2.1. 大分子生产

从GenScript购买了一个合成的编码VC0615的cDNA，克隆到pET-21a载体的NdeI（5′）和XhoI（3′）位点。该结构包含完整的VC0615基因，后跟一个C末端六组氨酸标签。通过T7-fwd和pET-RP引物测序验证克隆质粒的正确性（表1)在用于蛋白质生产之前。

pET-21a-VC0615质粒用于转化化学活性大肠杆菌BL21金（DE3）细胞。在含有氨苄青霉素（100µg ml）的恐怖肉汤（TB）中培养细胞以生产蛋白质⁻¹)37°C，摇晃。当到达光学密度600 nm（外径₆₀₀)0.8，用0.5m诱导培养M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），然后在16°C下摇晃培养过夜。

细胞在4000℃离心收集克在4°C下保持15分钟。小球在HisTrap缓冲液中再次悬浮A类（20米M（M）Tris pH值8.0，500 mM（M）氯化钠，20米M（M）咪唑，1米M（M）DTT）补充无EDTA cOmplete蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和牛胰腺DNase I（Sigma），并在172 MPa的压力下通过细胞破碎器（恒定系统）对细胞进行裂解。细胞裂解物在50000下离心清除克在4°C下保持45分钟，然后立即将清除的裂解液涂敷在用HisTrap缓冲液预先平衡的5 ml HisTrap-FF粗塔（GE Healthcare）上A类应用裂解液后，用HisTrap缓冲液的五个柱体积（CV）清洗柱A类去除未结合蛋白，然后使用增加的HisTrap缓冲液线性梯度洗脱结合蛋白B类（20米M（M）Tris pH值8.0，500 mM（M）氯化钠，1000米M（M）咪唑，1米M（M）DTT）超过20 CV。SDS–PAGE用于识别含有VC0615的组分，这些组分使用30 kDa截止Vivaspin离心浓缩机（Millipore）合并并浓缩至～5 ml体积。HisTrap纯化的浓缩蛋白通过尺寸排除色谱法（SEC）使用S75 16/600色谱柱（GE Healthcare）与SEC缓冲液（20 m）预平衡M（M）HEPES pH 7.4，200 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT）。含有VC0615的SEC组分通过SDS–PAGE进行鉴定，在离子交换（IEX）缓冲液中混合并稀释20倍A类（20米M（M）HEPES pH 7.4，1 mM（M）DTT）。将稀释的蛋白质样品应用于在IEX缓冲液中预先平衡的5 ml HiTrap Q HP柱（GE Healthcare）上A类.用5 CV IEX缓冲液清洗加载柱A类并用20CV增加的IEX缓冲液线性梯度洗脱B类（20米M（M）HEPES pH 7.4，1500米M（M）氯化钠，1米M（M）DTT）。SDS-PAGE鉴定出主要IEX洗脱峰含有纯VC0615，而在较高NaCl浓度下洗脱的小肩峰含有污染物蛋白质。

合并含有纯化的VC0615的级分，并用IEX缓冲液稀释A类将NaCl浓度调整到100 mM（M）.使用30 kDa截止值的Vivaspin离心浓缩器浓缩纯化的蛋白质样品，并通过280 nm处的紫外线吸收率计算最终浓度(A类₂₈₀)使用计算出的摩尔消光系数129720M（M）⁻¹ 厘米⁻¹计算出的分子质量为66 130.81 g/mol⁻¹.

2.2. 动力学分析

通过测量人工荧光底物4-甲基伞形花序基的水解来确定酶动力学-β-D类-吡喃葡萄糖苷（4MU-β-D类-Glc；西格玛）。简而言之，50µl 4MU溶液-β-D类-20 m内2×最终浓度下的GlcM（M）pH 6.5的磷酸钠在96 well微孔板（Nunc）中制备。为了启动反应，50µl浓度为2µ的VC0615M（M）20米M（M）将pH 6.5的磷酸钠添加到每个底物溶液中，得到最终反应体积为100µl，包含1×4MU-β-D类-Glc基底和1µM（M）VC0615。使用Polarstar微孔板阅读器（BMG Labtech）连续监测600秒以上4MU荧光产物释放的反应。根据4MU绘制的初始反应速率-β-D类-Glc底物浓度通过非线性回归拟合到Michaelis–Menten方程V（V）= (V（V）_最大值[4万-β-D类-Glc]）/(K（K）_米+[4万-β-D类-Glc]）。k_猫根据确定V（V）_最大值通过关系V（V）_最大值=k_猫[E] ●●●●。所有反应均一式三份。

使用其他4MU的反应糖苷类按照上述方法进行。

2.3.薄层色谱法（TLC）分析

除（GlcN）外，用于消化和TLC分析的所有低聚糖底物和标准品均购自Megazyme₂，购自西格玛。使用10 mg ml的低聚糖底物浓度，在pH 6.5的磷酸麦氏-柠檬酸盐缓冲液中进行消化反应⁻¹和0.5µM（M）VC0615.20µl反应体积包含酶和底物，在37°C下摇晃培养。在设定的时间点，移除2µl反应混合物，并通过在液体N中闪速冷冻“暂停”₂在完成反应时间过程后，将所有冷冻的等分试样解冻并点在铝箔背衬的二氧化硅TLC板（Sigma）上。

TLC板以50:25:25的速度运行n个-丁醇：水：乙酸溶剂系统，直到溶剂前沿距板顶约1-2厘米。为了提高斑点之间的分离，将TLC板干燥，并在同一溶剂系统中再次运行。在第二次运行后，将TLC板干燥并使用第页-茴香醛（Sigma）染色（3.7 ml第页-茴香醛、1.5 ml乙酸、5 ml浓硫酸、135 ml乙醇），温和加热。

2.4. SEC-MALLS公司

SEC-MALLS试验在20m内进行M（M）HEPES 7.4200米M（M）NaCl缓冲液。注射样品含有100µl VC0615，浓度为2.5 mg ml⁻¹20米M（M）HEPES pH 7.4，100 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT公司。实验在一个系统上进行，该系统包括Wyatt HELEOS II多角度光散射检测器和与岛津HPLC系统相连的Wyatt rEX折射感应检测器（SPD-20A UV检测器、LC20-AD等容泵系统、DGU-20A3除气器和SIL-20A自动进样器）。工作在室温（20±2°C）下进行。在使用之前，对所有溶剂和缓冲液进行0.2µm的过滤，并且在流动路径中还有一个0.1µm过滤器。岛津LC解决方案软件用于控制HPLC和ASTRA第五版软件用于HELEOS II和rEX探测器。

所有数据均使用ASTRA第五版软件。使用Zimm拟合方法估计分子质量，其阶数为1。0.18 ml g的值⁻¹用于蛋白质折射指数增量（dn个/d日c（c）).

2.5. 结晶

使用96个Swissci SD-2板（“MRC”板），在一系列商业筛网上，以坐滴式蒸汽扩散形式进行结晶试验，滴液由120 nl蛋白质和120 nl储液罐溶液组成。使用聚乙二醇和/或盐基结晶筛的初始试验，使用～30 mg ml⁻¹VC0615蛋白的库存没有产生任何影响。随后，蛋白质浓度增加到67.5 mg ml⁻¹并测试了另一系列商业屏幕。在PGA屏幕上发现晶体（分子尺寸；Hu等。, 2008)在含有0.1的条件下M（M）pH 7.8的Tris缓冲液以及PEG和PGA-LM沉淀剂的组合。优化后，在一系列PEG和PGA-LM浓度范围内，在基本pH值下，以坐滴式和挂滴式蒸汽扩散形式生成晶体。最终结晶条件为0.1M（M）使用1µl蛋白质溶液和1µl储液罐溶液，以悬挂滴蒸气扩散形式，在pH 7.5、5%PGA-LM、8%PEG 20K下进行Tris。

在晶体保存过程中，冷冻保护遇到了很大困难。将晶体收集到由结晶井溶液（0.1）组成的“标准”低温保护剂中M（M）Tris pH 7.5，5%PGA-LM，8%PEG 20K），辅以25%乙二醇，导致晶体快速溶解。大量实验发现，晶体的稳定低温保护需要使用高浓度的PGA-LM，尽管去除PEG 20K不会对晶体的稳定性或衍射产生不利影响。因此，将晶体收集到含有0.1M（M）在液氮中闪蒸冷却之前，Tris pH 7.5，13%PGA-LM，25%乙二醇，用于数据收集。结晶信息汇总在表2中.

2.6. 数据收集和处理

数据收集在英国钻石光源（DLS）的光束线I03上。图像被索引并与XDS公司（卡布施，2010年)，然后使用漫无目的的（Evans&Murshudov，2013年). 所有计算均在新的中央对手方清算所4我2接口到中央对手方清算所4软件套件（波特顿等。, 2018). 表3总结了数据收集统计数据.

2.7. 结构解决和细化

这个晶体结构VC0615的分子置换（MR）同时使用MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年)和相位器（麦考伊，2007年)含有GH9酶单体副溶血性弧菌（PDB条目3小时7升; 纽约SGX结构基因组研究中心，未发表的工作）作为每个案例的搜索模型。顶级MR解决方案MOLREP公司在非对称单元，而顶级MR解决方案来自相位器发现了五条链条。仔细检查发现相位器解决方案比其他方案差得多，表明要么是混乱，要么是部分入住。决定将此链保留在模型中，作为积极因素F类_c（c）−F类_o个差异密度和更高R（右）_工作和R（右）_自由的在没有它的情况下观察到了一些因素。

因为MOLREP公司结合了搜索模型与目标序列的对齐和修改，MR使用相位器使用一种单体再次进行MOLREP公司。得到的解决方案中包含五条链非对称单元，每个具有正确的VC0615序列。分子置换溶液来自相位器在中进行了交替的手动建模库特（埃姆斯利和考坦，2004年)和精炼具有REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)使用自动生成的本地NCS约束。这个细化统计总结见表4.使用国际学生成绩评估（Krissinel&Henrick，2007）)使用国际学生成绩评估内的扩展库特使用SSM叠加函数计算根-平方偏差（r.m.s.d.）中央对手方清算所4毫克（麦克尼古拉斯等。, 2011). 使用以下方法生成结晶图形PyMOL公司（薛定谔）。

3.1. 重组VC0615的生化特性

我们首先使用荧光底物4MU表征纯化的重组VC0615的酶活性-β-­D类-葡萄糖和4MU-β-D类-纤维二糖。与之前对该酶的分析一致（Park等。, 2002)，4万-β-D类-葡萄糖由VC0615水解，并具有Michaelis–Menten动力学参数K（K）_米= 768 µM（M）和k_猫=1.3分钟⁻¹（图1一). 与它作为一种外作用酶的活性报告一致，我们无法为4MU的水解建立Michaelis–Menten动力学模型-β-D类-VC0615的纤维二糖，因为4MU的释放之前有一个滞后期，反映了4MU释放之前的−2葡萄糖水解。未观察到4MU水解-β-D类-木糖，4MU-β-D类-GlcNAc或4MU-β-D类-甘露糖底物（图1b条). 本田和同事之前展示了PBPRA0520，来自深度P.depundum（VC0615的一个紧密同源物）是一种活性外葡聚糖酶（本田等。, 2011). 然而，我们无法测量4MU水解的动力学参数-β-D类-由于缺乏这种底物的商业可用性，VC0615使用葡萄糖胺。

图1 VC0615对含氟底物的水解。(一)4MU水解的Michaelis–Menten动力学-β-D类-VC0615检测葡萄糖。误差线是三个技术复制品的标准偏差。(b条)从各种基质中水解释放4MU。仅4MU-β-D类-葡萄糖和4MU-β-D类-纤维二糖有水解作用。从4MU释放4MU-β-D类-纤维二糖遵循一个滞后期，这与外作用酶的过程水解相一致。（RFU，相对荧光单位。）

为了获得葡萄糖苷酶效率的半定量测量与通过VC0615的葡糖苷酶活性，我们接下来研究了低聚糖由VC0615使用薄层色谱法（TLC）。当纤维二糖、纤维三糖或纤维四糖用作VC0615的底物时，我们观察到反应混合物中葡萄糖单体和较短的纤维低聚糖逐渐增加。观察到的裂解模式与从纤维寡糖链中去除单个葡萄糖单元的过程一致，而不是通过内切糖苷酶进行内链水解（图2一).

图2 用VC0615对纤维寡糖和壳寡糖底物水解进行TLC分析。(一)VC0615对纤维低聚糖的消化会影响葡萄糖的逐渐释放并缩短释放时间低聚糖，与加工性外糖苷酶的活性一致。(b条)与观察到的纤维低聚糖相对缓慢的水解相比，VC0615可在30分钟内完全消化壳二糖。(c（c）)VC0615不水解N个,N个′-二乙酰壳二糖。在所有TLC中，紫色斑点对应于McIlvaine反应缓冲液中的柠檬酸盐，而标准溶液中没有这种物质。柠檬酸盐会导致一些较低的斑点移位。（d.p.，聚合度。）

当壳二糖（GlcN）₂作为VC0615的底物，也观察到单糖的裂解（图2b条). 引人注目的是，在5分钟的反应时间后已经可以看到大量的产物，并且VC0615在30分钟内完成了对壳二糖底物的完全消化。相反，在1小时后，纤维二糖消化物中保留了大量的起始材料（这两个反应都是用10 mg/ml引发的⁻¹基板）。这些实验表明，VC0615是一种比外葡糖苷酶更有效的外葡糖苷胺酶，这与之前对PBPRA0520的观察结果一致（Honda等。, 2011)一般来说，弧菌科缺乏纤维素代谢。与4MU底物实验一致，不消化N个,N个′-二乙酰壳二糖（GlcNAc）₂甚至在孵育1小时后观察到（图2c（c）).

3.2. VC0615的结晶和晶块相互作用

VC0615的第一轮结晶试验在～30 mg ml的浓度下进行⁻¹使用一系列PEG和/或盐沉淀剂筛选的蛋白质浓度。在所有测试条件下，我们都没有发现蛋白晶体。随后，VC0615浓度增加至～67.5 mg ml⁻¹并测试了额外的结晶筛。在第二轮筛选中，我们观察到在含有Tris缓冲液和PGA-LM和PEG沉淀剂组合的条件下，PGA屏幕（分子尺寸）中出现了几个点击（图3一). 优化试验表明，结晶有利于基本pH值，可耐受一定范围的PGA-LM和PEG浓度。坐滴和挂滴蒸汽扩散技术都产生了具有类似视觉质量的晶体。最终结晶条件为0.1M（M）Tris pH值7.5，5%PGA-LM，8%PEG 20K。晶体通常在数小时内出现，并在2天内达到最大尺寸（表2).

图3 VC0615的结晶和衍射。(一)PGA筛孔G8（0.1）VC0615晶体的亮场和紫外荧光图像M（M）Tris pH值7.8，5%PGA-LM，8%PEG 20K）。(b条)钻石光源光束线I03上VC0615晶体的衍射图像。

尽管优化后的VC0615晶体具有明显的视觉质量，但很明显，它们对X射线衍射研究的适用性是有限的。即使在对结晶和低温保护剂条件进行了广泛优化后，所测试的VC0615的所有晶体都显示出高度弥散的衍射图案，这表明晶体内部存在严重的内部无序。最有希望的VC0615晶体，使用13%PGA-LM和25%乙二醇进行低温保护，被送往英国钻石光源的光束线I03进行数据采集。同步辐射衍射图像的外观与内部收集的图像相似（图3b条)尽管数据的镶嵌度略低于预期（最佳数据集为0.26°）。VC0615的最佳数据集被处理为3.17º分辨率，并用于所有进一步的计算（表3和4).

VC0615晶体的衍射显示为三角形空间组沿单螺杆轴一轴，匹配P（P）三₁21或P（P）三₂21.马修斯系数分析表明非对称单元是VC0615晶体最可能的成分（概率为30%和40%，溶剂含量分别为53.3%和45.5%），尽管每个非对称单元也有可能（概率分别为10%和15%，溶剂含量分别为61.1%和37.7%）。

VC0615结构的求解方法为分子置换使用来自副溶血性弧菌与VC0615共享68%的身份。来自相位器表示正确空间组成为P（P）三₂21中含有五个VC0615分子非对称单元。令人惊讶的是，当同样分子置换与MOLREP公司使用默认设置，只放置了四个VC0615分子。仔细检查发现，尽管VC0615五条链中的四条链的电子密度清晰明确，但第五条链（以下简称链）的密度E类)相当贫困，在许多地区几乎无法解释。与较低的电子密度一致B类链的因素E类大大高于其他四条链条（以下简称链条A类–D类)（图4一).

图4 VC0615的亚基相互作用和晶体堆积。(一)非对称装置VC0615的颜色B类因子，显示链的高度无序E类。所示地图为F类c（c）−F类o个OMIT密度在0.22 eá下的等高线−3计算依据精炼不带链条的VC0615E类. (b条)SEC-MALLS示踪显示纯化VC0615的单峰，包含估计分子量为～118 kDa的物种，表明VC0615在溶液中形成二聚体。(c（c）)链条的叠加A类和D类和链条B类和C类VC0615的二聚体。(d日)VC0615晶体的包装。一张单人床非对称单元以蓝色突出显示（链条A类–D类)和紫色（链子E类). 链A类–D类和链条E类在其他不对称单元中，颜色分别为灰色和红色。由链状分子包围的中央通道E类可以在四个单元的交叉处观察到。(e（电子）)假想链中两个对称相关分子之间发生的空间碰撞F类’（红色和紫色）。

为了确定低聚作用对于溶液中的VC0615，我们通过尺寸排除色谱法耦合到多角度激光器光散射（秒-球）。纯化的VC0615作为一个单一主峰洗脱，计算出的分子量为～118 kDa，表明溶液中的物种可能是二聚体（单体质量为～66 kDa；图4b条).国际学生成绩评估分析（Krissinel&Henrick，2007）)链分子间的稳定二聚体A类和链条D类相邻的非对称单元，以及链条之间B类和链条C类相邻的非对称单元。计算的界面面积为1294.9Ų每个分子A类–D类二聚体和1289.6º²每个分子B类–C类二聚体。给定基本相同的计算界面面积A类–D类和B类–C类二聚体，以及它们的强相似性（根据SSM叠加计算，1129个残基的相对标准偏差为0.32℃中央对手方清算所4毫克)，VC0615的这种排列可能是溶液中存在的生物相关二聚体（图4c） ●●●●。

VC0615内蛋白质组相互作用的分析晶格也许可以为观察到的链的电子密度大幅度降低提供一些解释E类VC0615晶体似乎包含一个平行于c（c）轴位于四个相邻单位细胞的交叉点，由链状分子包围E类（图4d日). 鉴于VC0615的二聚性，我们推测可能存在第六链F类VC0615的'晶体中，可能作为链的二聚体伙伴位于该中央通道内E类.尽管有一些积极的方面F类_c（c）−F类_o个在中央通道中观察到不同的密度，这种密度太低，甚至不足以对VC0615的一小部分进行建模。因此，我们检查了添加‘chain’的效果F类'至VC0615晶体结构通过叠加A类–D类链上二聚体E类由此产生的假设六链模型揭示了链之间的巨大空间位阻F类’和沿c（c）轴，表明VC0615的额外分子不能轻易容纳在这种晶体填充排列中（图4e（电子）). 求解VC0615的下对称结构空间组 P（P）三₂没有产生这样一种结构：F类分子被很好地分解，这表明观察到的对称性冲突不太可能是由伪对称操作员被误认为晶体对称性在中P（P）三₂21结构。考虑到这条链F类'是链的二聚体伙伴E类，很难包装这个链，很容易解释观察到的链分子的无序性E类在VC0615晶体结构中。

当VC0615结构仅使用链进行改进时A类–D类在中非对称单元，这个R（右）_工作和R（右）_自由的因子高出约2–3%，且呈显著阳性F类_c（c）−F类_o个在链对应的区域可以观察到不同的密度E类因此，我们选择离开连锁店E类在最终沉积结构中建模（PDB条目6千吨).

3.3. VC0615的结构及其与其他GH9酶的关系

VC0615的结构与从深棕（PBPRA0520；PDB条目5dgr公司; 本田等。, 2016)和副溶血性弧菌（VP2484；PDB条目3小时7升; 纽约SGX结构基因组研究中心，未发表的工作），分别共享60%和68%的序列一致性。使用SSM叠加函数进行叠加中央对手方清算所4毫克对于VC0615和PBPRA0520，在554个残基上的r.m.s.d.s为0.66º，对于VC0615-VP2484，在563个残基（比较链A类每个结构）。

VC0615原聚体由两个结构域组成：N末端纤维连接蛋白III型（Fn3）结构域（氨基酸1–92）和C末端(α/α)₆-含有活性位点的桶结构域（93–566）。VC0615的活性位点（根据与PBPRA0520配体复合物的同源性推断的位置；PDB条目5dgr公司)位于一系列环中，这些环从(α/α)₆-桶（图5). 来自的长链接器α-螺旋1–2（残基112–162）和α-VC0615的螺旋9–10（404–442）（在3.17º分辨率下分辨率良好的特征）有助于形成朝向结合囊的“背面”的封闭立体块，从而将活性位点结合囊限制为仅一个糖结合亚基。这些长环将VC0615和相关的外作用GH9与内作用GH9区分开来，如Tf-Cel9A纤维素酶fusca热裂菌，它的连接其α-螺旋（PDB入口第4页，共4页; 沙功等。, 1997; 图6).

图5 VC0615单体的结构。(一)VC0615（链条）带状图A类)，显示Fn3（粉红色）和(α/α)6-桶状（橙色）域。(b条)VC0615的活性部位残留物。对假定的酸和催化碱残留物进行了注释。

图6 弧菌科外作用GH9s与一种内源性GH9酶。(一) (α/α)6-外作用GH9s VC0615的域对齐（颜色如图5所示)，PBPRA0520（PDB条目5个数字; 绿色）和VP2484（PDB条目3小时7升; 紫色），与来自富斯卡锥虫（PDB条目第4页，共4页; teal），与裂解的纤维己糖底物复合（teal棒；白色圆圈表示酶亚基）。外作用GH9中的扩展回路α-螺旋线1至2（黑色；VC0615编号中的112–162）和α-螺旋9到10（黑色；404到442）形成立体块，封闭这些酶的结合囊。Tf-Cel9a（红色；20–63和292–315）中的相应环路较小，并且不会阻碍基底结合间隙。(b条)Clustal欧米茄（西弗斯和希金斯，2018)VC0615、PBPRA0520、VP2484和Tf-Cel9a序列的对齐，回路序列突出显示。环路大小的巨大差异导致次优对准Clustal欧米茄在中α-螺旋9–10区域。颜色如(一).

虽然严格来说不是一种外作用酶C.热电偶（PDB条目1季度5; 舒伯特等。, 2004)据报道含有一个结构上封闭的结合囊，尽管它水解末端纤维二糖而不是末端葡萄糖单元。VC0615和相关的GH9s与CbhA的结构比较表明α-螺旋1至2和9至10对真正外作用酶中−2亚基的空间位阻贡献更大（图7). 值得注意的是，当循环从α-实际上，CbhA中的螺旋1到2（117–183）比外作用GH9（VC0615中的112–162）长α-与CbhA相比，外作用GH9s中的螺旋1-2环强烈向内投射到活性位点，从而封闭了更多的酶结合囊。

图7 弧菌科外作用GH9s与这个C.热电偶纤维二糖水解酶CbhA。(一)外显作用GH9s VC0615、PBPRA0520和VP2484，以及CbhA E795Q突变体（PDB条目1季度5; 灰色），与未分离的纤维四糖底物复合（灰色条；白色圆圈表示酶亚基）。来自α-螺旋线1至2（黑色；VC0615编号中的112–162）和α-螺旋9到10（404–442）有助于封闭外作用GH9的−2亚网站。CbhA中的相应环路（红色；117–183和454–471）没有遮挡−2子网站。这个α-与CbhA中的同一环相比，外作用GH9中的螺旋1-2环更多地投射到酶结合位点中，从而产生更多的空间位阻来对抗-2亚基结合。(b条)Clustal欧米茄（Sievers&Higgins，2018年)VC0615、PBPRA0520、VP2484和CbhA序列的对齐，突出显示回路。颜色如下(一).

活性位点残基在VC0615、PBPRA0520和VP2484之间几乎完全保守，唯一的变化是PBPRA0220中存在Phe231，而在VC0615-VP2484中的等效位置存在Tyr（VC0615中的Tyr232）。尽管我们试图通过用纤维三糖或纤维四糖浸泡晶体来获得VC0615的配体复合物，但这些努力并没有产生具有可解释的活性位点电子密度的结构。因此，我们检查了VC0615中的活性位点相互作用通过与PBPRA0520–氨基葡萄糖配体复合物的比较。根据与PBPRA0520的同源性，推测VC0615的Asp140和Glu546分别作为VC0615的催化碱基和酸残基，Asp144也可能在协调进水中起重要作用亲核剂。Asp140和Glu546相距8.4º，与转化糖苷酶催化残基的典型分离一致（Davies&Henrissat，1995). 令人惊讶的是，VC0615（或PBPRA0520）结合囊内似乎没有观察到的甲壳寡糖优于纤维素基质的结构原理。A−1亚基葡萄糖胺预计会将其2-氨基定位在VC0615的Tyr148、Tyr232和Trp220的氢结合距离内，其中没有一个明显适合区分氨基在羟基上的氢结合模式，也没有正确定向（“边上”）以形成阳离子–π与带电NH的相互作用_三⁺。观察到的VC0615对壳寡糖的偏好可能是由−1亚基结合囊外的因素引起的，例如与离开的+1糖的相互作用。