2.1. 蛋白质和药物制剂

带有N末端His的重组蛋白构建物catPARP1₆标签，生成于大肠杆菌BL21（DE3）。catPARP1 DNA插入，对应于催化域将人PARP1（残基662-1011）亚克隆到pET-28a（Novagen）中通过 Nde公司我/Xho公司I限制性位点，产生人工N末端氨基酸MGSSHHHHSSGLVPRGSHM。当到达光学密度（外径₆₀₀)0.5–0.8，在室温下，在Terrific Broth培养基中通过添加0.4诱导catPARP1蛋白表达过夜 米M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。8.1中通过超声波进行细胞裂解 米M（M）纳₂高性能操作₄, 1.5 米M（M）赫₂人事军官₄，138 米M（M）氯化钠，2.7 米M（M）KCl与EDTA游离蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific），catPARP1蛋白首先使用HiTra Ni纯化²⁺-螯合HP柱（GE Healthcare）梯度洗脱第页，共10–250页 米M（M）咪唑在20 米M（M）NaPO公司₄, 500 米M（M）NaCl pH 7.5，然后使用HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR凝胶过滤柱（GE Healthcare）。蛋白质纯度和配体结合活性（沈等。, 2013)分别通过SDS-PAGE和Biacore分析确认。25中纯化的catPARP1 米M（M）三氯化氢，140 米M（M）氯化钠，3 米M（M）KCl pH 7.4储存在−80°C。

一种重组catPARP2蛋白，对应于人类PARP2催化域带有N末端His的（残基235–579）₆标签，如文献所述（卡尔伯格，哈马斯特罗姆等。, 2010; 勒赫蒂（Lehtiö）等。, 2009)经过修改。简言之，catPARP2蛋白在大肠杆菌纯化T7 Express（新英格兰生物实验室）通过三个色谱步骤：HiTrap Ni²⁺-螯合（GE Healthcare），POROS 50 HQ阴离子交换（Applied Biosystems）和HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR凝胶过滤（GE Healthcare）。catPARP2蛋白从Ni中洗脱²⁺-线性螯合柱梯度洗脱第页，共10–500页 米M（M）咪唑在20 米M（M）HEPES，500个 米M（M）氯化钠、10%甘油、0.5 米M（M）三（2-羧乙基）膦（TCEP）pH 7.5。POROS HQ柱步骤以25–500的线性洗脱梯度进行 米M（M）25中的NaCl 米M（M）三-盐酸，0.5 米M（M）TCEP pH值7.8。纯化的catPARP2储存在20 米M（M）HEPES，300型 米M（M）氯化钠、10%甘油、1.5 米M（M）−80°C时的TCEP。

BMN 673的合成已在其他地方进行了描述（Wang和Chu，2011; 王等。, 2012).

2.2. 结晶和数据收集

所有结晶实验都是在16°C下通过蒸汽扩散进行的。catPARP1–BMN 673复合物的正交晶体在2.1的存在下生长 M（M）硫酸铵，0.1 M（M）Tris–HCl pH 7.2–8.0，25%低温保护(v（v）/v（v）)甘油和液氮闪冷。衍射数据（表1)在先进光源的光束线5.0.3上采集，并使用扩展数据集（卡布施，2010年).

表1 结晶数据和精细化统计学 括号中的值用于外壳。   catPARP1–BMN 673（PDB条目第4页) catPARP2–BMN 673（PDB条目4pjv型) 数据收集和处理  波长（Ω） 0.9765 1.0970  温度（°C） −173 −173  探测器 ADSC Quantum 315R公司 ADSC Quantum 315R公司  晶体到探测器的距离（mm） 290 250  每张图像的旋转范围（°） 1 1  总旋转范围（°） 180 180  “空间”组 P（P）212121 P（P）1  一,b条,c（c）(Å) 103.69, 108.15, 142.00 52.86, 57.74, 69.29  α,β,γ(°) 90.00, 90.00, 90.00 77.28, 79.99, 63.88  分辨率范围（Ω） 19.94–2.35 (2.40–2.35) 67.33–2.50 (2.56–2.50)  反射总数 459985 45124  独特反射次数 66890 22773  完整性（%） 99.6 (99.4) 91.9 (91.3)  多重性 6.9 (6.4) 2.0 (2.0)  〈我/σ(我)〉† 17.4（3.8） 7.0 (1.8)  R（右）合并‡ 0.08 (0.48) 0.12 (0.46) 改进和验证  反射，工作集 63499 22773  反射，测试集 3387 1150  分辨率范围（Ω） 19.94–2.35 67.33–2.50  R（右）工作§/R（右）自由的¶ 0.190/0.228 0.214/0.287  非H原子数量   蛋白质 10190 5114   配体 205 74   水 316 143  平均值B类因子（λ2)   威尔逊B类因素 43.4 25.7   蛋白质 42.9 21.3   配体 40.5 10   水 36.2 10.9  R.m.s.d.，粘结长度（Ω） 0.012 0.011  R.m.s.d.，粘结角（°） 1.461 1.467  拉马钱德兰阴谋   异常值（%） 0.1 0   支持（%） 99.2 98.3 †平均信噪比。 ‡R（右）合并=. §R（右）工作=，其中F类光突发事件和F类计算分别是观测到的和计算得到的结构因子。 ¶5%的反射被随机放置R（右）自由的计算。

catPARP2–BMN 673复合物用30%结晶(w个/v（v）)聚乙二醇3350，0.25–0.33 M（M）氯化钠，0.1 M（M）Tris–HCl pH 8.5–9.1作为沉淀剂。然后将晶体冷冻25%(v（v）/v（v）)甘油，然后在液氮中闪蒸冷却。在斯坦福同步辐射光源的光束线7-1上收集衍射数据并进行处理（表1)如上所述。

2.3.结构确定和精细化

catPARP1–BMN 673复合物的结构通过以下公式求解分子置换使用已发布的catPARP1结构（PDB条目1000万和313万; 木下等。, 2004; 彭宁等。, 2010)作为搜索模型使用相位器（麦考伊等。, 2007). catPARP1–BMN 673复合物的初始模型，由晶体中的四个单体组成非对称单元，在中通过几个手动模型重建周期进行了优化库特（埃姆斯利等。，2010年)和精细化在里面REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)使用TLS和非晶体对称性约束。最终数据收集统计精细化和验证人摩尔概率（陈）等。, 2010)总结见表1.

catPARP2–BMN 673复合物结构用相同的方法进行了求解和细化，但有少数例外。catPARP2结构（PDB条目3千赫兹; 哈马斯特罗姆·卡尔伯格等。, 2010)在中用作模板分子替换。catPARP2–BMN 673晶体属于空间组 P（P）1，每个含有两个单体不对称单元。数据收集和结构的进一步详细信息精细化如表1所示.

2.4. 结构分析和可视化

教育部(分子操作环境; 加拿大蒙特利尔化学计算集团），库特（Emsley和Cowtan，2004年)和PyMOL公司（薛定谔；https://www.pymol.org)用于结构分析和对齐以及生成图形。

3.1. 整体结构

与BMN 673结合的catPARP1的晶体结构得到解决并细化至2.35 分辨率（表1). 正如预期的那样，这些结构包括α-螺旋N端域和混合α/βC末端ADP-核糖基转移酶结构域（图2一)与其他地方描述的其他catPARP1结构（基诺希塔等。, 2004; 伊瓦西塔等。, 2005; 公园等。, 2010). C的平均成对根平方偏差（r.m.s.d.）^α这四种单体中的原子数为0.73 Å（图2一). 成对的C^α这四份拷贝的相对分子置换搜索模型（PDB条目313万; 彭宁等。, 2010)也在0.62–0.93范围内 Å. 几个catPARP1区域，靠近残基Gln722–Ser725、Phe744–Pro749、Gly780–Lys787和Lys1010–Thr1011，在结构中无序，并与弱电子密度或缺失电子密度相关（图2一). 如其他catPARP1结构（Ye等。, 2013)，沉淀剂中的硫酸根离子结合在受体-底物聚（ADP-核糖）（Ruf等。, 1998). 有趣的是，我们的晶体结构意外地显示出两种不同单体的Cys845残基形成的分子间二硫化物（数据未显示）。观察到的二硫键很可能是非还原结晶条件产生的实验伪影。更重要的是，这些二硫化物位于蛋白质表面并远离（>20 o）从绑定BMN 673的活动站点。

图2 catPARP1和catPARP2与BMN 673的配合物的共晶体结构。(一)非晶体学对称相关分子叠加在与BMN 673相互作用的保守口袋残基上。(b条)F类o个−F类c（c）OMIT电子密度图（等高线为2σ)烟酰胺结合位点的BMN 673。

这个共晶catPARP2–BMN 673的结构，求解并细化至2.5 分辨率（表1和图2一)，显示出与catPARP1/2结构高度同源的整体结构（Kinoshita等。, 2004; 伊瓦西塔等。, 2005; 公园等。, 2010; 哈马斯特罗姆·卡尔伯格等。, 2010). 平均成对r.m.s.d.（C上^α原子）0.43 计算catPARP2结构和搜索模型（PDB条目3千赫兹; 哈马斯特罗姆·卡尔伯格等。, 2010)，与0.39的r.m.s.d.相当 在我们的两个非晶体学对称性相关分子之间获得的λ（图2一). 最终catPARP2模型中具有弱电子密度的无序区域包括残基Arg290–Gly295、Thr349–Glu355和Asn548–Asp550（图2一). 平均两两C^α1.15的有效值 ？表示catPARP1和catPARP2之间的整体结构相似性不受BMN 673结合的干扰（图2一).

3.2、。BMN 673与catPARP1的结合

BMN 673在catPARP1烟酰胺结合袋中结合通过广泛的氢键和π-叠加相互作用。定义明确的电子密度（图2b条)允许明确指定袋中BMN 673的方向（图2一)，由碱基（PARP1中的Arg857–Gln875）、壁（Ile895–Cys908）、盖（D-环；Gly876–Gly894）组成（沃尔伯格等。, 2012; 斯特芬等。, 2013)和预测的催化残留物Glu988（Ruf等。, 1998). 几个N-末端螺旋束残基(αF；Ala755–Arg779）也排列在装订袋的外边缘。BMN 673与catPARP1的结合作用大致可分为两部分：（i）在口袋底部与抑制剂的烟酰胺类部分形成的保守作用，以及（i）口袋外边缘与抑制剂的新型双支化支架形成的独特作用。

BMN 673的核心三环基团系在装订袋的底部通过守恒堆积和氢键相互作用。环酰胺部分，常见于许多已知PARP抑制剂中（Ferraris，2010)，与Gly863主链和Ser904侧链羟基原子形成氢键（图3一). 三环核心系统的氟取代环紧靠由Ala898和Lys903形成的小口袋。结合的BMN 673被诸如Tyr907、Tyr896和His862等芳香残基包围；特别是，BMN 673形成了π-与附近Tyr907的叠加相互作用（～3.6 Å; 图3一). 此外，来自不饱和六元环系统的N原子（N7）参与了与Glu988的水介导氢键（图3一)与之前观察到的与苯并咪唑N原子（Penning）的水介导相互作用类似等。, 2008). 事实上，这些分子相互作用将BMN 673锚定在NAD的基础上⁺-结合囊代表了迄今为止描述的许多PARP1/2抑制剂共同的成熟结合特征（Ferraris，2010).

图3 BMN 673的绑定模式。(一)复杂的氢键网络（虚线）和π-BMN 673和活性位点残基（catPARP1–BMN 67三链）之间形成的堆叠相互作用D类和catPARP2–BMN 673链条A类). BMN 673的新型双取代支架与溶剂分子和扩展的袋状残基发生了独特的相互作用。(b条)BMN 673在不太保守区域的结合相互作用：N端螺旋结构域(αF） 和D环路。

除了上述相对保守的抑制剂结合相互作用外，BMN 673具有独特的立体定向双取代[8S公司-(第页-氟苯基），9R（右）-三唑]支架，在结合囊的外缘与有序水分子和残留物形成了一些前所未有的相互作用（图3一). 首先，三唑取代基中的N原子（N4）参与与Tyr896的主链酰胺的水介导氢键相互作用（图3一). 这种氢键相互作用似乎使三唑环相对于结合囊中剩余的抑制剂结构定向。三唑环部分也形成H–π与水分子的相互作用，水分子在抑制剂的酞菁酮系统中与N原子（N1）氢键结合。第二个取代基，一个8S公司-(第页-氟苯基）基团，形式π-与Tyr889的堆叠相互作用（图3一). 此外，氟苯基环形成H–π与附近的水分子相互作用，水分子又与Met890主链酰胺氢键结合。复杂的氢键网络和π-BMN673、水分子和扩展的结合囊残基之间的堆积相互作用解释了立体特异性抑制活性；BMN 673在抑制PARP1方面的效力是其的250倍以上对映体（沈）等。, 2013). BMN 673代表了一类新的手性PARP1/2抑制剂，其立体特异性适合于NAD盖子附近以前未探索的配体结合空间⁺-装订袋。

3.3、。BMN 673与catPARP2的结合

从整体和活性位点结构相似性来看，BMN 673结合catPARP2烟酰胺识别站点与catPARP1站点所述模式类似（图3一). 简言之，BMN 673的酰胺核心固定在catPARP2 NAD的基础上⁺-装订口袋通过典型的氢键相互作用（Ferraris，2010)涉及Gly429和Ser470（图3一). BMN 673的三环核上的氟取代基对位于口袋周围的壁上的Ala464和Lys469进行包封。结合的BMN 673还被口袋中的保守芳香残基Tyr473、Tyr462和His428夹住（图3一). 有序活性位水分子介导与结合BMN 673的氢键合和堆叠相互作用。最后，BMN 673在8和9个位置上独特的立体特异性双取代部分延伸到结合囊的外边缘，形成π-与Tyr455的堆叠相互作用，当结合到catPARP1活性位点时观察到（图3一). 有趣的是，NAD的外边缘⁺-结合囊由catPARP2和catPARP1之间保存最少的残基组成。

3.4. BMN 673结合位点中的非合格残留物

在抑制剂结合囊的外边界，两种PARP蛋白活性位点开口处的N末端螺旋束和D环中的轻微残留差异值得注意（图3b条)尤其是与其他高度保守的活性位点相比。当与PARP2结合时，BMN 673的三唑部分的甲基指向N端螺旋束上的Gln332；在PARP1中，相同的甲基面对高度流动的Glu763，Glu762在非晶体对称性相关分子中具有不同的侧链构象。PARP2特异性Ser328也位于N端螺旋束上，靠近BMN 673的氟苯基取代基；在PARP1中，具有多个侧链配置的高度灵活的Gln759占据了相应的位置。在PARP2 D-loop中，Tyr455π-含有BMN 673氟苯基的堆垛通过直接氢键与N端螺旋束上的Glu335结合来稳定（图3b条). 在结合氟苯基附近的PARP1 D环上，相应的残基Tyr889距离太远，无法与相应但较短的Asp766直接相互作用。因此，BMN 673的双支化结构延伸到最不保守的外部活性位点边界，可能为提高抑制剂选择性提供新的机会。