1.简介

细菌感染宿主的机制已被广泛报道。然而，细菌如何战略性地控制感染机制的生物合成，以及在感染成功建立后及时关闭耗能的感染过程，这在很大程度上尚不清楚。根癌农杆菌据报道，它是140多种植物中冠胆病（植物肿瘤的形成）的病原体，引起了农业界的高度关注（Moore等。, 1997). 农杆菌开始感染通过将细菌肿瘤诱导（Ti）质粒中的致癌T-DNA（转移DNA）整合到植物寄主的基因组中，这也使这种细菌病原体成为植物基因改造的有力工具（Gelvin，2003; Tzfira&Citovsky，2006年). 在我们的研究中，A.肿瘤被选为破译宿主-病原相互作用的实验模型。感染者A.肿瘤涉及许多毒力因子和伴随的植物衍生化学信号，如水杨酸（SA）、吲哚-3-乙酸（IAA）和quorum-sensing（QS）信号（Baron和Zambryski，1995; 谢弗罗等。, 2006; 元等。, 2007; 张等。, 2002; Liu&Nester，2006年). 据报道，这些信号在微调植物和细菌在感染期间不同时间点的反应中发挥着不同的作用（Klessig等。2000年; 苏布拉莫尼等。, 2014).

SA是一种特征鲜明的植物防御信号，用于响应不同的病原体（Delaney等。, 1994; 加夫尼等。, 1993; 佐蒂尼等。, 2007; 阿南德等。, 2008). 期间土壤杆菌感染时，SA可以抑制病毒基因与细菌生长（元等。, 2007; Gohlke&Deeken，2014年). 与其他植物衍生的化学信号（如IAA和细胞分裂素）不同，其生物合成基因携带在T-DNA中（因此，T-DNA的表达促进从头开始植物寄主中IAA和细胞分裂素的合成），在T-DNA中未发现SA生物合成的基因等。1987年; 黄星京等。, 2010; 线路接口单元等。, 1982). 相反，SA的及时释放是通过其存储共轭形式SA 2的酶水解进行的-O（运行）-β-天-葡萄糖苷（SAG）。有证据表明，SA的浓度在细菌感染初期较低，但在感染后期随着系统获得的抗性越来越强而急剧增加农杆菌属感染（艾伯特，2013; Gohlke&Deeken，2014年; 李等。, 2009). 内源性SA在后期的积累反过来与T-DNA整合和病毒基因表达（Albert，2013; 迪特等。, 2001; 维纳牌手表等。, 2003). 然而，如何在细菌感染期间及时调节SA水平仍然是个谜。

我们未发表的结果表明，一对新的蛋白质，SghA和SghR，来自A.肿瘤A6负责在农杆菌属感染，它独立于典型的病毒A/病毒G信号通路（Stachel&Zambryski，1986). 序列分析表明，SghA属于葡萄糖苷酶水解酶家族1。A类爆炸对PDB的搜索发现了几个同源结构，其中前两个是来自环状芽孢杆菌亚种。嗜碱性（PDB条目1个方框; 哈库林等。2000年)和来自的Tmbgl海洋热藻（PDB条目第1天; 齐切尔等。, 2003). 这两个蛋白与SghA的序列同源性分别为45.0%和43.0%。我们的功能研究表明，SghA特异性水解非活性SAG以释放活性SA，随后抑制其他SAG的表达病毒基因（病毒A、病毒D2、病毒E2等。)，最终避免了感染机器生物合成的耗能过程。此策略有助于农杆菌属定植并以自我控制的模式节省用于传播感染的能量。此外，我们在A.肿瘤A6，来自A.肿瘤C58，负调节sghA型在细菌感染的早期阶段通过与启动子区物理结合。SghR组装为包含N末端DNA结合域和C末端调节域的转录因子lacI家族的成员（Bell&Lewis，2000; 刘易斯等。, 1996; 刘易斯，2005). SghR与报告的lacI家族成员Atu1522（PDB条目）的序列比对3gv0; 纽约SGX结构基因组研究中心，未发表的工作）A.纤维菌株C58和Cagg_2268（PDB入口3亿英镑; 纽约SGX结构基因组研究中心。未发表的研究）分别给出了91.2%和25.7%的认同度。然而，Atu1522结构不包含N末端DNA结合域。实验表明，SghA和SghR都可以控制肿瘤生长农杆菌属感染和SghA在感染成功建立的后期发挥作用。在这里，我们报告了关于这两种新型毒力因子的初步数据，包括克隆、表达、纯化、结晶和数据收集。

2.材料和方法

2.1. SghA和SghR的克隆、表达和纯化

编码SghA和SghR的基因来自A.肿瘤使用SghA的引物5′-CCGTCGAGAGATGGATACGAAAGGGC-3′（正向）和5′-CGG­CTCGAGAAGCTCCACCCTTC-3′（反向）以及SghR的引物5'-CCGTCGA­GATACTGGTA­ATTCCG-3′（向前）和5'-CGCTCGAGGAGAGAGAAGGC-3′根癌A.tumefaciensA6基因组DNA作为PCR模板。表1列出了SghA和SghR的详细分子克隆信息和2分别是。将扩增的片段插入到表达载体pET-14b中。通过DNA测序验证重组质粒，然后将其转化为大肠杆菌BL21 CodonPlus（DE3）RIL细胞用于蛋白质表达。

表1 SghA的大分子生成信息 源生物 A.肿瘤 DNA来源 基因组DNA 正向底漆† CCG公司CTCGAG公司ATGGATGAAAGGGC公司 反向底漆† CCG公司CTCGAG公司AAAGCCTCACCCCTTC公司 克隆载体 pET-14b型 表达式向量 pET-14b型 表达式宿主 大肠杆菌BL21 CodonPlus（DE3）RIL 所产生结构的完整氨基酸序列‡ MGSSHHHHSSGLVPRGSH公司MLEMDDERAYPMTDHKALAARFPGDFLFGVATASFQIEGATKVDGRKPSIWDAFCNMPGHVFGRHNGDVACDHYNRWEDDLIKEMGVEAYRFSIAWPRIIIPDGFGPINEKGLDFYDRLVDGCKARGIKTYATLYHWDPLTLMGDGGWASRSAFQRYAKTVMARGDARDAVWATFNEPWCAVWLSHLYGIHAPGERNMEAALAAMHHINLAHGGFVEASRHVAPKVPVGLNAHSVIPASSDADMKAAERAFQFHNGAFFDPGEGEGEYPAEMIEALGSRMPVVEEDLSIISQLDWG LNYYTPMRVADDATEGAEFPATKQAPAVSDVKTDIGWEVYAPA公司LHSLVETLYERYELPDCYITENGACYNMGVENDQPRLDYYAEHLGIVADLVKDGYPMRGYYFAWSLMDNFEWAEGYRMRFGLVHVDYETQVRTLKNSGKWYSALASGFPKGNHGVMKG †XhoI限制场所下划线。 †通过克隆引入野生型SghA蛋白的额外氨基酸有下划线。此处列出的SghA蛋白的一级序列与Henkel报告的序列一致等。(2014).

表2 SghR的大分子生成信息 源生物 A.肿瘤 DNA来源 基因组DNA 正向底漆† CCG公司CTCGAG公司ATGAACGATACTGGTAATTCCG公司 反向底漆† CCG公司CTCGAG公司GCGTTCCTTCTATCAGG公司 克隆载体 pET-14b型 表达式向量 pET-14b型 表达式宿主 大肠杆菌BL21 CodonPlus（DE3）RIL 所产生结构的完整氨基酸序列‡ MGSSHHHHSSGLVPRGSH公司MNDTGNSGRDEAKATTGERPTLKTIAYMTGLGITTVSRALKDAPDIGAETKERVRLIAQIGYQPNRAGVRLRTGKTNVIALVLSVDEELMGFTSQMFGITEVLATTQYHLVVTPHTHAKDSMVPIRLETGSADGVII滑雪NDPRVRFMTERKMPFVTHGRSDMEHAYHDFDNEAYAYEAVERLAQCGRIAIVPPSRFAFHDHARKGFTRGIRDFGVSEFPLDAITIET PLDKIRDFGKRLMDDRGIVSISGSTIALVAGFEAAGVRIGKDIVSKIDIVSKSAEFLWIQFIH TVNEDIKLAGRELAKAKALLARINGAPPETLQSVSRPVWSSMAPK公司P（P） †XhoI限制场所下划线。 强调了通过克隆引入野生型SghR蛋白的额外氨基酸。此处列出的SghA蛋白的一级序列与Henkel报告的序列一致等。(2014).

对于SghA蛋白的大规模表达大肠杆菌BL21细胞在含有抗生素（100µg ml）的2×YT培养基中培养⁻¹氨苄西林和34µg ml⁻¹氯霉素）。当光学密度（外径₆₀₀)在细胞培养物中，添加0.5m可诱导蛋白表达M（M）异丙基β-天-16°C下的1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。诱导18小时后，通过离心（5000转/分钟）收获细胞⁻¹，30分钟，4°C）。将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中[50 mM（M）Tris–HCl pH值7.5，150 mM（M）氯化钠，20米M（M）咪唑，5米M（M） β-巯基乙醇(β-ME）]。用Panda disruptor（GEA Niro Soavi，意大利）溶解细胞悬浮液，并通过离心（22000转/分）澄清⁻¹，20分钟，4°C）。收集上清液并通过0.45µm Minisart过滤装置（Sartorius Biotech）过滤。随后，将过滤的上清液加载到5 ml Ni–NTA柱上（GE Healthcare），并以咪唑浓度线性梯度增加（0.02–0.5）进行洗脱M（M）). 在SDS-PAGE分析后，将含有目标蛋白的组分汇集在一起，并对50 mM（M）Tris–HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-ME）。样品通过阴离子交换进一步纯化色谱法带有HiTrap Q HP柱（GE Healthcare）。以NaCl浓度的线性梯度（0.05–1）进行洗脱M（M）)用SDS-PAGE分析。然后将目标蛋白汇集在一起，浓缩并加载到HiLoad Superdex 200 26/60凝胶过滤柱上，用50 m的缓冲液预平衡M（M）Tris–HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）三（2-羧乙基）磷（TCEP）。在柱洗脱和SDS-PAGE检查后，收集目标蛋白，浓缩至17 mg ml⁻¹，在液氮中闪速冷冻并储存在−80°C。

对于SghR蛋白制备，使用与SghA类似的方案采集细菌细胞。细胞重新悬浮并在50 m内溶解M（M）不₂人事军官₄pH值8.5，300 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-ME并通过离心澄清（22000转/分⁻¹，30分钟，4°C）。首先将样品加载到Ni–NTA亲和柱（GE Healthcare）上，然后用咪唑浓度线性梯度增加（0–0.5）进行洗脱M（M）). 通过SDS–PAGE检查后，将含有目标蛋白的组分合并、浓缩并加载到HiLoad Supderdex 200 26/60凝胶过滤柱上，预平衡50 mM（M）HEPES pH 7.0，50 mM（M）氯化钠，2米M（M）TCEP。洗脱目标蛋白，浓缩至6.4 mg ml⁻¹，在液氮中快速冷冻，并在−80°C下储存，用于后续实验。

3.结果和讨论

重组质粒pET-14b-SghA和pET-14b-SghR编码具有N末端His的相应靶蛋白₆标签。SghA的纯化包括三个色谱步骤（依次为Ni²⁺-亲和力、阴离子交换和凝胶过滤色谱）。与SghA相比，SghR:Ni的纯化采用了两个色谱步骤²⁺-亲和力和凝胶过滤色谱法。纯化的SghA和SghR蛋白均显示出高纯度（图1一和1b条)最终产量约为每升培养物50毫克蛋白质。值得注意的是，图1中的车道6只有细微的差异(一)和图1中的车道7(b条)从相应的镍亲和纯化。这一结果表明，镍亲和纯化后的蛋白质很纯，随后的阴离子交换或凝胶过滤色谱法基本上不能提高蛋白质纯度。来自凝胶过滤色谱法两种蛋白质的大小也似乎是其相应单体的两倍。为了验证这一点，使用HiLoad Superdex 200 10/300凝胶过滤柱和高分子量校准试剂盒（GE Healthcare）校准SghA和SghR的分子量。校准结果表明，这两种蛋白质确实以二聚体的形式存在于溶液中（图2).

图1 SghA的表达与纯化(一)和SghR(b条). (一)车道M（M），分子量标记（以kDa标记）；通道1和通道2，分别为细胞提取后的上清液和颗粒；通道3，Ni-NTA亲和结合后的流通；通道4和5，从Ni–NTA亲和柱洗脱后；通道6，凝胶过滤后纯化的SghA蛋白色谱法。(b条)车道M（M），分子量标记（以kDa标记）；通道1和2，分别为IPTG诱导前后的总细胞数；泳道3，Ni–NTA亲和结合后的流通；通道4和通道5，分别为细胞提取后的上清液和颗粒；通道6，从Ni–NTA纯化洗脱后；通道7，凝胶过滤色谱后纯化SghR。

图2 (一)标准校准曲线基于四种不同标准蛋白的对数（分子量）K（K）av（平均值）标准曲线上的圆和三角形分别表示SghR和SghA的位置（根据K（K）av（平均值）值）。(b条)凝胶过滤色谱法用于分子量校准的SghA（实线）和SghR（虚线）洗脱曲线。

结晶筛选和进一步优化分别产生了SghA和SghR的板状和棒状晶体（图3). 这两种晶体都是用其储存溶液彻底清洗后收获的。随后进行SDS-PAGE分离和质谱鉴定，结果表明结晶大分子分别是靶蛋白SghA和SghR。因此，进行了数据收集，并将收集的数据集处理为可接受的R（右）_合并完整性和〈我/σ(我)〉最高分辨率箱中的值（图4和表4). SghA和SghR晶体都属于空间组 P（P）2₁2₁2₁使用单位-细胞参数将SghA晶体的数据处理为1.9º分辨率一= 64.2,b条=80.4，c（c）=184.62 Au，而SghR晶体的数据处理为2.1 Au分辨率，单位-细胞参数一= 35.54,b条= 119.45,c（c）=121.94奥（表1).V（V）_M（M）计算表明，在非对称单元。根据我们的分子量校准结果，这两种蛋白质的晶体似乎在非对称单元。进一步的模型构建和结构精炼这两个结构都在进行中。

图3 SghA的水晶照片(一)和SghR(b条).

图4 SghA的衍射图案(一)和SghR(b条). 右侧面板是装箱区域的放大图。分辨率环是使用ADXV公司(https://www.scripps.edu/~arvai/adxv.html).

SghA被鉴定为一种新的毒力因子，通过控制SAG中活性SA的释放来抑制另一种SA的表达，从而关闭感染机制病毒感染后的基因已成功建立。其对SAG的酶特异性及其催化机制将通过基于当前晶体学数据和SghA的底物/产物结合形式的结构研究以及其他酶分析进一步研究。作为转录抑制物，SghR抑制sghA通过与启动子区物理结合，并在感受到环境刺激时抑制转录。通过测定SghR-效应物和SghR-DNA复合物，对SghR对SghA的调节机制的结构见解也在进行中。