Carboplatin binding to histidine

Tanley, S.W.M.; Diederichs, K.; Kroon-Batenburg, L.M.J.; Levy, C.; Schreurs, A.M.M.; Helliwell, J.R.

doi:10.1107/S2053230X14016161

结构通信

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第70卷| 第9部分| 2014年9月| 第1135-1142页

doi:10.1107/S2053230X14016161

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卡铂与组氨酸结合

西蒙·W·M·坦利,^一 Kay Diederichs公司,^b条 Loes M.J.Kroon-Batenburg先生,^c 科林·利维,^d日安托万·M·M·施勒 ^c和约翰·赫利维尔 ^一 ^*

^一英国曼彻斯特M13 9PL不伦瑞克街曼彻斯特大学工程与物理学院化学学院，^b条德国康斯坦茨D-78457康斯坦茨大学生物系，^c晶体和结构化学，乌得勒支大学科学院Bijvoet生物分子研究中心，Padualaan 8，3584 CH Utrecht，Netherlands，和^d日英国曼彻斯特M1 7DN公主街131号曼彻斯特大学曼彻斯特生物技术学院（MIB）
^*通信电子邮件：john.helliwell@manchester.ac.uk

(2014年4月2日收到； 2014年7月11日接受；在线2014年8月29日)

卡铂是用于治疗多种癌症的第二代铂抗癌药。先前对卡铂与组氨酸结合的X射线晶体学研究（在鸡蛋白溶菌酶中；HEWL）表明，由于结晶条件中使用的氯化钠浓度较高，卡铂部分转化为顺铂。现已在NaBr条件下与卡铂进行HEWL共结晶，以确认卡铂是否转化为溴形式，以及这是否与之前在NaCl条件下观察到的卡铂部分转化为顺铂的方式类似。这里，有报道称发生了部分化学转化，但转化为反拉丁形式。因此，为了试图解决组氨酸与卡铂的纯结合，本研究利用HEWL与不含NaCl的卡铂共结晶来消除卡铂的部分化学转化。在四种不同的条件下，分别在不同的pH值下，成功地获得了与卡铂共结晶的四方HEWL晶体。获得的结构结果表明，卡铂与HEWL的His15的一个或两个N原子结合，这种特殊变化取决于结晶混合物中阴离子的浓度、经过的时间以及所用的pH值。结合卡铂分子的结构细节在它们之间也有所不同。总的来说，最详细的晶体结构显示大多数卡铂原子与铂中心结合；然而，环丁烷二羧酸部分（CBDC）的四碳环结构仍然难以捉摸。本文描述了卡铂作为抗癌药物给药结果的潜在影响。

关键词：卡铂;组氨酸;避免部分转化为顺铂;NaBr结晶条件;非NaCl结晶条件;模型蛋白（鸡蛋白溶菌酶）.

PDB参考：在MPD条件下HEWL与卡铂共结晶：晶体1使用EVAL公司软件包，4lt0;在0.9163 Au，4nsf的X射线波长下研究了溴化钠结晶条件下卡铂与HEWL的结合;在MPD条件下HEWL与卡铂共结晶：晶体2使用XDS公司软件包，4lt3;在pH 5.6、4nsi条件下，在20%丙醇、20%聚乙二醇4000中卡铂与HEWL结合;在1.5418Å，4nsg的X射线波长下研究的NaBr结晶条件下卡铂与HEWL的结合;0.2中卡铂与HEWL结合M（M）硫酸铵，0.1M（M）pH 4.6，4nsh，25%PEG 4000中的醋酸钠;卡铂与HEWL结合2M（M）甲酸铵，0.1M（M）pH 7.5，4nsj下的HEPES

1.简介

顺铂和卡铂是铂类抗癌药物，长期以来通过靶向DNA用于抗癌。然而，他们报告的90%的结合案例是与血浆蛋白（费舍尔等。, 2008 ). 因此，这些药物会产生毒性副作用。顺铂迅速转化为具有肾毒性作用的有毒代谢物（Zhang&Lindup，1996）; 胡利契亚克等。, 2012 )，而卡铂由于添加而毒性较小（图1)环丁烷二羧酸部分（CBDC），其转化率较慢。因此，与顺铂相比，患者可以耐受更高剂量的卡铂（Kostova，2006）).

图1
顺铂和卡铂的化学图。

这个晶体结构卡铂本身的含量已经测定（比格利等。, 1985 )其中一个环丁烷C原子表现出过度的热运动，这被解释为动态折叠环。我们基于这项工作和对卡西尼的研究等。(2007 )，其中报告了晶体结构顺铂与蛋清溶菌酶（HEWL）的结合，显示一个顺铂与His15结合。卡西尼等。(2007)还报道了顺铂和卡铂与HEWL结合的质谱数据。顺铂与超氧化物歧化酶（Calderone）组氨酸残基结合的结构等。, 2006 ; 卡西尼等。, 2008 )和细胞色素c（卡西尼等。, 2006 )也已确定。我们对顺铂与模型蛋白HEWL的X射线晶体学研究表明，在二甲基亚砜（DMSO）介质中，两个分子与其His15残基结合（Tanley，Schreurs，Kroon-Batenburg&Helliwell，2012）; Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg、Meredith等。, 2012 ; Helliwell&Tanley，2013年 )甚至在没有二甲基亚砜的水性介质中长时间暴露后（Tanley，Schreurs，Kroon-Batenburg&Helliwell等。, 2012). 随后，通过乌得勒支大学（Tanley，Schreurs）原始衍射图像的公共存档等。, 2013 ;https://rawdata.chem.uu.nl/#0001;https://rawdata.chem.uu.nl/#0002)，现在也反映在澳大利亚的Tardis Raw数据存档中(https://vera183.its.monash.edu.au/experiment/view/40（网址：https://vera183.its.monash.edu.au/experiment/view/40）/)，与本文的作者之一（KD）建立了合作关系，他下载并重新处理了曼彻斯特大学用XDS公司软件包（Kabsch，2010 )与我们之前的结果进行比较。回顾这些结果以及我们之前发表的在低温和室温下研究的DMSO培养基中卡铂结合结构（Tanley，Schreurs，Kroon-Batenburg&Helliwell，2012）; Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg、Meredith等。, 2012; PDB条目第4天7,第4天9和4g4c（四国集团）)注意到在卡铂结合位点（Tanley，Diederichs等。, 2013 一). 这表明，在结晶条件中使用的高NaCl浓度下（Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg和Helliwell，2012）; Tanley、Schrers、Kroon Batenburg、Meredith等。, 2012; Helliwell&Tanley，2013年)卡铂可以部分转化为顺铂，这种异常差异密度是由于顺铂的氯原子引起的。之前在溶液中观察到卡铂的部分转化（Gust&Schnurr，1999）). 由于这些新发现，His15结合位点可能包含卡铂和顺铂的混合物，而不仅仅是纯卡铂分子。

根据这些发现（Tanley，Diederichs等。, 2013一)由于共享了原始衍射数据图像，我们现在报告了HEWL和卡铂在NaBr条件下的共结晶，其中预期的两个溴应该比两个部分被占据的氯更容易看到。我们还研究了HEWL与卡铂在非盐溶液中的结晶，即NaCl和NaBr都不能完全消除卡铂转化为氯或溴形式的可能性。再次，我们能够在之前一项非常有用的研究的基础上进行构建（Weiss等。, 2000 )在pH 8.0的75%MPD中结晶HEWL。此外，我们进行了广泛的调查，调查了汉普顿研究所的48种不同的非氯化钠结晶条件（补充表S1¹)目的是找到各种条件和pH值，以确定在结晶混合物中不存在这些盐离子的情况下，哪种条件能提供卡铂分子的最佳详细结合位点。我们还对Sigma提供的HEWL进行了元素分析，以检查氯化物含量。

2.方法

2.1. 结晶条件

2.1.1. 溴化钠

在Dauter&Dauter（1999）发表的类似条件下，在NaBr溶液中进行HEWL与卡铂的共结晶 )和Lim等。(1998 )但共结晶20mg ml⁻¹在75µl二甲基亚砜中加入1.4 mg卡铂的HEWL，462.5µl 0.1M（M）醋酸钠，462.5µl 1M（M）NaBr溶液。

2.1.2. 无NaCl或NaBr的条件

20毫克HEWL（0.6米M（M）)溶于1ml蒸馏水中。1.4 mg卡铂（1.8 mM（M）)在蛋白质上添加三倍摩尔过量的二甲基亚砜，并混合，直到所有卡铂溶解。设置了来自Hampton Research的48个晶体屏幕（在补充表S1中列出）；这些包括2µl蛋白质/卡铂/DMSO溶液等分试样，每个等分试样与2µl贮存溶液混合，并用1 ml贮存溶液设置为悬滴结晶。结晶托盘在室温下放置，产生详细结构结果的晶体如下所述，在条件（i）65%MPD和0.1M（M）pH 4.0（ii）0.2的柠檬酸缓冲液M（M）硫酸铵，0.1M（M）pH 4.6，（iii）0.1，25%PEG 4000中的醋酸钠M（M）柠檬酸钠、20%丙醇、20%聚乙二醇4000，pH 5.6和（iv）2M（M）甲酸铵，0.1M（M）pH值为7.5的HEPES。

2.1.3. 其他非NaCl或NaBr条件

除§2.1.2，晶体也在以下条件下生长：（i）0.1M（M）咪唑，1M（M）醋酸钠pH 4.6，（ii）20%杰夫明500，0.1M（M）HEPES pH值7.5和（iii）0.1M（M）Na HEPES，0.8M（M）酒石酸钠钾。这表明卡铂没有结合。

2.1.4. 西格玛HEWL冻干粉的元素分析

对从Sigma采购的冻干HEWL粉末的氯化物含量进行元素分析，结果表明存在2.6%的氯。为了结晶，将20 mg HEWL溶解在1 ml水中，并使用2µl等分溶液建立悬滴结晶。因此，从2.6%的氯开始，我们每个结晶液滴条件下的氯百分比约为0.005%。因此，这远远低于10%（1.4M（M）)之前结晶条件中使用的氯化钠溶液（Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg和Helliwell，2012）; Tanley、Schrers、Kroon Batenburg、Meredith等。, 2012; Helliwell&Tanley，2013年)表明不会有明显的顺铂转化。

2.2. X射线衍射数据采集、蛋白质结构解算和模型精化

每个晶体都用硅油作为冷冻保护剂舀入一个环中。所有的X射线衍射（XRD）数据都是在Bruker APEX II家用源衍射仪上以1.5418Å的X射线波长测量的，除了一种NaBr生长的晶体，从中在钻石光源（DLS）的光束线I04上以0.9163Å的X射线波长收集XRD数据；即Br的短波长侧K（K）边缘。在100至127 K的固定温度下进行XRD数据收集（表1). 对于家庭实验室运行，使用Bruker软件包处理每个晶体的XRD数据圣保罗（Bruker AXS，美国威斯康星州麦迪逊），但65%MPD的晶体除外，0.1M（M）pH 4.0结晶混合物的柠檬酸缓冲液，其中一个数据集用EVAL公司（施勒尔等。, 2010 )另一个有XDS公司（卡布施，2010年). DLS光束线I04上收集的NaBr-冠晶体XRD数据集的数据用MOSFLM公司（莱斯利，1999年 ).

表1
所有研究晶体的X射线晶体学数据和最终蛋白质模型修正统计

括号中的值表示最后一个shell。

PDB代码	4纳什	4纳秒	4升0	4升3	4个月	4平方英寸	4nsj个
结晶条件	0.1 M（M）醋酸钠，1M（M）溴化钠	0.1 M（M）醋酸钠，1M（M）溴化钠	65%MPD，0.1M（M）柠檬酸缓冲液pH 4.0晶体1（一周后）†	65%MPD，0.1M（M）柠檬酸缓冲液pH 4.0晶体2（五周后）†	0.2 M（M）硫酸铵，0.1M（M）乙酸钠，25%聚乙二醇4000 pH 4.6	0.1 M（M）柠檬酸钠、20%丙醇、20%聚乙二醇4000 pH 5.6	2 M（M）甲酸铵，0.1M（M）HEPES pH值7.5
仪器	钻石I04	布鲁克APEX II	布鲁克APEX II	布鲁克APEX II	布鲁克APEX II	布鲁克APEX II	布鲁克APEX II
处理程序	MOSFLM公司	圣保罗	EVAL公司	XDS公司	圣保罗	圣保罗	圣保罗
结晶设置和XRD数据收集之间的时间（周）	10	11	1	5	16	16	18
数据采集温度（K）	100	100	110	127	100	100	100
数据缩减
“空间”组	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2	P（P）4_三2₁2
单位-细胞参数（Ω）
一=b条	78.58	78.37	76.77	77.12	77.08	77.71	77.49
c	37.29	37.21	36.36	36.56	37.14	36.84	37.12
晶体到探测器的距离（mm）	205.7	40	40.2	40.4	40	40	40
观察到的反射	197352	150324	202135	206299	145058	294049	831022
独特的反射	18627	8110	7770	7850	6965	9485	13055
分辨率（Ω）	18.14–1.47 (1.50–1.47)	30.89–2.00 (2.10–2.00)	19.18–2.00 (2.03–2.00)	39.41–2.00 (2.05–2.00)	30.69–2.10 (2.13–2.10)	33.29–2.30 (2.65–2.30)	33.48–1.70 (1.80–1.70)
完整性（%）	91.7 (64.2)	97.8 (85.9)	99.8 (99.8)	99.4 (32.4)	99.8 (99.7)	94.8 (100)	99.7 (98.7)
R（右）_合并(%)	0.090 (0.460)	0.224 (0.619)	0.340 (2.71)	0.248 (2.27)	0.126 (0.499)	0.295 (0.505)	0.212 (0.942)
〈我/σ(我)〉	16.3 (4.2)	10.8 (1.3)	9.2 (0.9)‡	14.6 (0.5)§	19.2 (2.2)	7.5 (1.5)	19.3 (1.4)
多重性	10.6 (8.9)	18.1 (3.6)	26.1 (12.3)	26.3 (6.0)	20.8 (5.8)	7.8 (7.2)	63.5 (30.1)
科科斯群岛_1/2	—	—	0.38	0.32	—	—	—
精炼
Cruickshank DPI（欧）	0.07	0.27	0.25¶	0.19	0.30	0.60	0.13
平均B类系数（Ω²)	17.2	13.7	26.8¶	27.6	21.7	29.5	19.9
R（右）因子/R（右）_自由的(%)	12.5/18.1	21.8/27.0	22.3/28.3¶	19.5/25.7	19.6/26.1	22.0/28.4	20.0/25.9
R.m.s.d.，键（Ω）/角（°）	0.02/2.1	0.03/0.7	0.026/1.9¶	0.01/1.6	0.01/1.2	0.01/1.4	0.02/2.2
Ramachandran值（%）
最受青睐	97.6	96.1	96.1	97.6	92.1	92.1	96.1
允许的其他	2.4	3.9	3.9	2.4	7.9	6.3	3.9
不允许的	0	0	0	0	0	1.6††	0

†这两个数据集在arXiv预印本（Tanley，Diederichs等。, 2013b条

); 这一预印本代表了用HEWL研究卡铂非氯化钠结晶条件的开始。迪德里赫斯·坦利等。(2013b条

)还记录了评估衍射数据分辨率极限的标准组合的想法，目前正在单独进行研究。
‡〈我/σ(我)在2.2°时，〉=2.4我/σ(我)2.15℃时为1.7。
§〈我/σ(我)在2.17°时，〉=2.17我/σ(我)2.11º时=1.77。
¶最终版本细化统计65%MPD的分辨率为2.1º，0.1M（M）柠檬酸缓冲液pH 4.0晶体1由EVAL公司，而数据还原统计数据的分辨率为2.0º。
††Ramachandran图中不允许区域的两个残基是Gly残基（Gly16和Gly102）。

晶体结构用分子置换具有相位器（麦考伊等。, 2007 )，使用报道的带有PDB代码的溶菌酶结构2周1作为分子搜索模型（Cianci等。, 2008 )和约束细化具有REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011 )来自中央对手方清算所4（优胜者等。, 2011 ). 对于在DLS光束线I04上收集数据的NaBr-棕色晶体，各向异性原子B类由于高分辨率提供了这种可能性，因此对因子进行了优化，而所有其他数据集则使用各向同性原子进行了优化B类因素。建模、调整和精炼使用库特（埃姆斯利等。, 2010 )和REFMAC公司5英寸中央对手方清算所4.使用SHELXTL公司（谢尔德里克，2008年 ). 表1总结了晶体和分子模型再精细化参数Pt占用率的e.s.d.值（表2)在SHELXL公司（谢尔德里克，2008年). 对于低于2.5º的分辨率，精确的入住率估计值值得怀疑。图2、3、4、S1和S2是用CCP4毫克（麦克尼古拉斯等。, 2011 ).

表2
两个N处Pt位置的异常差异电子密度峰值高度^δ和N^∊结合位（σ）以及铂原子的占有率值（%），使用SHELX公司（谢尔德里克，2008年)

	N个^δ		N个^∊
	异常峰值高度(σ)	Pt入住率（%）	异常峰值高度(σ)	Pt入住率（%）	总占用率
pH 4.0，晶体1	5.1	39 ± 2	—	—	39 ± 2
pH 4.0，晶体2	4.6	22 ± 7	5	31 ± 4	53 ± 15
pH值4.6	9.5	49 ± 8	5.2	40 ± 8	89 ± 11
pH 5.6，晶体1	14.2	65 ± 3	11.6	46 ± 4	111 ± 5
pH值7.5	5.1	29 ± 3	—	—	29 ± 3
NaBr，I04钻石	42.9	75 ± 12	6.4	13 ± 11	88 ± 16
溴化钠、铜K（K）α	12.1	94 ± 6	3.1	28 ± 7	122 ± 9

3.结果

3.1. 溴化钠结晶条件下卡铂与HEWL的结晶

3.1.1. N中反溴磷脂酶的形成^δ结合位点

这项实验试图使溴-铂形式的任何转化比Diederichs的Tanley中描述的氯形式的转化更清晰可辨等。(2013一). 最令人惊讶的结果是，出现了反溴铂形式，而不是顺溴铂形式（图2); 看见https://en.wikipedia.org/wiki/File:Cisplatin_and_transplation.gif，这显示了一个明确的比较。研究了两种晶体；结晶建立后，即10周和11周，对每一种都进行了相当长的时间的研究。

图2
铂与Br原子的His15结合位点标记为与铂结合反式由于存在反常的差异电子密度而形成的构象。我们已经将原子放置在我们确信其分配的位置，即组氨酸、溴和铂。在最左边，密度不太容易解释。(一)Cu公司K（K）α数据集和(b条)来自Diamond的I04数据集。第2个F类_o个−F类_c图（蓝色）显示在1.5 r.m.s.等高线水平，反常差电子密度图（橙色）显示在3σ轮廓水平。Pt原子显示为灰色，Br原子显示为黄色，C原子显示为绿色，O原子显示为红色，N原子显示为蓝色。

对于Cu来源的晶体K（K）α收集了数据集，在N^δ和N^∊结合位点（图2一)铂位置的电子密度峰值高度异常差为12.1σ和3.2σ在N中观察到^δ和N^∊结合位点分别与分别为94%（±6%）和28%（±7%）的铂占用值密切一致SHELXL公司（表2). 94%的占有率是我们观察到的任何顺铂、卡铂或现在的反溴铂形式的Pt原子的最高值^∊由于存在两个（而不是三个）异常差异密度峰，结合位点较难解释；他们都很弱，身高也差不多。解释（如图2所示一和3一)由到His15 N的预期距离引导^∊第二个晶体用于收集NaBr条件下的XRD数据集，该数据集是在金刚石光源的光束线I04上使用0.9163º的X射线波长收集的，因此是在Br的短波长侧K（K）边缘和优化的Br（f）〃信号（3.9与1.4 Cu处的电子K（K）α). 图2(b条)显示了差异电子密度图。与Cu类似K（K）α上述数据集结果表明，铂原子与N原子都结合^δ和N^∊His15的原子，同样在N中有一个强烈占据的Pt^δ结合位点（76±12%）和N的弱占有率^∊结合位点（13±11%）。在N中^δ结合位点，除铂峰外，还有两个13σ和15σ它们很容易被指定为Br原子，与Pt原子的距离为2.5？（±0.1F类_o个−F类_c电子密度峰值。在N中^∊结合位点，在那里存在弱结合，解释仍然很困难，但由于与Cu相比有强烈的异常差异图峰，因此更容易K（K）α案例。Pt原子可以根据最接近His15N的距离进行分配^∊原子，然后自然地进行Br峰值分配（图3b条).

图3
N中原子之间的距离^∊在溴化钠条件下生长的晶体的结合位点。(一)Cu公司K（K）α数据集和(b条)I04 Diamond数据集。(一)Pt-N^∊键距为2.5±0.6Å，Pt-Br距离为2.4±0.5Å，Br与NH的距离为3.6±0.4Å。(b条)Pt-N^∊键距为2.6±0.1Ω，Pt-Br距离为2.5±0.1Ω和Br到NH的距离为3.5±0.1Ω。使用Cruickshank DPI值（Cruickshink，1999）计算无约束的键距σ

). Br原子与Ile88的NH基团之间的距离是典型的卤化物氢键距离。铂原子显示为灰色，溴原子显示为黄色，C原子显示为绿色，O原子显示为红色，N原子显示为蓝色。

HEWL中His15结合碘形式顺铂的最新研究（Messori等。, 2013 )显示出“特殊特征”，包括

靠近铂原子的异常电子密度出现三个峰值，表明[PtI存在两种交替结合模式₂全日空航空公司_三]部分。

第2个F类_o个−F类_cN最左边的密度^δCu中的Pt中心K（K）α和I04 Diamond数据集的形状非常相似，也没有异常的电子密度差异，排除了Br原子在第三个位置替代的可能性。这个电子密度也太细了，不可能是单个N原子。因此，卡铂分子的一部分CBDC部分（图1

)必须仍然存在于这个位置，这表明卡铂“仅”部分转化为转溴铂形式。

3.1.2. 其他溴结合位点

根据异常差异电子密度图，可以观察到Br原子确实与蛋白质结合，并且与Dauter&Dauter（1999)和Lim等。(1998)，这些位点也与通常的Cl原子结合位点相同。

3.2. 非NaCl条件下卡铂与His15的结合

对于在65%MPD中生长的晶体，0.1M（M）柠檬酸缓冲液pH 4.0条件下，从相隔四周的两个单独晶体中收集XRD数据（图4一和4b条). 晶体生长一周后收集晶体1的数据，显示卡铂与N结合^δHis15的结合位点（图4一). 然而，在晶体生长建立五周后，收集了来自同一结晶滴的晶体2的数据，现在可以看到卡铂分子与N^δ和N^∊His15的原子（图4b条). 这两种晶体还显示了在N^δ结合位点。最重要的是，N中的细节数量^∊晶体2的结合部位（图4b条)在所有研究的晶体中，我们在这个特定的结合位点上看到的最多，在那里我们观察到了一部分CBDC部分。

图4
卡铂与N的结合^δ和/或N^∊His15的原子。(一)65%MPD，0.1M（M）柠檬酸缓冲液pH 4.0晶体1(b条)65%MPD，0.1M（M）柠檬酸缓冲液pH 4.0晶体2(c) 0.2 M（M）硫酸铵，0.1M（M）乙酸钠，25%聚乙二醇4000，pH 4.6(d日) 0.1 M（M）柠檬酸钠、20%丙醇、20%聚乙二醇4000 pH 5.6(电子) 2 M（M）甲酸铵，0.1M（M）HEPES pH值7.5。2F类_o个−F类_c地图（蓝色）显示在1.2 r.m.s.等高线水平。异常差异电子密度（橙色）图如3.0所示σ轮廓水平。铂原子显示为灰色，C原子显示为绿色，O原子显示为红色，N原子显示为蓝色。

晶体生长在0.2M（M）硫酸铵，0.1M（M）醋酸钠，25%聚乙二醇4000，pH 4.6，显示卡铂分子与N^δ和N^∊His15的原子（图4c). 与在上述65%MPD中在pH 4.0下生长的晶体相比，在任一结合位点中都没有看到额外的细节。

晶体生长在0.1M（M）柠檬酸钠、20%丙醇、20%聚乙二醇4000 pH5.6再次显示卡铂分子与N^δ和N^∊His15的原子（图4d日). 在N中^∊结合位电子密度只允许模拟铂原子。然而，在N^δ在这个pH值为5.6的晶体中，我们可以看到卡铂分子的最详细的结合位点，只有CBDC部分的四碳环在电子密度中缺失。关于叠加在His15结合位点电子密度上的全卡铂分子，请参见补充图S1。正是从这个模型中删除了那些不在电子密度范围内的卡铂原子。

获得晶体的最后一个条件是2M（M）甲酸铵，0.1M（M）HEPES pH值7.5。这些晶体只显示卡铂与N结合^δ结合部位（图4电子)电子密度仅对Pt原子和一个N原子可见，而在N原子中^∊结合位点2F类_o个−F类_c电子密度为2.5 r.m.s，但不存在异常的差异密度。然而，这个电子密度约为3.5º^∊原子，因此我们不能将其解释为Pt原子，即使由于这个异常大的距离，它可能是弱束缚的（与适当束缚时的2.4º相比）。

表2给出了Pt原子在每个结合位点的占据值以及反常的密度差峰值高度对于每个“非NaCl”结晶条件。除pH值为5.6的晶体外，所有占有率值均低于之前在氯化钠结晶条件下的平均Pt占有率（N为～70%^δ结合位点，N为～50%^∊估计为±5%的结合位点标准不确定度；Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg、Meredith等。, 2012).

pH值为7.5的晶体显示出两个异常F类_o个−F类_c密度和异常差异密度峰值非常接近二硫键之一（Cys6–Cys127；参见补充图S2）。

4.讨论

4.1. NaBr共结晶条件下卡铂与His15的结合

在结晶条件下使用NaBr证实了卡铂的部分化学转化，就像使用NaCl一样。然而，在这里，我们看到了转溴铂的形式，而不是氯代顺铂。在Cu下研究NaBr-冠晶体中的转溴铂K（K）αX射线波长具有我们所见过的最高占有率（His15 N时为94±6%^δ位置）。

4.2. 非卤化物共结晶条件下卡铂与His15的结合

4.2.1. His15的不同形式导致不同的绑定模式

从卡铂与His15残基结合的四种结晶条件来看，卡铂分子与N结合的百分比^δ和N^∊His15的原子变化很大。这种化学行为可以与氯化钠结晶条件相比较，氯化钠结晶的条件总是显示一个顺铂在N^δ和N^∊His15的原子（Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg和Helliwell，2012）; Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg、Meredith等。, 2012; Helliwell&Tanley，2013年).

正如我们之前解释的那样（坦利、施勒尔、克伦-巴滕堡、梅雷迪斯等。, 2012)，正如我们在这里简要重申的那样，对N和^δ和N^∊His15的原子可能是由于His残基是咪唑基阴离子，或者由于组氨酸能够以两种互变异构体形式存在于pH值类似于p的溶液中K（K）_一(6.0–6.3). 在两种互变异构形式的情况下，N^δ或N^∊原子可以参与与铂的相互作用。咪唑基阴离子是在N–H两个原子都被去除后形成的，可以由高浓度的Cl引起⁻离子（1.4M（M）)在这些研究中使用的共结晶条件下（Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg、Meredith等。, 2012). 咪唑基阴离子在两个N原子上都有一对孤电子，每个孤电子都能与金属原子结合。因此，已知His残基能够以三种不同的形式存在：在pH<6.0时质子化His，在生理pH值6.5到7.5之间脱质子化Hes，以及通过提取两个N–H原子形成的咪唑阴离子（图5). 在我们之前的研究中（Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg和Helliwell，2012）; Tanley、Schreurs、Kroon-Batenburg、Meredith等。, 2012; Helliwell&Tanley，2013年)两个铂原子的总占位率大于100%，因此可以得出结论，存在咪唑基阴离子，而不是存在两种互变异构形式。

图5
他的三种不同形式。(一)存在于pH<6.0的质子化形式(b条)生理pH值介于6.5和7.5之间的脱质子化形式(c)一旦提取了N–H原子，就会出现咪唑基阴离子形式。

在65%MPD中，0.1M（M）在pH 4.0的柠檬酸结晶条件下，人们预计His将再次处于质子化状态。事实上，晶体生长一周后，卡铂的一个分子与N结合^δ原子（图4一). 有趣的是，当四周后从第二个晶体收集数据时，卡铂分子被发现与N^δ和N^∊原子（图4b条). 由于这种结晶条件含有柠檬酸盐离子，因此可以再次形成咪唑基阴离子，但由于柠檬酸盐的浓度比Cl低得多⁻之前使用的离子（0.1M（M）与1.4相比M（M）)我们可以预计阴离子形成的速度会更慢。此外，由于这两个铂原子的总占有率小于100%（表2)组氨酸互变异构体可能是一种可能性。

2中的晶体M（M）甲酸铵，0.1M（M）几天后，HEPES pH值7.5快速增长，第一组X射线衍射数据也收集得相当迅速，但未发现与His15结合（结果未显示）。然而，当在初始结晶建立后约18周从第二晶体收集数据时（表1)发现卡铂分子与N结合^δHis15的原子（图4电子). pH值为7.5时，His残留物以脱质子化形式存在；因此，只需提取另一个质子即可形成咪唑基阴离子。该结晶混合物含有高浓度（2M（M）)甲酸根离子（HCOO⁻); 因此，可以预期这些甲酸根离子会萃取第二个N–H原子，留下两个带孤对电子的N原子与卡铂的铂中心结合。相反，我们看到的是2F类_o个−F类_c电子密度峰值3.4º^∊原子，所以我们不能把它解释为铂原子，即使它可能由于这个异常大的距离而被弱束缚。此外，在这个N处没有发现异常的电子密度差异^∊位置。

4.2.2. 卡铂结构细节的不同水平

来自所有晶体结构结果，我们在N中看到了不同数量的细节^δ和N^∊卡铂分子的结合位点。pH值为5.6的晶体在N^δ结合部位（图4d日)，具有更多的CBDC部分原子（图1)除了四碳环结构之外建模，由于缺乏电子密度，仍然无法建模（图4d日). 对于没有看到这种四碳环结构的一个似是而非的解释是由于动力学无序，正如之前在小分子中所指出的那样晶体结构Beagley测定的卡铂等。(1985).

4.2.3. 检查HEWL冻干粉中可能存在的氯离子污染

由于冻干HEWL粉末仍然含有微量氯离子，我们自然检查了它们结合的任何证据。因此，从这里所有研究的反常差异电子密度来看，只有2.0σ可能的信号水平，只有pH值为7.5的结构有任何异常峰值的迹象，即2.5的一个峰值σ只有一个常见的氯离子位点，而其他常见的氯结合位点没有任何异常峰。

5.结论

HEWL和卡铂在NaBr中共结晶，XRD结果表明卡铂分子确实发生了化学转化。这是转溴铂的形式，与观察到顺铂的NaCl情况形成对比。由于CBDC部分的一部分仍然存在，这证实了卡铂向转铂的转化是部分的（Tanley，Diederichs等。, 2013一).

在非NaCl结晶条件下，获得的几个HEWL晶体导致观察到卡铂单独结合。在获得的四种晶体条件中，晶体生长速度为0.1M（M）柠檬酸钠、20%丙醇、20%聚乙二醇4000（pH 5.6）显示了我们见过的卡铂分子的最详细信息，只有四碳环结构没有出现在电子密度图中。

6.影响和潜在影响

顺铂和卡铂是通过与DNA中鸟嘌呤碱的N7原子结合而起作用的抗癌药物。卡铂作为一种毒性比顺铂低的药物被用于患者和动物。关于NaBr结晶条件的研究清楚地证实了卡铂向转溴铂的部分化学转化。之前的研究（Tanley、Diederichs等。, 2013一)在NaCl结晶条件下，卡铂部分化学转化为顺铂。因此，卡铂在这些化学条件下的化学行为很脆弱。问题是，卡铂在输送到肿瘤的过程中（可能是在盐水条件下）是否会转化为转铂或顺铂。

然而，卡铂可以在我们确定的几种化学条件下完全保持其化学状态。的确，我们的晶体结构对这组化学条件（很可能是此类化学条件的子集）的分析证实了其在这些条件下与组氨酸的结合。我们还没有明确确认它的完整、完整的化学结构，即使是在最明确的定义中晶体结构卡铂的末端部分未被分解。

除了作为化学试剂的抗癌作用外，卡铂和顺铂还用于肿瘤放射治疗的联合治疗。似乎这些药物可以在放射治疗之后或之前服用。如果之前，则寻求化合物的最大结合，以最大限度地吸收X射线。顺铂和卡铂与组氨酸残基结合，顺铂和卡铂与任何使用组氨酸的酶结合反应机理在靶向肿瘤而非靶向正常细胞方面，除了公认的DNA结合机制外，还可以产生额外的作用。

7.相关文献

本文的支持信息中引用了以下参考：Helliwell（1988 ).

支持信息

3D视图

PDB参考：在MPD条件下HEWL与卡铂共结晶：晶体1使用评估软件包，4lt0;在0.9163 Au，4nsf的X射线波长下研究了溴化钠结晶条件下卡铂与HEWL的结合;在MPD条件下HEWL与卡铂共结晶：晶体2使用XDS公司软件包，4lt3;在pH 5.6、4nsi条件下，在20%丙醇、20%聚乙二醇4000中卡铂与HEWL结合;在1.5418μl，4nsg的X射线波长下，在NaBr结晶条件下研究卡铂与HEWL的结合;0.2中卡铂与HEWL结合M（M）硫酸铵，0.1M（M）pH 4.6，4nsh，25%PEG 4000中的醋酸钠;卡铂与HEWL结合2M（M）甲酸铵，0.1M（M）pH 7.5，4nsj下的HEPES

链接https://dx.doi.org/10.15127/1.266911
原始数据：4NSJ_Carbolatin_pH7.5

链接https://dx.doi.org/10.15127/1.266910
原始数据：4NSI_Carbolatin_pH5.6

链接https://dx.doi.org/10.15127/1.266909
原始数据：4NSH_Carboplatin_pH4.6

链接https://dx.doi.org/10.15127/1.266908
原始数据：4LT3_Carbolatin_MPD_Crystal_2

链接https://dx.doi.org/10.15127/1.266907
原始数据：4LT0_Carbolatin_MPD_Crystal_1

链接https://dx.doi.org/10.15127/1.266906
原始数据：4NSF_Carbolatin_NaBr_Diamond_I04

支持信息。内政部：10.1107/S2053230X14016161/no5055sup1.pdf

脚注

¹支持信息已存放在IUCr电子档案中（参考：5055号).

致谢

我们感谢康斯坦茨大学、曼彻斯特大学和乌得勒支大学的研究支持。SWMT由曼彻斯特大学化学学院EPSRC博士研究生资助。根据曼彻斯特大学每月光束时间使用情况，我们确认I04上的钻石光源的光束时间。

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