。

上清液被加载到5 ml HisTrap FF柱（GE Healthcare）与缓冲液平衡A类(50 米M（M）HEPES pH值7.4，20 米M（M）咪唑，500 米M（M）氯化钠，6%甘油，10 米M（M） β-巯基乙醇）。用4和6%缓冲液的梯度洗脱未结合细菌蛋白B类(50 米M（M）HEPES pH值7.4500 米M（M）咪唑，500 米M（M）氯化钠、6%甘油、10 米M（M） β-巯基乙醇）。使用6–100%缓冲液的线性梯度洗脱所需蛋白质B类.通过SDS-PAGE分析馏分以检查其纯度。阳离子交换前色谱法，蛋白质与50进行缓冲交换 米M（M）HEPES pH 6.8，10 米M（M）氯化钠、6%甘油、10 米M（M） β-使用Amicon超离心过滤器（10 000分子量截止；Millipore）。蛋白质被装载到阳离子交换器(5 ml HiTrap SP FF柱；通用电气医疗集团（GE Healthcare）使用相同的缓冲区进行平衡。

蛋白质在Superdex 200 10/300 GL分析柱上进一步纯化 米M（M）HEPES pH 7.4，50 米M（M）氯化钠，10 米M（M） β-巯基乙醇。用12%SDS-PAGE分析FnAnA的纯度。将纯度最高的峰分数合并，然后使用Amicon超离心过滤器（10 000分子量截止；Millipore）用于结晶试验。所有蛋白质纯化步骤均在277进行 K、使用Bradford试验（Bio-Rad）以牛血清白蛋白作为蛋白质标准测定蛋白质浓度。每个样品的吸光度测量值为595 nm，使用Ultrospec 2100亲紫外可见分光光度计（GE Healthcare）。纯化蛋白的分子量为～35 kDa使用质谱法，匹配翻译的His的计算质量₆-标记蛋白（34.9 kDa；数据未显示）。

2.2. 结晶

纯化FnAnA浓缩至10 毫克 毫升⁻¹在50 米M（M）HEPES pH 7.4，50 米M（M）氯化钠，10 米M（M） β-结晶装置用巯基乙醇。使用来自Rigaku试剂公司（Wizard 1和2）、Hampton Research公司（PEG/Ion、PEG/Ion 2、Crystal Screen和Crystal Screen 2）和Qiagen公司（The Classics和Classics II Suites）的商用稀疏矩阵结晶筛，使用蚊子纳米石粒分散机器人（TTP Labtech）进行了初步挂滴结晶试验。结晶液滴由350个组成 nl蛋白溶液和350 nl储层溶液。一些商业屏幕条件在277和291产生了小晶体 K.对这些初始撞击进行了优化，以获得衍射质量的晶体。对于FnNanA与丙酮酸钠的结晶，将10倍摩尔过量的丙酮酸纳与10 毫克 毫升⁻¹(0.28 米M（M）)蛋白质，孵育30 结晶设置前的min。7–8天后获得晶体 d（图2一). 所有晶体均采用20%的低温保护(v（v）/v（v）)储层溶液中的乙二醇。晶体在衍射数据采集之前在液氮中闪蒸冷却。结晶信息汇总在表2中.

图2 晶体和衍射图案。(一)一种典型的无配体FnAnA晶体。(b条)无配体FnAnA晶体的X射线衍射图显示衍射到2.32 奥分辨率。

2.3. 数据收集和处理

X射线衍射数据是从法国格勒诺布尔欧洲同步辐射设施（ESRF）光束线ID23上的无配体FnNanA单晶中收集的，波长为0.9789 Å。在ESRF的束线ID30上以0.9762的波长收集了带有丙酮酸席夫碱的配体结合FnAnA的X射线数据 Å。衍射数据采集在100 英国。

衍射数据被索引并使用XDS公司（卡布施，2010年). 通过以下方式实现了数据缩减和缩放漫无目的的（Evans&Murshudov，2013年)来自中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011). 使用phenix.x分类来自菲尼克斯套件（Zwart等。, 2005; 亚当斯等。, 2010). 对分子数的估计非对称单元是使用获得的MATTHEWS_COEF公司来自中央对手方清算所4套房（马修斯，1968年; Kantardjieff&Rupp，2003年). 表3中给出了数据收集和处理统计信息的摘要.

2.4. 结构解决和细化

单体多杀性巴氏杆菌NanA（PDB入口4imc公司; 休恩（Huynh）等。, 2013)它与FnAnA的序列同源性为73%，被用作分子置换具有相位器（麦考伊等。, 2007)在中菲尼克斯含有丙酮酸席夫碱的无配体FnNanA和结合配体的FnAnA套件。这个菲尼克斯汽车程序（Terwilliger等。, 2008)用于初始模型构建。结构精炼使用执行菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012). 使用以下交替循环对地图和模型进行迭代改进精炼和残留物分析库特（埃姆斯利等。, 2010). 添加了水和配体分子通过Coot并手动建模为电子密度。表4总结了所有结构再细化统计数据.

2.5. 基于结构线形的序列比较

这个T-Coffee Expresso咖啡服务器（Armougom等。, 2006)用于对四个已知的N个-乙酰神经氨酸裂解酶结构，并用电子脚本3（Robert&Gouet，2014）). 的序列标识N个-乙酰神经氨酸裂解酶流感嗜血杆菌（PDB条目第1f7b页; 巴博萨等。, 2000),多杀性P（PDB条目4百万美元; 休恩（Huynh）等。, 2013),金黄色葡萄球菌（PDB条目5a8克; 斯托克韦尔等。, 2016)和大肠杆菌（PDB条目1最后; 伊扎德等。, 1994)分别为74、72、57和36%。

2.6. 酶分析

N个-乙酰神经氨酸裂解酶的活性通过使用标准耦合分析定量丙酮酸的产生量进行评估（朱等。, 2010). 卵裂释放的丙酮酸N个-在磷酸盐存在下，乙酰神经氨酸被丙酮酸氧化酶氧化（P_我)和氧气生成乙酰磷酸，CO₂和H₂O（运行）₂用辣根过氧化物（HRP）催化荧光探针与H₂O（运行）₂产生的H₂O（运行）₂然后使用荧光底物（Sugahara等。1980年).

3.1. 结构确定

无配体FnAnA的结构被精炼为2.32 奥分辨率。该结构有0.35%的Ramachandran异常值。在无配体FnAnA的每个单体中，保守的Ser79残基位于Ramachandran图的不允许区域。然而，Ser79的电子密度是明确定义的。

含丙酮酸席夫碱中间体的配体结合FnAnA晶体属于空间组 P（P）2₁2₁2并衍射至1.76 奥分辨率。所鉴定的两个单体似乎形成了一个四聚体，与其他物种唾液酸醛缩酶中的单体排列类似。该结构有0.17%的Ramachandran异常值。链的一个残基Lys267B类，存在于不允许的区域中；这个残基的电子密度还没有很好的定义。除链的Tyr108和Lys109外，所有残基均被建模为电子密度B类含丙酮酸席夫碱的配体结合FnAnA和所有单体N末端的残基。

3.2、。的总体结构N个-乙酰神经氨酸裂解酶

FnAnA的单体结构表明该酶采用了经典的TIM(β/α)₈-桶状三级结构褶皱（图3一). 除了组成TIM桶的八条螺旋线外，FnNanA还有三条额外的螺旋线α-C端的螺旋线（I、J和K）（图3一). 来自流感嗜血杆菌（巴博萨等。, 2000)和多杀性P（休恩等。, 2013)还有这三条额外的螺旋线。我们比较了无配体FnNanA和带丙酮酸席夫碱的配体结合FnAnA的结构。具有丙酮酸Schiff碱的配体结合的FnAnA的总体结构与不含配体的FnAnA的总体结构相似。丙酮酸结合后，FnAnA没有发生重大结构变化。无配体FnAnA中的所有四个亚基在结构上相似，并且重叠的均方根偏差（r.m.s.d.）在0.127和0.169之间 290℃时为α原子。与丙酮酸结合的FnAnA单体与r.m.s.d.0.836重叠 从同一不对称单元到单体。

图3 The overall crystal structure ofN个-乙酰神经氨酸裂解酶F.有核. (一)FnNanA的卡通表示，带有单独着色的二级结构。二级结构元素按顺序标记（小写字母对应于β-股和大写字母对应于α-螺旋线）。活性位点中的Lys161–丙酮酸席夫碱中间体显示为带有黄色C原子的棒状物。(b条)三级构造FnAnA的（四聚体），每个亚基以不同的颜色显示在动画演示中。这些数字是使用PyMOL公司分子颗粒系统（DeLano，2002).

C类α链原子A类无配体的N个-乙酰神经氨酸裂解酶F.有核,流感嗜血杆菌（PDB条目1f5赫兹; 巴博萨等。, 2000)和多杀性P（PDB条目4imc公司; 休恩（Huynh）等。, 2013)与1.12和1.14的r.m.s.d.s叠加 分别为：。C类α链的原子A类配体结合的N个-来自F.有核,多杀性P（PDB条目4毫米; 休恩（Huynh）等。, 2013)和金黄色葡萄球菌（PDB条目4小时7分; 提姆斯等。, 2013)与0.54和0.78的r.m.s.d.s叠加 分别为：。这个第四纪构造的N个-乙酰神经氨酸裂解酶（PDB入口5兹金)分析并组装成四聚体（图3b条)使用国际学生成绩评估服务器（Krissinel&Henrick，2007）). 所有四种晶体学上独立的单体都非常相似。可溶性蛋白质的小角度X射线散射数据也证实该蛋白质是四聚体（数据未显示）。

链中含有丙酮酸席夫碱的配体结合FnAnA的电子密度图A类清楚地表明N∊Lys161的原子作为希夫碱与丙酮酸的C2原子共轭。丙酮酸的羧酸基团与Ser44的主链N原子和Thr45的羟基形成氢键。此外，Tyr133侧链与Ser44的羟基和保守水分子形成氢键（图4). Tyr133几乎与席夫碱中间体平行，并参与席夫碱反应的氢键。原子坐标已提交给蛋白质数据库（PDB），无配体FnNanA和含丙酮酸席夫碱的配体结合FnAnA的PDB代码如下5兹金和5兹卡分别是。

图4 Lys161与丙酮酸形成的希夫碱的电子密度图。显示丙酮酸烯胺与酶相互作用的复合物。丙酮酸与Lys161共价连接，并与Ser44和Thr45形成氢键。图中还显示了Tyr133的氢键网络和一个保守的水分子。灰色网格表示的电子密度在1σ水平，显示丙酮酸C2原子和N之间的连续密度∊Lys161的原子。此图是使用PyMOL公司分子颗粒系统（DeLano，2002).

3.3. 基于结构比对的序列比较

FnAnA和四个已知序列的基于结构的序列比对N个-乙酰神经氨酸裂解酶的结构是用T-Coffee Expresso咖啡服务器（图5一; 装甲兵等。, 2006). 序列比对表明FnAnA包含保守的催化位点（Lys161和Tyr133）和保守的特异性底物（Neu5Ac）结合基序GXX年GE（巴博萨等。, 2000; 季等。, 2015; 加西亚加西亚等。, 2012). GXX年GE基序位于位置43和47之间（FnAnA编号），参与基底识别XX年残基通常是S和/或T。除此之外，一组氨基酸（Asp187、Glu188和Ser204）也参与结合碳水化合物部分。

图5 基于结构的对齐F.有核 N个-乙酰神经氨酸裂解酶（FnNAL）N个-已知结构的乙酰神经氨酸裂解酶（NAL）。(一)序列标识N个-乙酰神经氨酸裂解酶流感嗜血杆菌（HiNAL；PDB条目第1f7b页; 巴博萨等。, 2000),多杀性假单胞菌（PmNAL；PDB条目4毫米; 休恩（Huynh）等。, 2013),金黄色葡萄球菌（SaNAL；PDB条目5a8克; 斯托克韦尔等。, 2016)和大肠杆菌（EcNAL；PDB条目1最后; 伊扎德等。, 1994)分别为74、72、57和36%。结构线形使用T-Coffee Expresso咖啡服务器（Armougom等。, 2006)这个图形是用电子脚本3（Robert&Gouet，2014）). NAL酶中严格保守的残基显示在红色背景上。FnNanA的二级结构如上图所示；螺旋表示螺旋，箭头表示β-股。活性位点中的残基用黑色小三角形标记。(b条)动力学分析F.有核 N个-乙酰神经氨酸裂解酶与Neu5Ac。将数据拟合到Michaelis–Menten方程R（右）2值为0.99。

3.4. 酶分析

将数据拟合到Michaelis–Menten动力学模型（图5b条). 迈克利斯·曼滕常数(K（K）_米)结果为6.0±0.6 米M（M）,V（V）_最大值计算为0.090±0.003 毫摩尔 最小值⁻¹和k_猫确定为12.5±0.5 秒⁻¹与相关NanA酶的Michaelis–Menten动力学常数的比较表明，该酶的动力学特性（两者都是k_猫和K（K）_米)与文献中的报道非常相似（内田等。, 1984; 北方等。, 2016; 表5). 我们报告了N个-乙酰神经氨酸裂解酶F.有核.

表5 FnAnA的动力学参数和先前的特征N个-乙酰神经氨酸裂解酶大肠杆菌（EcNanA），多杀性P（PmNanA）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NanA） 酶 K（K）米（米M（M）) k猫（秒）−1) k猫/K（K）米（秒）−1 米M（M）−1) FnAnA公司† 6.0 ± 0.6 12.5 ± 0.5 2.1 EcNanA公司‡ 2.5 ± 0.3 10 ± 0.4 4 PmNanA公司‡ 4.9 ± 0.7 16 ± 1 三 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NanA§ 3.2 ± 0.1 22 ± 0.1 6.9 †当前研究。 数据取自Uchida等。(1984). §数据来自北方等。(2016).