1.简介
“第二代”生物燃料的生产,即随着我们从以石油为基础的能源转向安全和可再生的能源,从非粮食植物,这是一个主要的社会目标。虽然植物中的大多数多糖生物量是纤维素,但纤维素纤维被木聚糖等半纤维素包被,这使得获取纤维素更加困难。因此,木聚糖的酶降解对于纤维素酶在高等植物上的作用是必要的,但它本身也是一种重要的底物,因为葡萄糖和木聚糖以及少量其他糖是产生生物燃料的主要底物(2007年在萨默维尔讨论). 木聚糖等半纤维素的酶降解在生物燃料行业中具有重要意义(Pauly&Keegstra,2008年综述)也适用于多种行业,如面包制造、动物饲料和制浆造纸工业(用于纸浆漂白)。木聚糖是植物细胞壁的主要成分,由主干组成β-1,4-连接D类-木糖基链,其被不同的取代基修饰,包括2-和3-连接的阿拉伯呋喃基部分(通常在谷物阿拉伯木聚糖中)和葡萄糖醛酸(特别是在谷物和硬木葡萄糖醛酸聚糖中)。木聚糖的复杂性通过乙酰基和阿魏酸酯等酯类连接物种进一步细分,后者可能将木聚糖与木质素连接(图1一). 因此,木聚糖在自然环境和工业环境中的降解需要大量的酶,其中一些主要参与者包括β-木聚糖酶,β-木糖苷酶,α-葡萄糖醛酸酶、乙酰和阿魏酸酯酶以及阿拉伯呋喃糖苷酶,所有这些都需要进行深入的学术和工业研究(最近由Biely全面审查等。, 2016).
| 图1 木聚糖及其降解。(一)一种由化学基团着色的普通木聚糖的结构。箭头指示阿拉伯木聚糖活性阿拉伯呋喃糖苷酶切割的位置。(b条)转化阿拉伯呋喃糖苷酶的反应方案,需要同时存在布伦斯特酸和碱残基。 |
如果我们要实现可再生能源和安全能源方面的这些社会目标,阿拉伯氧基烷被认为是一种主要的“原料”,因为它存在于许多目前被广泛用于生物燃料生产的工厂中(有关评论,请参见Lagaert等。, 2014; Pauly&Keegstra,2008年). 鉴于阿拉伯木聚糖的降解需要一组酶发挥部分协同作用,吉尔伯特最近关于微生物降解木聚糖的工作(罗戈夫斯基等。, 2015)人们对木聚糖活性酶的结构、机制和特异性非常感兴趣,特别关注侧链裂解酶及其与主干裂解木聚糖酶的潜在协同作用。由于内切木聚糖酶自身调节侧链的能力不同,这种潜在的协同作用更加复杂。特别令人感兴趣的是阿拉伯糖呋喃糖苷酶,它能够从木聚糖主链的2-和3-位置去除阿拉伯呋喃糖基(Araf)取代基,从而为经典内切木聚糖酶的攻击打开木聚糖主键。阿拉伯呋喃糖苷酶在CAZy序列分类的GH2、GH3、GH43、GH51、GH54和GH62家族中发现(https://www.cazy.org; 伦巴第等。, 2014).
CAZY家族GH62含有许多充当阿拉伯木聚糖活性阿拉伯呋喃糖苷酶的酶等。, 2017). 2014年首次出现了GH62酶的三维结构,细菌报告了其结构腔色链霉菌(前原等。, 2014)和热紫球藻(王)等。, 2014)和两种来自玉米Ustilago maydis和柄孢霉(西吉尔等。, 2014). 三维结构共用一个通用的五叶片β-螺旋桨折叠活动中心在单置换机制中,保守的谷氨酸和天冬氨酸残基分别作为催化酸和催化碱,这与水解反应与异丙基构型反转相一致(图1b条). GH62酶已在CAZYpedia中进行了审查(有关审查,请参阅2018年CAZYpedia联盟).
在这里,我们展示了真菌GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的三维结构嗜松塔拉菌用定制的亚氨基葡萄糖阿拉伯呋喃糖苷酶抑制剂1,4-二脱氧-l,4-亚氨基在配合物中以1.25°的分辨率精制-L(左)-阿糖胞苷(AraDNJ)。该复合物揭示了活性位点,并根据之前公布的数据,分析了该酶如何与阿拉伯木聚糖底物相互作用,从而从木聚糖主链上去除这些侧链。
2.材料和方法
2.1. 大分子生产和小分子合成
该酶(一种没有预测N-糖基化位点的单模GH62阿拉伯呋喃糖苷酶;GenBank MG656406)在Novozymes a/S通过标准异源表达进行克隆和表达,使用米曲霉作为表达宿主,基本上如Biely所述等。(2014). 在转化子培养物中观察到约35kDa的新带,而在未转化生产菌株的培养物中未观察到。使用SDS–PAGE对几个似乎表达重组阿拉伯呋喃糖苷酶的转化子的表达水平进行了研究。在1 l生物反应器中表达最高表达水平的转化子后,对培养液进行灭菌过滤以去除菌丝体。过滤后的肉汤浓度为1.8M(M)硫酸铵,过滤后(0.22µm PES过滤器;Nalge Nunc International,Nalgene实验室产品目录号595-4520)将滤液装入苯基Sepharose 6快速流动色谱柱(高分馏;GE Healthcare,美国新泽西州皮斯卡塔韦)中,使其与25 m平衡M(M)HEPES pH 7.0和1.8M(M)硫酸铵;用三个25m的柱体积清洗柱M(M)HEPES pH值7.0,1.0M(M)硫酸铵和结合蛋白用25m洗脱M(M)HEPES pH 7.0。将这些组分合并并应用于Sephadex G-25色谱柱(GE Healthcare),用25 m平衡M(M)HEPES pH 7.5。将这些组分应用于SOURCE 15Q色谱柱(GE Healthcare),用25 m平衡M(M)HEPES pH 7.5和结合的蛋白质用0至1000m的线性梯度洗脱M(M)氯化钠超过10个柱体积。通过SDS–PAGE分析组分,并将含有阿拉伯呋喃糖苷酶的组分合并。
AraDNJ的合成是使用文献程序进行的(Jones等。, 1985; 纳勒韦等。, 1988).
2.2. 结晶
结晶筛选是通过坐滴蒸汽扩散法进行的,滴液由蚊子晶体液控机器人(英国TTP Labtech)设置,150 nl蛋白质溶液加上150 nl储液罐溶液,96 well格式板(瑞士瑞士MRC 2孔结晶微孔板),与54µl储液罐溶液。实验是在室温下使用几个商业屏幕进行的。
进行了广泛的筛选,没有发现有希望的结果。最后,样品在pH 8.5的Tris–HCl中进行浅粒离子交换。合成的峰是不对称的,调整了运行条件以优化峰不同区域的分离(整个梯度0–1M(M)NaCl,洗脱缓冲液10–20%时的峰分离)。这些区域的分数分别汇总和浓缩。从峰值开始就用蛋白质组分进行结晶。在添加和不添加抑制剂AraDNJ的情况下进行结晶,使用时将其与蛋白质混合,最终浓度为5 mM(M)在Crystal Screen HT条件G3中,蛋白质与抑制剂复合物的命中率最高(0.01M(M)硫酸锌,0.1M(M)MES pH 6.5,25%PEG 550 MME);这是为了进一步优化而选择的种子库存。
准备好种子储备并进行微种子基质筛选(MMS);有关最新审查,请参阅D'Arcy等。, 2014)根据公布的协议(肖·斯图尔特等。, 2011; 沙阿等。, 2005)有两个屏幕,Crystal Screen HT和JCSG,以及对命中条件的一些优化。从JCSG屏幕条件B2、G7和G10获得衍射质量的晶体。用于数据采集的数据是从条件G10中获得的,即30%PEG 2K MME,0.2M(M)KBr.公司。通过将PEG 3350以1:2的比例(3µl PEG+6µl母液)添加到母液中来对晶体进行冷冻保护,这相当于最终冷冻保护剂溶液中的16.6%PEG 3350:20%PEG 2K。结晶条件如表1所示.
方法 | 蒸汽扩散,坐滴;多媒体信息服务 | 板材类型 | 瑞士瑞士MRC 2孔结晶微孔板 | 温度(K) | 293 | 蛋白质浓度(mg ml−1) | 25 | 蛋白质溶液的缓冲液成分 | 20米M(M)Tris–HCl pH 8.5,150米M(M)氯化钠 | 储层溶液的组成 | 30%PEG 2K MME,0.2M(M)千比尔 | 跌落体积和比率 | 总计300 nl,1:1比例 | 储液罐容积(µl) | 54 | | |
2.3. 数据收集和处理
所有计算都是使用来自中央对手方清算所4套房(优胜者等。, 2011)除非另有说明。数据收集在钻石光源(DLS)的光束线I04-1上,分辨率为1.2º,并用夏2(冬季等。, 2013). 数据收集和处理统计数据见表2.
衍射光源 | I04-1,DLS | 波长(Ω) | 0.93 | 温度(K) | 100 | 探测器 | 皮拉图斯6M-F | 晶体到探测器的距离(mm) | 254.2 | 每张图像的旋转范围(°) | 0.1 | 总旋转范围(°) | 180 | 每张图像的曝光时间(s) | 0.0375 | “空间”组 | P(P)21 | 一,b条,c(c)(Å) | 43.83, 88.97, 72.66 | α,β,γ(°) | 90, 95.22, 90 | 镶嵌度(°) | 0.11 | 分辨率范围(Ω) | 33.52–1.25 (1.27–1.25) | 反射总数 | 457639 (14559) | 独特反射次数 | 149344 (6813) | 完整性(%) | 98 (91) | 科科斯群岛1/2† | 0.998 (0.79) | 多重性 | 3.1 (2.1) | 〈我/σ(我)〉 | 13.1 (2.9) | R(右)合并 | 0.044 (0.28) | R(右)相对湿度。‡ | 0.052 (0.34) | 总体B类Wilson图中的因子(λ2) | 5.1 | | †CC公司1/2的值我意思是通过将数据随机拆分为两个半数据集来计算。 估计R(右)相对湿度。=R(右)合并[N个/(N个− 1)]1/2,其中N个是数据多重性,以及R(右)合并定义为,其中我(香港特别行政区)是反射的强度。 |
2.5. 等温滴定量热法
用等温滴定法测定配体亲和力热量测定法(ITC)。ITC在25°C下进行,时间为25 mM(M)HEPES pH 7.0,100 mM(M)NaCl使用Malvern MacroCal Auto-iTC200量热计。注射器中的配体位于1.8米处M(M)并滴定到含有112µM(M)酶的溶液。检测重复进行。使用PEAQ-ITC分析软件(Malvern)。
3.结果和讨论
结构(PDB条目6f1页)以1.25º的分辨率进行溶解和精炼(表3). 蛋白质链可以从残基25追溯到325,并且包含结构钙离子和锌离子。五叶草β-螺旋桨结构(图2一)与先前发表的GH62酶有很强的相似性,尤其是来自天竺葵(前原等。, 2014)和热紫球藻(王)等。, 2014); 300个残基与72和69%的序列一致性和r.m.s.Cα偏差分别为0.58和0.68Å,由高PDF折叠(Krissinel&Henrick,2004))问得分分别为0.95和0.94。在非对称单元具有很高的结构相似性(r.m.s.d.为0.22º),在外表面,特别是在晶体接触区域,存在一些构象差异。
| 图2 的三维结构和配体结合松毛虫GH62阿拉伯呋喃糖苷酶与抑制剂AraDNJ的复合物。(一)从N端(蓝色)到C端(红色)的三维结构颜色。金属离子显示为阴影球体,AraDNJ显示为CPK模型。(b条)AraDNJ的化学结构。(c(c))AraDNJ绑定的ITC数据(K(K)d日24±0.4µM(M)). (d日)结合GH62,2的AraDNJ的观测电子密度F类o(o)−F类c(c)(最大可能性/σA类-加权)1.25°,1°等高线σ图中显示了催化酸Glu212和碱Asp52,以及一个用于亲核攻击的水分子。(e(电子))部分覆盖松毛虫GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(棕色,AraDNJ呈绿色)天竺葵GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(PDB条目3个月2; 淡蓝色,绿色为木五糖),突出了高度保守的结合中心和阿拉伯木聚糖链的识别装置。结构图用中央对手方清算所4毫克(麦克尼科拉斯等。, 2011). |
在这两种金属离子中,钙2+离子的位置基本上与之前报道的一样,例如在天竺葵酶(前原诚司等。, 2014). 然而,这种结构钙2+离子(接近但不撞击活性中心)由六个水分子和Glu215的羧酸O原子配位。这与之前的结构不同,其中Ca2+离子由一对His和Gln配位,在这里被一个氢键合到Ser278(代替His)和Glu215(代替先前观察到的Gln)的水分子取代。在松毛虫酶有额外的锌2+离子来源于结晶条件下的“种子原料”(见上文)元素。其中一座桥A类和B类晶格中的分子,可能有助于晶格的形成,与分子的His180配位A类和氨基末端NH2分子中Ser24的羰基和Glu220的侧链B类.另一个锌2+离子由分子中的Glu88配位B类来自对称相关分子的His180B类和三种水。
的结构松毛虫在假定的阿拉伯呋喃糖苷酶抑制剂AraDNJ存在的情况下测定GH62阿拉伯呋喃喃糖酶(图2b条),这允许进一步确认催化装置。该化合物已被用于其他阿拉伯呋喃糖苷酶(Axamawaty等。, 1990; 海姆斯沃思等。, 2016)以及开发其他糖苷酶抑制剂的支架(Siguier等。, 2014; 梅纳·巴拉根等。, 2016). 氮糖和亚氨基糖通常被认为是保留糖苷的良好抑制剂水解酶类由于它们的内环N原子可以被质子化,因此模拟了被认为在糖苷水解过程中处于过渡状态的假定正电荷。此外,N原子与酸/碱和亲核剂在这些酶的活性部位(例如,参见Gloster等。, 2007). GH62酶正在转化,因此没有合适的位置亲核剂。因此,让我们惊讶的是,AraDNJ作为一种具有良好密度的抑制剂。因此,通过等温滴定法测定AraDNJ的结合常数热量测定法(图2c(c)),露出一个出奇的紧K(K)d日24±0.4µM(M)在糖苷酶中,亚氨基糖苷与糖苷酶活性位点结合得如此好而没有紧密的酶衍生亲核作用是罕见的,但其他例子包括CAZY家族GH6,其中纤维二糖衍生的异精胺已被用于取得良好效果,甚至报道了催化过程中涉及的底物畸变(Gloster等。, 2007). 在这里,AraDNJ结合了一个潜在的过渡国家理念4E类构象。正如所料,AraDNJ绑定在与Araf自身相同的位置(例如,请参见PDB条目4o8点; 王等。, 2014)从O2和O3到Asp160,从O3到Gln120,从O56到Asp52,形成类似的氢键。Ile159的侧链也可能存在疏水性接触。带正电的N原子(此处取代阿拉伯糖的内环O原子)没有直接相互作用,但结构显示水分子位于呋喃糖环“下方”3.1°处,在此处氢键结合到Asp52,即假定的催化碱,与先前的研究一致(前原诚司等。, 2014; 王等。, 2014)和反转机构(图1b条). Glu212,假定的酸,用于侧向反对的任何离开的群的质子化(图2d日). 值得注意的是,带正电的N原子正好位于已公布的同系物Tris络合物的带正电N原子所在的位置(例如,参见PDB条目3个月2,的天竺葵GH62酶;前原诚司等。, 2014)强调了这些酶已经进化为稳定带正电荷的过渡态,即使没有保留酶可用的直接电荷相互作用的帮助。
这个松毛虫根据过去对GH62酶的低聚木糖复合物的研究,GH62酶与AraDNJ的复合物提供了对GH62酶类从阿拉伯木聚糖中去除阿拉伯呋喃糖苷修饰物的机制的进一步了解。木糖复合物覆盖层(PDB入口3个月2)的天竺葵GH62酶(前原等。, 2014; 图2e(电子))显示了木聚糖链的相互作用表面如何在两种酶之间高度保守,两个芳香平台(Phe211、Tyr312和Trp121)和一些氢键相互作用(Arg237、Asn313和Asp177)是不变的,这表明配体识别是类似的。事实上,AraDNJ复合物的C1位于PDB入口中“第二”(来自还原端)木糖部分的O3原子1.9Å处3个月2,强调了松毛虫GH62酶可以作为一种阿拉伯呋喃糖苷酶,对O3取代的木聚糖具有活性,正如最初针对天竺葵GH62酶(前原等。, 2014),尽管如果木聚糖链偶尔通过活性位点反转,也可以考虑在O2位置的作用(考虑到木聚糖的内部假对称性,这可能是木聚糖的作用)。
这个松毛虫因此,GH62酶为围绕天然和工业阿拉伯木聚糖降解中这些关键参与者的日益增长的文献增添了内容。它展示了阿拉伯呋喃糖苷模拟物如何位于酶的活性部位,以及该酶如何识别和裂解阿拉伯木聚糖。此外,亚氨基糖苷酶抑制剂在研究转化酶结构和功能方面的非经典应用应鼓励此类化合物在未来的进一步非直观应用。
致谢
作者感谢诺维信A/S为这项工作提供了部分资金。GJD是英国皇家学会Ken Murray研究员。KAS感谢澳大利亚研究委员会,TC感谢澳大利亚政府、西澳大利亚大学(UWA)和UWA显微镜、表征和分析中心。作者还要感谢Diamond光源提供的光束时间(提案mx13587),以及光束线I04的工作人员在晶体测试和数据收集方面提供的帮助。
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