Expression, crystallization and preliminary crystallographic study of the C-terminal half of nsp2 from SARS coronavirus

Li, Y.; Ren, Z.; Bao, Z.; Ming, Z.; Li, X.

doi:10.1107/S1744309111017829

结晶通信

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第67卷| 第7部分| 2011年7月| 第790-793页

doi:10.1107/S1744309111017829

SARS冠状病毒nsp2 C末端半体的表达、结晶及初步晶体学研究

李媛媛,^a、，^b、，^c 任志林,^d日泽华宝,^c 明振华 ^c和李雪梅 ^一 ^*

^一中国科学院生物物理研究所大分子国家实验室，北京100101，中华人民共和国，^b条中国科学院研究生院，北京100049，^c清华大学结构生物学实验室，北京100084，中华人民共和国^d日南开大学生命科学学院和天津蛋白质科学国家实验室，天津300071，中华人民共和国
^*通信电子邮件：lixm@sun5.ibp.ac.cn

(收到日期：2011年4月19日； 2011年5月11日接受； 2011年6月30日在线)

SARS冠状病毒（SARS-CoV）是高度传染性的严重急性呼吸综合征（SARS）的病原。为了更好地了解SARS-CoV复制和转录蛋白，本文报道了SARS-CoV-非结构蛋白2（nsp2）C末端结构域的初步X射线晶体学研究。以聚乙二醇5000单甲醚为沉淀剂，克隆、过表达、纯化并结晶SARS-CoV nsp2的C-末端结构域；晶体衍射到2.5º的分辨率。这些晶体属于空间组 P（P）6₅，带有单位-细胞参数一 = b条 = 112.8,c= 91.1 Å,α=β= 90,γ = 120°. 假设每个分子中存在一个分子非对称单元，马修斯系数为2.89Ω^三 Da公司⁻¹溶剂含量为56.2%。

关键词：严重急性呼吸综合征;SARS-CoV公司;非结构蛋白2;非结构蛋白2.

1.简介

16种复制酶/转录酶蛋白对SARS冠状病毒（SARS-CoV）的生命周期至关重要，SARS冠状病毒是2002年末首次出现的传染性极强的严重急性呼吸综合征（SARS）的病原体（Stadler等。, 2003 )在亚洲，随后传播到世界各地。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒属于冠状病毒科，其单链RNA基因组长度约为30kb（Snijder等。, 2003 ).

自从SARS大流行以来，SARS-CoV的大多数复制酶/转录酶组分，即非结构蛋白（nsps）的三维结构和功能已经确定（张等。, 2010 ; 杨等。, 2003 ; 阿尔梅达等。, 2006 ; 苏等。, 2006 ; 薛等。, 2008 ; 徐等。, 2009 ). 然而，来自SARS-CoV或相关冠状病毒的nsp2的结构和功能仍未明确。迄今为止，唯一报告的晶体结构冠状病毒nsp2是禽传染性支气管炎病毒（IBV）nsp2的N末端结构域等。, 2009 )是3组冠状病毒的代表，与SARS-CoV nsp2在一级序列（序列同源性小于20%）和基因位点（IBV中nsp2之前没有nsp1）上有很大差异。同时，由于缺乏对nsp2缺陷病毒在动物模型中的研究，或缺乏对nsp2缺陷引起宿主环境变化的研究，人们普遍认为nsp2复制酶蛋白对于小鼠肝炎病毒（MHV）的复制是不必要的由于检测到细胞培养中nsp2缺陷病毒的基因组和亚基因组RNA的产生，SARS-CoV在细胞培养中也被检测到（Graham等。, 2005 ).

为了帮助阐明这种相对较大的蛋白质的功能（对于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒和MHV分别为70和65 kDa），我们现在报道了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒nsp2的C-末端半体的表达、纯化和结晶（此处称为nsp2C；58 kDa，对应于全长严重急性呼吸系统综合征冠状病毒nsp2的Lys112–Gly638）以及它的初步结构测定单波长反常色散（SAD）。进一步分析SARS-CoV和冠状病毒家族其他成员nsp2的结构和功能，可以在我们的基础上阐明其在冠状病毒发病机制中的确切功能晶体结构严重急性呼吸系统综合征冠状病毒nsp2C。

2.材料和方法

2.1. 克隆和表达

通过基于标准PCR-的方法从SARS-CoV BJ01株的cDNA（对应于pp1a复制性多聚蛋白的Lys292–Gly818，重新编号为Lys112–Gly638）扩增SARS-CoV-nsp2C的编码序列。PCR产物经巴姆HI和不是I并连接到pGEX-6p-1表达载体（美国纽约法玛西亚）。DNA测序证实了构建物的完整性。SARS-CoV nsp2C在大肠杆菌菌株BL21（DE3）（Novagen，Merck，USA）作为GST（谷胱甘肽S公司-转移酶）融合蛋白。采用抑制蛋氨酸生物合成途径的方法，制备了nsp2C的硒蛋氨酸衍生物。分别在0.8 l Luria–Bertani培养基和M9培养基中表达天然和SeMet衍生nsp2C，并在310 K下培养至OD₆₀₀达到约0.6。添加0.5 mM（M）异丙基β-D类-在289 K温度下，1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）再维持16 h。为了制备可溶性蛋白组分，将0.8 l培养物中的细胞制成颗粒，再悬浮在50 ml冷PBS中，作为含有137 m的裂解缓冲液M（M）氯化钠，2.7米M（M）KCl，4.3米M（M）纳₂高性能操作₄，1.4米M（M）赫₂人事军官₄，1米M（M）DTT，1米M（M）EDTA和0.01%NP-40 pH 8.5，并使用JN-3000 PLUS低温超高压细胞破碎器（JNBIO，广州，中华人民共和国）进行裂解。

2.2. 净化

收集离心后的上清液，并用GST-谷胱甘肽纯化融合蛋白亲和层析。使用如下相同程序进一步纯化天然和SeMet衍生nsp2C-GST融合蛋白：简单地说，含有nsp2C蛋白的细菌细胞裂解液在277 K下与谷胱甘肽Sepharose 4B树脂（美国GE Healthcare）孵育。GST标签通过277 K过夜消化去除在1×PBS（137 m）中使用GST标记的PreScission蛋白酶（Amersham Biosciences）KM（M）氯化钠，2.7米M（M）KCl，4.3米M（M）纳₂高性能操作₄，1.4米M（M）赫₂人事军官₄，10%甘油，pH 8.5），在N末端留下五个额外的残基（GPLGS）。通过资源Q离子交换进一步纯化SARS-CoV nsp2C柱色谱法（美国Amersham Biosciences）海拔291 K，25 mM（M）Tris–盐酸，1米M（M）EDTA，1米M（M）DTT，0.01%NP-40 pH 8.5，50–250 mM（M）NaCl梯度高同质性；通过考马斯染色的Tris–glycine SDS–PAGE凝胶检查，估计蛋白质纯度约为90%（图1). 通过MALDI–TOF对所有蛋白质进行进一步表征质谱法硒代蛋氨酸的掺入也通过质谱学。将含有纯蛋白质的组分混合并浓缩至8 mg ml⁻¹用于结晶。

图1
纯化过程中SARS-CoV nsp2C的SDS-PAGE分析。蛋白质在10%SDS-PAGE上进行分析，并用考马斯蓝染色。通道1，分子量标记（标记单位为kDa）。通道2，GST后纯化nsp2C（谷胱甘肽S公司-转移酶）亲和力柱色谱法。如黑色箭头所示，GST-nsp2C的分子量为84 kDa。通道3，经过资源Q离子交换后纯度约为90%的纯化nsp2C柱色谱法。如黑色箭头所示，nsp2C的分子量为58 kDa。

2.3. 晶体生长、数据收集和处理

获得了初始晶体通过291 K下，通过混合1µl蛋白质溶液和1µl储液罐溶液，采用悬挂滴蒸气扩散法。SARS-CoV nsp2C的初始针状晶体孪生一周后出现在汉普顿研究水晶屏幕上。使用由0.1组成的储液溶液生长适合数据采集的晶体，其长度可达200µm，厚度可变M（M）双峰pH 6.5，0.2M（M）氯化钠，20%(w个/v（v）)聚乙二醇5000单甲醚（图2一). 使用相同的条件获得了nsp2C的SeMet衍生物的晶体，但晶体长大了（图2b条). 在收集数据之前，用储液溶液加10%甘油将晶体脱水2小时，并立即浸泡在由储液溶液和20%乙二醇组成的冷冻保护剂溶液中，然后在液氮中闪速冷冻。

图2
SARS-CoV nsp2C晶体。(一)原住民；(b条)SeMet衍生物。

对于天然nsp2C和SeMet衍生nsp2C，晶体到探测器的距离分别设置为273.5和362.5 mm。所有帧均在93 K下采集，使用0.8°振荡角，每帧曝光时间为2 s。分别为native和SeMet nsp2C收集了总共300帧和450帧。使用位于上海同步辐射设施（SSRF；中华人民共和国）光束线BL17U上的MAR 165 CCD探测器和单波长探测器，在1.0º的波长下，收集了nsp2C的本地数据集，分辨率为2.7º反常色散（SAD；Terwilliger和Berendzen，1999年 )收集nsp2C的SeMet衍生物的数据集，分辨率为3.5º（图3)在光子工厂（PF；日本筑波）光束线BL17A上使用ADSC Q270 CCD探测器，波长为0.9787Ω。使用香港（HKL）-2000年课程包（Otwinowski&Minor，1997 ). 初始相位通过以下方法获得SHELX公司（谢尔德里克，2008年 )和菲尼克斯（亚当斯等。, 2002 ). 对硒代蛋氨酸位点进行了定位，并获得了可解释的地图。通过使用RESOLVE（解决）（特威利格，2000年 , 2001 )和糖尿病在里面中央对手方清算所4（优胜者等。, 2011 ). 数据收集和处理总结如表1所示.

表1
数据收集和处理统计

括号中的值表示最高分辨率外壳。

	本地nsp2C	SeMet-衍生nsp2C
数据收集统计
单位-细胞参数（Ω，°）	一=b条= 112.8,c= 91.1,α=β= 90,γ= 120	一=b条= 113.8,c= 91.2,α=β= 90,γ= 120
“空间”组	P（P）6₅	P（P）6₅
波长（Ω）	1	0.9787
分辨率范围（Ω）	50.0–2.7 (2.75–2.70)	50.0–3.5 (3.56–3.50)
镶嵌度（°）	0.7	1.1
溶剂含量（%）	57.4	58.2
多重性	12.2 (5.1)	16.2 (7.1)
数据处理
观察到的反射次数	220979	138180
独特反射次数	18044	8556
完整性（%）	99.5 (98.5)	100.0 (99.5)
〈我/σ(我)〉	32.6 (2.6)	21.8 (2.7)
R（右）_合并†(%)	13.1 (65.8)	16.0 (61.3)

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ ，其中〈我(香港特别行政区)〉是观测值的平均值我_我(香港特别行政区)反射的香港特别行政区.

图3
天然SARS-CoV nsp2C晶体的X射线衍射图。

3.结果和讨论

nsp2C晶体属于空间组 P（P）6₅，这是在我们使用SHELX公司和SeMet-nsp2C数据集。单位-细胞参数为一=b条= 112.8,c = 91.1 Å,α=β= 90,γ=120°，每个分子只有一个非对称单元，对应于计算得出的马修斯系数2.89Ω^三 Da公司⁻¹溶剂含量为57.4%（Matthews，1968 ). 异常数据提供了四个清晰的硒位点。溶剂压平改善了初始相(糖尿病; 温等。, 2011)电子密度图使我们能够追踪SARS-CoV nsp2C的大多数主链残基。在多次使用糖尿病和夏普程序中，相得到了极大的改善，大多数氨基酸残基都可以清楚地解释（图4); 例外情况是C端，它主要由线圈和线圈组成，由于灵活性，某些区域的电子密度也有所不同。进一步建模和精炼SARS-CoV nsp2C结构的研究正在进行中。从SARS-CoV中成功结晶nsp2C，得到适合于结构测定应该可以让我们回答许多关于nsp2在冠状病毒发病机制调控中的作用尚不明确的基本问题。

图4
答1.5σ-加权2F类_o个−F类_cSARS-CoV nsp2C的电子密度图。

致谢

这项工作得到了科技部973项目（批准号：2006CB806503和2007CB914301）和国家自然科学基金（批准号：30221003和30730022）的支持。

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