2.1. 大分子生产

原件rtgh124型-含有质粒的质粒由哈里·吉尔伯特教授的实验室提供（布莱斯等。, 2011). 这个克隆缺乏dockerin结构域，但在N末端表达了23个额外的残基，包括一个不可清除的His标记。该基因采用非连接克隆技术在含有His标签（6×His）和3C蛋白酶的改良pET-28a质粒上亚克隆识别站点在N终点。因此，新的克隆是His-3C-卢比GH124（见表1). 裂解序列在卢比GH124蛋白（Gly-Pro-Ala）。此外，我们还应用了UniProt编号（A3DCJ4），其中包括dockerin结构域的前130个氨基酸。因此，该结构的编号与Brás报告的顺序不同等。(2011)精确到107个残留物。称职大肠杆菌用重组质粒对BL21（DE3）pLysS细胞进行热休克转化，以生产蛋白。将发酵剂培养物培养在300 ml Luria–Bertani（LB）肉汤中，加入30µg ml⁻¹卡那霉素和35µg ml⁻¹37°C和180转/分时的氯霉素⁻¹一夜之间。将其用作接种物，通过添加1 mM（M）异丙基β-D类-将1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）与3 l LB混合，在相同的抗生素、温度和摇动速度下放置16 h。在5000℃下离心收集细胞克将颗粒重新悬浮在100 ml缓冲液中15分钟A类（50米M（M）Tris pH值7.5300 mM（M）氯化钠，20米M（M）咪唑），并添加一片无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）。然后在Soniprep 150 Plus超声仪（MSE）中使用60/90s开/关脉冲的五个循环在冰浴中对细胞悬浮液进行超声处理。将50 ml样品与3µl苯甲酸酶（圣克鲁斯生物技术）在室温下培养20分钟，然后离心（6000克，20分钟），并过滤上清液（45µm）。将滤液涂在缓冲液中预先平衡的5 ml HisTrap柱（GE Healthcare）上A类.以500 m的梯度洗脱蛋白质M（M）咪唑在相同的缓冲液中，并使用30kDa Vivaspin 20过滤单元（Sartorius）交换缓冲液。将低盐和低咪唑样品与1:20比例的His-tagged 3C蛋白酶在20°C下以最小摇摆/旋转速度孵育18 h。然后将样品应用于第二个5 ml HisTrap柱上（在同一缓冲液中）。然后使用10kDa Vivaspin 20过滤装置对从流通中汇集的裂解蛋白质进行缓冲交换和浓缩。50 m内最终体积为2 ml蛋白质M（M）Tris pH 7.5与过量的乙二胺四乙酸（EDTA；5 mM（M）)在4°C下放置18小时，目的是螯合样品中的任何残留金属。最后，样品通过Superdex 75 16/60凝胶过滤柱（GE Healthcare）进行过滤，该过滤柱之前与20 m的脱金属缓冲液进行了平衡M（M）Tris pH值7.5，150 mM（M）氯化钠。使用10 kDa Vivaspin 0.5过滤装置将洗脱的蛋白质混合并浓缩。蛋白质纯度通过12.5%SDS-PAGE确认。

表1 大分子生产信息 源生物 R.热电偶 DNA来源 布拉斯等。(2011) 正向底漆 CTGTTCCAGGACCACACCTGCAATATACACATCC（中国交通运输总公司） 反向底漆 GGAGATTTACTATATCACATATGCTAGC公司 克隆载体 第28a页 表达式向量 含有3C蛋白酶位点的改性pET-28a 表达式宿主 大肠杆菌BL21（DE3）肽 所产生结构的完整氨基酸序列† HHHH小时不锈钢LEVLFQGPA水平食品安全委员会 †组氨酸标签为粗体。3C蛋白酶识别位点下划线（在Q和G之间发生裂解）。3C切割后，残基GPA保留在N-末端，在卢比GH124序列。

2.2. 结晶

根据Brás报告的条件，为晶体生长设计了一个优化屏幕等。(2011)，PEG 3350（16-26%）和Tacsimate缓冲液pH 5.0（6-12%；Hampton Research）的梯度。任意2 mM（M）将金属盐[氯化铁（II）、醋酸锰（II），氯化镍（II）或氯化钙或氯化铜（II）]或同等体积的缓冲液（无金属）添加到每个屏幕上。40 mg ml时的蛋白质⁻¹用6.7米培养M（M）纤维三糖（G3；巨酶）或纤维六糖（G6；巨酶；该底物经三维分析显示被污染，因此称为G5F，见下文）M（M）在安装水晶板之前，将pH值控制在7.5，持续18小时。3天后，晶体在20°C下生长，主要以团簇的形式生长。从几种条件下收集到大小合理的晶体（～100 nm），并在液氮中用2 m的溶液进行低温保护后闪蒸冷却M（M）金属盐和2%的塔西咪酯和PEG 3350浓度(v（v）/v（v）)和1%(w个/v（v）)分别高于母液中的含量（见表2). 带有配体G3和G5F的两个代表性结构已用PDB码沉积6克1克和6g1i公司和分别用于本文的报告和图表中。

β-1,4-连接的Glc-Fru是按照先前文献中描述的条件合成的（Hicks等。, 1983). Glc-Glc-Fru是通过将Glc-Fur喂入农杆菌属服务提供商。β-葡萄糖苷酶衍生糖合酶Abg2F6（基本上如Kim所述等。, 2004)在以下人员在场的情况下α-葡萄糖基氟化物(α-GlcF）。共结晶中包括Glc-Fru和Glc-Glc-Fur，但在这些条件下没有晶体生长。

2.3. 数据收集和处理

衍射数据（表3)在英国牛津郡钻石光源（DLS）的光束线I02上采集。一般来说，数据集是在0.979º的波长下收集的。X射线荧光采集了晶体的（XRF）光谱就地在数据收集过程中，确认低温回路中金属的存在和性质。数据集被自动编入索引并与集成XDS公司（卡布施，2010年)和缩放比例漫无目的的使用夏2（2010年冬季)在DLS。

2.4. 结构解决和细化

XRF数据用PyMCA公司软件（Solé等。, 2007). 使用中央对手方清算所4我2 GUI（波特顿等。, 2018; 表4). Brás报告的原始结构等。(2011)最初被截断为雕塑家（Bunkóczi&Read，2011年)并用作模型分子置换具有MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年). 通过几个循环对结构进行了改进REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)和库特（埃姆斯利等。, 2010). 结构通常使用以下几种工具进行验证库特和欧洲蛋白质数据库（PDBe；https://www.ebi.ac.uk/pdbe)验证工具。糖的有效成分为私人经营者（阿吉雷等。, 2015)金属正确性用检查我的金属（CMM）金属绑定站点验证服务器（Zheng等。, 2014, 2017). 结构图是用中央对手方清算所4毫克（麦克尼古拉斯等。, 2011).

2.5. 差示扫描荧光法

每个样品的两个复制品在0.2 ml薄壁管（Axygen）中制备，其中2 mg ml⁻¹(86 µM（M）)纯金属无卢比50 m深处的GH124蛋白质M（M）Tris pH值7.5，150 mM（M）NaCl缓冲液（也尝试了其他缓冲液和pH值，结果类似）。共有8个样品（加上复制品）仅用蛋白质进行测试，1 mM（M）EDTA或一种等效物（86µM（M）)金属盐：氯化铁（II）、醋酸锰（II），氯化镍（II）和氯化钙或氯化铜（II）。将样品（15µl）与1000×荧光染料SYPRO Orange（Sigma–Aldrich）以1:1的比例混合（最终体积30µl）。使用安捷伦MX3000P QPCR机器进行测量。从25℃到96℃，每隔30 s将温度升高1℃，并分别用517 nm和585 nm的激发和发射波长测量荧光。

2.6. 电喷雾（ESI-MS）

通过电喷雾离子化测试蛋白质质谱法（ESI-MS）观察金属对His264修改的可能影响。简而言之，200µM（M） 卢比GH124样品预孵育0.5 mM（M）EDTA，200µM（M）金属盐[氯化铜（II）、氯化铁（II），醋酸锰（II）或氯化镍（II）]或预螯合50m内无金属M（M）pH 5.8的醋酸铵缓冲液。该实验在Waters LCT Premier XE系统上进行MassLynx公司4.1软件。用甲酸钠溶液校准系统，用马心肌红蛋白（16951.5±1.5Da）验证和校正校准。将样品直接稀释到乙腈-水-甲酸中（50:50:0.1）。在200-2000扫描范围内收集3分钟的数据米/z（z）将扫描结果合并，并减去基线。中的数据米/z（z）然后使用Maxent1程序在适当的范围内处理包含峰值序列的范围质量范围根据原始数据确定合适的峰半宽设置。

2.7. 蛋白质水解和质谱

为了根据经验确定氧化残基的位置卢比GH124的分析依据为液相色谱法和串联质谱法（LC-MS/MS）。25微克卢比GH124在12.5%SDS–PAGE凝胶上运行。凝胶在一个干净的盒子里用SimpleBlue SafeStain（Invitrogen）染色，并剪下合适的带。在用二硫赤藓醇和S公司-用碘乙酰胺进行氨基甲酰化。将肽混合物加载到配有纳米Acquity Symmetry C18 5µm捕集柱（180µm×20 mm，Waters）和纳米Acquite HSS T3 1.8µm C18的纳米Acquity-UPLC系统（Waters毛细管柱（75µm×250 mm，Waters）。捕集器清洗溶剂为0.1%(v（v）/v（v）)甲酸水溶液，捕集流速为10µl min⁻¹.在将流量切换至毛细管柱。分离使用了梯度洗脱两种溶剂[溶剂A类，含水0.1%(v（v）/v（v）)甲酸；溶剂B类，乙腈含量0.1%(v（v）/v（v）)甲酸]。这个毛细管柱流速为350 nl min⁻¹柱温度为60°C（与类似的柱不同，我们能够在60°C下运行nanoAcquity HSS T3 1.8µm C18毛细管柱，这提高了传质速率，从而提高了分辨率，还降低了系统中的背压，使流速略有增加）。梯度分布为线性2–35%溶剂B类超过20分钟。然后，用95%的溶剂进行清洗B类2.5分钟。在随后的注射之前，将色谱柱恢复到初始条件并重新平衡25分钟。纳米LC系统与maXis HD LC-MS/MS系统（Bruker Daltonics）和CaptiveSpray电离源（Bruker-Daltonics）相连。使用AutoMSMS模式获得正ESI-MS和MS/MS光谱。使用指南针1.7软件(microTOF控制,海斯塔和数据分析程序（Bruker Daltonics）。碰撞能量和隔离宽度设置使用AutoMSMS碎片表自动计算，绝对阈值为200个计数，首选电荷状态为2-4，排除单电荷离子。每个前体都获得了一个单一的MS/MS光谱，之前的目标离子被排除0.8分钟，除非前体强度增加四倍。使用本地运行的吉祥物通过Bruker的项目（v.2.5.1；矩阵科学）蛋白质Scape接口（v.2.1）。结果被筛选为仅接受肽类预期得分为0.05或更低。通过人工验证产物离子光谱与预测的b序列离子和y序列离子的对比，确认了氧化组氨酸的鉴定。

2.8. 等温滴定量热法

380µl纯预螯合物卢比GH124蛋白质（60µM（M）)用600µ滴定M（M）金属盐[氯化铜（II）、氯化铁（II），醋酸锰（II）或氯化镍（II）]以1µl的间隔注入180 s。细胞和注射器样品中使用的缓冲液为50 mM（M）乙酸钠pH值5.0。在MicroCal Auto-ITC上进行滴定₂₀₀（GE Healthcare）在25°C和750转/分时⁻¹搅拌速度。使用原产地从原始数据中减去7个软件（OriginLab）和空白。

2.9. 葡萄糖和果糖检测方法

通过高压阴离子交换检测商业糖色谱法（HPAEC）和脉冲安培检测，并在Carbopac PA1保护和分析柱上分离。20 m等色谱洗脱M（M）氢氧化钠作用30min，然后在100m内以60%的醋酸钠线性梯度M（M）用氢氧化钠60分钟以上分离糖。使用糖类标准四波形检测糖类，以便在金电极上进行电化学检测工作电极Ag/AgCl pH值参考电极。Megazyme的葡萄糖/甘露糖/果糖检测试剂盒也用于检测葡萄糖和果糖的相对量。这是一个连接的检测试剂盒，检测与NADH检测以1:1连接的适当单糖A类_340纳米使用6230的消光系数M（M）⁻¹ 厘米⁻¹.

3.1. 金属对热稳定性的影响

为了提供金属结合的初步指示卢比通过差示扫描荧光法研究GH124（图2). 两种对照（蛋白质和蛋白质+EDTA）在72°C时都显示出熔融转变。添加Ca²⁺没有改变熔化温度，这表明在pH5和7.5之间的任何pH值下，这种金属可能不会与蛋白质结合，因此暗示这种金属在原始沉积中的分配可能会产生误导。相反卢比当测试铜、镍、锰或铁等过渡金属时，GH124偏移+2–3°C。在其他缓冲液和其他pH值（数据未显示）下也出现了类似行为。

图2 差分扫描荧光法表示为归一化荧光随温度的变化。将仅含蛋白质（GH124）和EDTA的对照品与每种金属含有一个当量的样品进行比较，即钙、铜、铁、锰或镍。对照组和含钙样品在～72°C时显示出最大荧光。在过渡金属存在的情况下，熔化温度变为74–75°C。

3.2. 等温滴定量热法

为了进一步研究卢比进行了GH124和金属、ITC试验。图3描述了pH值为5时的锰结合等温线，作为其他测试金属的代表.反应是放热的（铜除外²⁺吸热）和钙²⁺无结合（在pH 5至pH 7的测试范围内；见表5)，与荧光测定结果一致。低化学计量(N个金属结合上的≃0.5）可能反映了金属配位组氨酸的部分修饰（下文讨论）。

图3 典型的ITC实验：用卢比GH124。上部面板显示原始绑定热量和基线（红色）。下部面板显示了校正后的集成热量，以及与单站点绑定模型的匹配（红线）。

3.3. 的三维结构卢比加纳124

正如Brás在开创性出版物中最初描述的那样等。(2011),卢比GH124由七个α-围绕八分之一的螺旋（图4一)其中含有催化酸Glu203（Brás中的Glu96等。, 2011). 金属离子现场（图4c（c）)距离催化区较远，因此在存在不同金属的情况下，未观察到对水解活性的影响（数据未显示）。锰由Asp141、Gln172、Glu175、His176、His264和一个水分子协调。在一些含有其他金属的结构中，水的占有率很低或不存在，而Glu175通常是双构象，只有一个位置与金属相协调。其原因尚不清楚：这可能反映了pH值（5-6）、部分金属占用或组氨酸修饰。如上所述卢比GH124（1.40–0.94 Au）揭示了对His264（Brás中的His157）C2的明确修改等。, 2011). 在锰的情况下，金属和His264改性都分别显示出0.7和0.3的部分占有率。在类似条件下，其他金属的占用值相似，组氨酸修饰的占用值从0到0.5不等，金属的占用率从0到0.8不等。X射线荧光光谱被证明是一种强大但很少得出结论的工具：通常在每个样品中发现几种金属，以及在结晶条件下添加的一种金属，镍作为一种常见金属出现在所有光谱中。这些污染物可能来自结晶条件下使用的净化步骤或缓冲液。在锰的情况下，这似乎是样品中的主要金属，只有一些残余镍（图4b条). 值得注意的是，这项技术揭示了冷冻回路中存在哪些金属，而不仅仅是金属离子位点中存在什么。

图4 的三维结构卢比GH124和金属离子现场。(一)一般彩虹视图卢比GH124（PDB条目6克1克)从红色（N-末端）到蓝色（C-末端）的络合物中，两种共结晶的纤维三糖（橙色）紧邻催化Glu203（浅蓝色）和金属离子位置的锰（灰色球体）。(b条)X射线荧光PDB入口频谱6克1克锰和镍对应的峰值分别显示为黄色和紫色线条。(c（c）)金属离子现场的立体视图。第2个F类o个−F类c（c）电子密度图（灰色网格）的等高线为1σ（0.44欧−3). 这个F类o个−F类c（c）差分OMIT图（绿色网格），在His264中未经2-oxo修改而计算，等高线为3σ（0.36埃−3). 异常贴图（蓝色网格）的轮廓同样为3σ（0.36埃−3). 金属与Asp141、Gln172、Glu175、His176、His264的配位原子和水之间的距离以红色虚线表示。

3.4.质谱法共价修饰

为了评估组氨酸修饰的性质，进行了质谱分析。ESI-MS（图5一)清楚地显示了两个主峰，对应于改性和未改性蛋白质的混合物。峰之间的差异为16Da，对应于修饰物种中额外的O原子。为了确认修改确实存在于His264中，在卢比GH124蛋白水解（图5b条). 这项技术为His264中发生的修饰提供了明确的证据，观察到每对峰（未氧化和氧化形式）之间存在16 Da的间隙肽类含有这种残渣(H（H）MGIR至GISVH（H）MGIR）。因此，结合晶体学和质谱技术，可以确定这种修饰后的残基264确实是2-氧基istidine[请注意，所谓的“2-氧基estidine”，即PDB残基ID OHI，反映了两种化学上不同的物种，这将导致+14或+16的质量位移；这里观察到的是+16个物种（图5c（c）)如Schöneich（2000）所述)并在枯草芽孢杆菌PerR结构（Traoré等。, 2009)]. 氧化只是部分的这一事实可能是影响ITC化学计量的一个因素，特别是考虑到PerR在氧化时失去金属结合（在其两个2-氧istidine残基中的一个）。

图5 对劈开的（非His-tagged）进行质谱分析卢比GH124研究His264修改。(一)ESI-MS，普通和放大（插入）光谱。两个主峰表示非氧化混合物（计算值为25 304 Da；观察值为25 298 Da）和氧化值（计算值为25 320 Da；观察到，25 315 Da）形式。观测和计算尺寸的差异在该技术的误差范围内。(b条)裂解蛋白水解产生的肽卢比GH124（GISVH（H）MGIR）通过LC-MS/MS进行分析。还观察到未氧化（绿色）和氧化（粉红色）形式的混合物在肽类包含His264。(c（c）)此处观察到的“2-氧噻吩”的形式是产生+16质量位移的形式[如Schöneich（2000）所述)并在枯草芽孢杆菌PerR结构（Traoré等。, 2009)]而不是化学上不同的+14种。

氨基酸修饰，尤其是组氨酸氧化，是自然界众所周知的特征（Schöneich，2006）). 组氨酸被广泛报道为对（过渡）金属介导的自由基反应最敏感的氨基酸之一，主要是当它们非常接近时（Uchida&Kawakishi，1993; Schöneich，2000年; 霍沃卡等。, 2002; 林等。, 2010). 修饰的2-氧组氨酸已被报道为需氧和（兼性）厌氧微生物的氧化应激标记物（内田和川崎，1993; Ahn&Baker，2016年; 塞图等。, 2016). 在PerR中，蛋白质作为金属依赖性H发挥作用₂O（运行）₂传感器。

3.5. 一种果糖化低聚糖的观察

的结构卢比与纤维三糖（G3）共结晶的GH124显示了一个活性位点，其中有两个纤维三糖和两个水分子氢结合到第一链中的葡萄糖O1或第二链中的糖O4（图6，橙色），类似于Brás报道的结构等。(2011). 在与原批纤维己糖共结晶的结构中，在活性部位观察到一种非常罕见和意外的果糖基低聚糖（我们称之为G5F）（图6b条，蓝色）。

图6 比较催化位点中发现的糖。当与G3（上图，橙色）共结晶时，在催化残留物的两侧发现两个纤维三糖，链被几个水分子分开。当与G5F污染的纤维己糖底物（下图，蓝色）共结晶时，未发现解理。此外，果糖单元取代了先前结构中定义明确的水。

清晰的电子密度表明，还原端糖并非如预期的那样是葡萄糖，而是1–4键果糖部分。六糖似乎没有被裂解，因为在所有结构中观察到每条链有四到六个分子（数据未显示）。酶亚基−4到−1被一个分子占据，+1到+4被另一个分子占领，它们都被同一不对称单元中的第二个分子稳定在晶体中。

我们最初的想法是，果糖基低聚糖可能是G6制剂中的一种非常轻微的污染物，由于更紧密的结合和/或抑制潜力，酶以某种方式选择了这种污染物。因此，我们推测它必须紧密结合，因此果糖化低聚糖可能代表一类新的糖苷酶抑制剂。考虑到这一点，两个新的β-合成了1，4个配体作为GH124抑制剂：Glc-Fru（GF）和Glc-Glc-Fur（GGF）。然而，通过与这些配体中的任何一种共结晶都无法获得晶体，并且使用ITC也无法检测到任何结合。

鉴于GGF与卢比GH124，我们试图测试我们关于G5F是一种紧密结合但极为轻微的污染物的假设是否正确。使用GH1对疑似含有G5F的纤维己糖样品和新购买的批次（据信不含果糖）进行消化β-葡萄糖苷酶海洋热藻通过高效阴离子交换法检测单糖含量色谱法（HPAEC）和Megazyme的葡萄糖/甘露糖/果糖检测试剂盒。最初购买的G6样品中G6和G5F的比例约为1:1（但随后购买的批次为100%G6），这突出表明，所观察到的不寻常物种只是当时可用G6商业供应中的一种污染物。