1.简介

人类冠状病毒（HCoV）占人类上呼吸道感染的5-30%，也有报道称其与下呼吸道疾病和胃肠炎有关（张等。, 1994; Hamre&Procknow，1966年; 麦金托什等。, 1967). 冠状病毒是一种被包裹的、带有阳性标记的RNA病毒，属于该家族冠状病毒科按顺序病毒目，其中还包括动脉病毒科和轮状病毒科（卡瓦纳，1997年). 冠状病毒拥有RNA病毒中最大的基因组，其复制/转录机制尚不清楚（Sawicki&Sawicky，1995）; 戈尔巴莱尼亚，2001年). 基因组长度约为27 kbp，包含至少八个功能开放阅读框（ORF；Herold等。, 1993). 在这些ORF中，ORFs 1a和1b编码含有16种非结构蛋白的多聚蛋白1ab（Ziebuhr，2005）).

非结构蛋白15（nsp15）是ORF 1b的基因产物，已被鉴定为内核糖核酸酶（Bhardwaj等。, 2004). Nsp15是基因组中唯一的内核糖核酸酶，被认为是鸟巢病毒的主要“遗传标记”，因为它在其他RNA病毒（伊万诺夫病毒）中没有发现等。, 2004). Nsp15在病毒复制和转录中具有关键功能，尽管Nsp15在病毒周期中如何发挥作用尚不清楚（Bhardwaj等。, 2004; 伊万诺夫等。, 2004). 据报道，HCoV-229E的nsp15发生突变以阻止病毒RNA的积累，这表明nsp15在病毒感染（Ivanov）中起重要作用等。, 2004). 相关基因nsp15同源序列的突变动脉病毒还可以预防感染并减少亚基因RNA积累（死后等。, 2006).

同源nsp15s来自严重急性呼吸综合征冠状病毒（严重急性呼吸系统综合征冠状病毒）和小鼠肝炎病毒（MHV）与HCoV-229E的nsp15分别有42%和40%的序列同源性。这两个同源nsp15的晶体结构已经确定（Xu等。, 2006; 里卡诺干酪等。, 2006)，证明nsp15是由三聚体的二聚体形成的六聚体（PDB条目第2次和2小时85). 此外，SARS-CoV中单体nsp15的结构通过N末端结构域截断（PDB条目）确定2盎司; 约瑟夫等。, 2007). 六聚体被认为是完全活性形式，而单体由于缺乏RNA-结合能力而失去酶活性（Bhardwaj等。, 2004; 约瑟夫等。, 2007). 在以前对nsp15的研究中，尽管进行了一些定点突变，三聚体只存在于六聚体和单体之间的过渡状态。以前没有获得稳定的三聚体nsp15；因此，其结构和酶活性尚未见报道（里卡诺等。, 2006; 约瑟夫等。, 2007; 徐等。, 2006). 在本工作中，通过将Ile26和Asn52突变为丙氨酸，成功地从HCoV-229E中获得了三聚nsp15，并描述了该三聚nsp15的表达、纯化、结晶和初步的X射线衍射研究。

2.材料和方法

2.1. 高分子生产

使用正向引物5′-ACCGG通过PCR扩增编码HCoV-229E nsp15的完整基因片段GGATCC公司GGTTTGAGAACATTGCT-3′（BamHI位点下划线）和反向引物5′-ACCTGCTCGAG公司TCACTGCAACTGGATAGAA-3′（XhoI场地下划线）。用BamHI和XhoI消化得到的PCR产物，并将其克隆到pGEX-6p-1载体中（GE Healthcare；表1). 利用中华人民共和国Transgen突变试剂盒通过PCR获得突变体的质粒。通过DNA测序（AuGCT，中华人民共和国）证实了构建物的有效性。大肠杆菌携带重组质粒的Rosetta（DE3）细胞（Novagen）生长到OD₆₀₀在含有100 mg l的1 l Luria–Bertani肉汤（LB）培养基中为0.6⁻¹用0.5m诱导野生型（wt）nsp15（或突变体）的表达M（M）异丙基β-D类-289 K下过夜的1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。细胞在5000℃离心收集克将收集到的细胞糊重新悬浮在由20 m组成的裂解缓冲液中20 minM（M）HEPES pH值7.5500 mM（M）氯化钠，5米M（M）二硫苏糖醇（DTT）被超声波破坏。所得细胞悬浮液在18000℃下离心克在4°C下放置40分钟，将上清液涂在谷胱甘肽-脑葡萄糖FF柱（GE Healthcare）上，用裂解缓冲液进行预平衡。用裂解缓冲液洗涤未结合的蛋白质。GST标签用10单位ml消化⁻¹277 K下过夜的PreScission蛋白酶（GE Healthcare）。收集流通部分中的裂解蛋白质，并在Superdex 200 10/300 GL柱（GE Healthcare）上进一步纯化，该柱按照以下分子质量标准进行校准：蓝色右旋糖酐2000（2 MDa）、甲状腺球蛋白（660000 Da）、铁蛋白（440000 Da），过氧化氢酶（232000 Da000 Da）和糜蛋白酶原（25000 Da）。洗脱部分与20 ml储备缓冲液（20 m）混合M（M）HEPES pH 7.5，150 mM（M）氯化钠，5米M（M）镁²⁺)蛋白质被超滤到8毫克毫升⁻¹用于后续结晶。蛋白质的纯度由12.0%SDS–PAGE监测，然后用考马斯亮蓝染色（图1). 通过测量280nm处的紫外吸收度来估计蛋白质的浓度；所用吸光度系数为1.22。

表1 大分子生产信息 源生物 HCoV-229E（GenBank登录号KF293664.1） DNA来源 质粒 正向底漆† ACCGG公司GGATCC公司GGTTTGAGAACATTGCTT公司 反向底漆‡ ACCTG公司CTCGAG公司TCACTGCACTGAGGATAGAA公司 克隆载体 pGEX-6p-1型 表达式向量 pGEX-6p-1型 表达式宿主 大肠杆菌罗塞塔（DE3） 产生的构建体的完整氨基酸序列§ GPLGS公司GLENIAFNVNKGSFVGADGELPVAASGDVFVRDGNTDNLVFVNKTSLPTAIAFELFAKRKVGLTPPLSILKNVVATYKFVLWD年PLTSFTKSVCGYTDFEEDVCTCYDNSIQGSYERFTSTALFSATAVKTGKSLPAIKLNFGMLNGNAIAATVKSEDGNINWFYVRKDGKPVDHYDGFYTQGRNLQDFLPRSTMEDFLNMDIGVIQKYGLEDFNFEVYGDVSKTTLGLHLLISQLSKMGILKAEFAVAATYLKTYLKCTYLNDPKT VCTYMDLLLDDFVSVLKSLDLTVVSKVHEVIIDNKPWRWMLWCKDNAVATFYPQLQ公司 †BamHI现场下划线。 XhoI站点下划线。 §来自表达载体的非阳性残基下划线。

图1 用于结晶试验的纯化nsp15突变体的12%SDS-PAGE。分子量标记以kDa为单位进行标记。

2.2. 结晶

在289 K的温度下，采用坐滴蒸发扩散法，在48个平板（XtalQuest）中，使用汉普顿研究公司的商用筛选工具Crystal Screen和Index以及翡翠生物公司的Wizard I、II、III和IV，进行初始结晶试验。每个结晶滴由1µl蛋白质溶液和1µl蛋白质溶液组成µl储层溶液，并与100µl的储层溶液进行平衡。在含有PEG 3350的几种条件下，在1d内生成了小晶体。在289K下，使用悬挂滴气相扩散法进一步手动优化PEG 3380的浓度。用于衍射的晶体在0.2M（M）柠檬酸钠三元脱水剂，pH 8.5，15%(w个/v（v）)PEG 3350（图2; 表2).

表2 结晶 方法 悬挂式蒸汽扩散 板材类型 16孔结晶板（Nunclon） 温度（K） 289 蛋白质浓度（mg ml−1) 8 蛋白质溶液的缓冲液成分 20米M（M）HEPES pH 7.5，150 mM（M）氯化钠，5米M（M）镁2+ 储层溶液的组成 0.2 M（M）柠檬酸钠三元脱水剂，pH 8.5，15%(w个/v（v）)聚乙二醇3350 跌落体积和比率 1.0微升+1.0微升 储液罐容积（µl） 200

图2 nsp15 I26A/N52A突变体的晶体。标尺长度为200µm。

2.3. 数据收集和处理

在光束线17U（100 K，λ=0.918Ω），位于中华人民共和国上海同步辐射设施（SSRF）。含20%的储层溶液(v（v）/v（v）)甘油被用作低温保护剂，晶体在冷N中闪蒸冷却₂气流。每幅图像使用0.5°振动采集数据，晶体到探测器的距离为250 mm。共记录360帧，每帧曝光0.4秒。数据被处理到2.5Å的分辨率（图3)使用香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）). 这些晶体属于空间组 C类222₁，带有单位-细胞参数一 = 85.9,b条= 137.5,c = 423.1 Å,α=β=γ= 90°. 表3总结了nsp15突变体的数据收集统计数据.

表3 数据收集和处理 括号中的值用于外壳。 衍射光源 光束线17U，SSRF 波长（Ω） 0.918 温度（K） 100 探测器 ADSC Q315r公司 晶体到探测器的距离（mm） 250 每张图像的旋转范围（°） 0.5 总旋转范围（°） 180 每张图像的曝光时间（s） 0.4 “空间”组 C类2221 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 85.9,b条= 137.5,c= 423.1,α=β=γ= 90 镶嵌度（°） 0.46 分辨率范围（Ω） 50.00–2.50 (2.54–2.50) 反射总数 459383 独特反射次数 89338 完整性（%） 99.7 (99.7) 多重性 5.1 (5.4) 〈我/σ(我)〉 14.7 (4.1) R（右）合并†(%) 11.4 (42.9) †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是我第th次反射观测香港特别行政区和〈我(香港特别行政区)〉是平均强度。

图3 样品X射线衍射图像。(一)分辨率用黑色圆圈表示。(b条)放大图显示了高分辨率光环（2.5°）周围的斑点。

3.结果和讨论

为了更好地了解HCoV-229E中nsp15的结构和组装，对wt-nsp15和几个突变体进行了研究。根据SARS-CoV和MHV同源nsp15的结构分析，获得突变体。突变体为I26A、I26A/N52A和L2A/E3A，均集中于三聚体间相互作用的关键残基。它们表达于大肠杆菌并提纯至同质性通过谷胱甘肽亲和力柱色谱法和尺寸排除色谱法。这个尺寸排除色谱法表明nsp15 I26A/N52A突变体以三聚体形式存在，洗脱约13.0 ml。然而，根据洗脱约11.8 ml判断，其他两个突变体未能破坏六聚体的形成，这是六聚体代表（图4). 对于SARS-CoV和MHV，两个尺寸排除色谱法峰值表明其nsp15蛋白形成六聚体和单体（Ricagno等。, 2006; 徐等。, 2006). 尽管进行了一些突变以试图破坏SARS-CoV中nsp15的三聚体-三聚体相互作用，但只能观察到单体而不是三聚体（Bhardwaj等。, 2008). 这里，HCoV-229E nsp15突变体I26A/N52A产生三聚体nsp15，并且这种三聚体形式也通过分析超速离心得到证实（图5). 三聚体nsp15表明，Ille26和Asn52之间的相互作用对六聚体的形成至关重要。此外，稳定三聚体的产生是进一步研究其结构和酶活性的前提。

图4 wt nsp15和I26A、I26A/N52A和L2A/E3A突变体的尺寸排除色谱。

图5 分析超速离心的结果。有效峰对应于三聚体的分子量（114 kDa=38 kDa×3）。

三聚体nsp15晶体衍射到2.5º分辨率，属于空间组 C类222₁，带有单位-细胞参数一= 85.9,b条= 137.5,c= 423.1 Å,α=β=γ= 90°. 晶体中含有两个三聚体非对称单元，用一个V（V）_M（M）2.60Ω的值^三 Da公司⁻¹溶剂含量为52.75%。通过以下方法获得结构解分子置换使用相位器（特威利格，2001年); 使用的搜索模板是来自SARS-CoV（PDB条目）的三聚体nsp15模型第2次). 根据初始阶段，有两个三聚体，而不是六聚体，填充在非对称单元以面对面的方式。进一步精炼模型制作正在进行中。wt nsp15的结晶条件也在优化过程中。