1.简介

自2003年由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的严重急性呼吸综合征（SARS）全球爆发以来，人类CoV一直备受关注。此后不久，在2004年，从阿姆斯特丹住院治疗的一名7个月大的儿童的鼻咽分泌物中分离出另一株人类冠状病毒，命名为HCoV-NL63（van der Hoek）等。, 2004). 研究表明，HCoV-NL63主要感染幼儿和免疫缺陷人群，并导致轻度上呼吸道症状，如咳嗽、发烧和鼻漏，或更严重的下呼吸道感染，如毛细支气管炎和呕吐（Abdul-Rasool&Fielding，2010）). 在全球儿童呼吸道感染中，这种冠状病毒的检出率高达1.0-9.3%（Vabret等。, 2005; 范德霍克等。, 2006; 菲尔丁，2011年).

与其他冠状病毒类似，HCoV-NL63包含一个单链阳性多聚腺苷化RNA基因组，该基因组编码两个大的多蛋白（pp1a和pp1ab），通过两个病毒编码蛋白酶将其加工成16个非结构蛋白（nsp1-16）。Nsp5，也称为主要蛋白酶（M^{赞成的意见})负责15个切割位点中的11个，因此在消化过程中起着关键作用，并且对病毒复制必不可少（范德霍克等。, 2006; 高热（Pyrc）等。, 2004, 2007). 人类缺乏其细胞同源物，使其成为抗病毒药物设计的理想靶点（杨等。, 2005; 阿南德等。, 2005). 迄今为止，其他冠状病毒主要的几种晶体结构蛋白酶已经解决（杨等。, 2003, 2005). HCoV-NL63蛋白酶与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和SARS-CoV蛋白酶的序列相似性分别为60%和44%。根据这些主要的结构分析蛋白酶，已经提出了设计针对冠状病毒的广谱抑制剂的想法。在这里，我们报道了人类冠状病毒NL63主要蛋白酶与设计的Michael受体抑制剂N3复合物的结晶和初步晶体学研究。

2.材料和方法

2.1. 蛋白质表达和纯化

将HCoV-NL63主要蛋白酶的编码序列亚克隆到pGEX-6P-1质粒中，并进行测序验证。然后将重组质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）菌株进行蛋白质表达。培养物在含有0.1mg/ml的LB培养基中生长⁻¹氨苄西林在310 K下，直到光学密度在600nm处达到0.6。异丙基β-D类-将1-硫代吡喃半乳糖苷添加到0.5米的最终浓度M（M）在289 K下诱导培养物表达HCoV-NL63主蛋白酶16 h。然后，离心收集细胞，并将细菌颗粒重新悬浮在PBS（140 m）中M（M）氯化钠，10米M（M）纳₂高性能操作₄，2.7米M（M）KCl，1.8米M（M）千赫₂人事军官₄pH 7.3）补充1 mM（M）DTT，10%甘油。在277 K下进行超声处理后，细菌的裂解液在12000下离心克在277 K下保持50 min，并丢弃沉淀。将上清液加载到含有谷胱甘肽Sepharose 4B亲和树脂（Pharmacia）的一次性柱上，以纯化GST标记的HCoV-NL63主蛋白酶。然后使用商业PreScission蛋白酶（Pharmacia）在277 K下对融合蛋白进行柱上切割18 h。将蛋白酶添加到0.25 mg ml的最终浓度⁻¹用于蛋白水解的缓冲液是PBS。生成的感兴趣的蛋白质通过阴离子交换进一步纯化色谱法使用HiTrap Q色谱柱（GE Healthcare），线性梯度为25至250 mM（M）20 m氯化钠M（M）Tris–HCl pH 8.0，10%甘油，1 mM（M）DTT和SDS-PAGE分析测定的纯度大于95%（图1一).

图1 HCoV-NL63主要蛋白酶的纯化和结晶。(一)纯化HCoV-NL63主蛋白酶的SDS-PAGE分析。标记和HCoV-NL63主要蛋白酶的分子量以kDa表示。(b条)采用挂滴法生长HCoV-NL63主蛋白酶与抑制剂N3的典型复合晶体。这些典型尺寸为0.1×0.05×0.03 mm的晶体用于随后的衍射和数据收集。

2.3. X射线数据采集和处理

晶体在含有0.1的溶液中进行低温保护M（M）HEPES pH 5.5，10%(w个/五)聚乙二醇8000，4%(五/五)乙二醇，20%甘油，然后安装在尼龙环中，并在100K的氮气流中使用MAR165电荷耦合器件检测器在波长为1.0000Ω的北京同步辐射设施（BSRF）束线1W2B上进行闪蒸冷却。晶体衍射到2.85°分辨率（图2). 所有强度数据都用香港（HKL）-2000年包装（Otwinowski&Minor，1997). 这个R（右）_合并外分辨率外壳的完整性分别小于50%和大于90%。衍射数据集首次编入索引空间组 P（P）4.自旋转函数的后续计算MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年)使用10到3°分辨率之间的衍射数据显示了额外的双重对称轴（图3). 然后将数据集处理为P（P）422并使用进行评估phenix.x分类（亚当斯等。, 2010); 不孪生或检测到伪平移对称性。由系统性缺勤，沿着一轴和沿c（c）轴已识别。以下对所有替代亚组的分子置换搜索P（P）422帮助确定了空间组作为P（P）4₁2₁2分，TFZ得分为30.5。基于原单体的分子量，马修斯系数（Matthews，1968)计算为3.06Å^三 Da公司⁻¹溶剂含量为59.8%，每个非对称单元。最终衍射数据集的分辨率为2.85？，相关数据收集和处理统计信息汇总在表1中.

表1 数据收集和处理统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。 波长（Ω） 1 分辨率（Ω） 50.0–2.85 (2.90–2.85) “空间”组 P（P）41212 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 87.2,b条= 87.2,c（c）= 212.1,α=β=γ= 90 观察到的反射次数 283898 独特反射次数 19967 马修斯系数三 Da公司−1) 3.06 溶剂含量（%） 59.8 平均我/σ(我) 21.5 (6.1) 完整性（%） 100 (100) 多重性 14.2 (12.6) R（右）合并†(%) 14.4 (46.6) R（右）测量‡(%) 14.9 (48.6) R（右）下午。§(%) 4.0 (13.7) †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是我反射观测香港特别行政区和我(香港特别行政区)〉是平均强度。 ‡R（右）测量=. §R（右）下午。=.

图2 在BSRF束线1W2B上的MAR165电荷耦合器件检测器上收集的HCoV-NL63主蛋白酶复合物晶体的典型衍射图案。黑色圆圈和数字对应于分辨率壳（单位为Ω）。矩形框显示了外分辨率外壳中的衍射点。

图3 自转函数的赤平投影P（P）4衍射数据集κ=180°，针对分辨率为10至3º、积分半径为30º的数据，使用MOLREP公司来自中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011). 显示了八个共面峰，彼此相隔45°。

3.结果和讨论

最初，我们根据报道的结晶条件（PDB条目）结晶了apo形式的HCoV-NL63主要蛋白酶3吨)并尝试用抑制剂N3浸泡。然而，大多数晶体都破裂了。虽然剩余的晶体似乎完好无损，能够产生高分辨率的衍射图案，但收集的数据图像无法索引。然后，我们采用另一种方法使蛋白酶与抑制剂N3共结晶（Birtley&Curry，2005). 蛋白酶复合体的晶体属于空间组 P（P）4₁2₁2，带晶胞参数一=b条= 87.2,c（c）=212.1Ω，每个分子两个非对称单元，对应于马修斯系数和3.06？的溶剂含量^三 Da公司⁻¹分别为59.8%。对HCoV-NL63主要蛋白酶与Michael受体N3复合体的进一步结构和功能分析将有助于更好地设计和优化该先导药物，以对抗HCoV-NL63相关疾病。