2.1. 表达和纯化

基因编码Ld公司将PTR1克隆到表达载体pET15b（Novagen）中，该表达载体经修饰以编码烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶可裂解的N-末端六组氨酸标签。该质粒经热休克转化为大肠杆菌BL21（DE3）GOLD细胞（Stratagene），并在含有50 mg l的Luria–Bertani（LB）琼脂平板上选择⁻¹羧苄青霉素。然后，细胞在含有相同抗生素的LB培养基中在310 K条件下摇晃培养。异丙基诱导基因表达β-D类-最终浓度为1m的1-硫代吡喃半乳糖苷M（M）当细胞达到生长的中对数期时（600nm处的光密度为0.6-0.8）。在室温下培养16小时后，通过离心（4000克，277 K，30 min），用新鲜培养基洗涤并重复离心。细胞颗粒在253 K下冷冻直至需要。

为了进行纯化，将来自1 l培养物的冷冻细胞颗粒在冰上解冻，并重新悬浮在裂解缓冲液（50 m）中M（M）Tris–HCl pH值7.7，200 mM（M）KCl，20米M（M）咪唑）补充EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）和100µg DNAse I（西格玛-奥尔德里奇）。使用法式细胞压榨机裂解细胞，并通过离心（37000）澄清裂解产物克，277 K，30分钟）。过滤上清液（0.2µm），并将其应用于预加载Ni的5 ml HisTrap金属相关柱（GE Healthcare）上²⁺并与裂解缓冲液平衡。应用线性咪唑梯度，以约160 m的浓度洗脱蛋白质M（M）咪唑。分数包含Ld公司合并PTR1，并通过在303 K下与TEV蛋白酶孵育3 h来切割组氨酸标签。通过透析将咪唑从缓冲液中去除，并在277 K下继续切割过夜，然后再进行第二次Ni切割²⁺-进行亲和步骤，分离纯化的和裂解的Ld公司PTR1。将蛋白质浓缩至约10 mg ml⁻¹使用分子量截止值为3500 Da（密理博）的离心过滤装置，将缓冲液更换为20 mM（M）Tris–HCl pH 7.7。通过SDS-PAGE和基质辅助激光解吸/电离飞行时间证实了蛋白质的高纯度（>95%）和分子量质谱法（未显示数据）。纯化蛋白的产量相对较低，约为每升细菌培养物3毫克，我们注意到所产生的大多数材料是不溶性的。

2.2. 结晶和数据收集

采用坐滴蒸汽扩散法对一系列商用筛网进行测试。只有在辅酶和抑制剂存在的情况下才能获得晶体，并且在悬挂液滴中进行了优化。5 mg ml溶液⁻¹ Ld公司PTR1，1米M（M）NADP公司⁺，20米M（M）二硫苏糖醇和1 mM（M）甲氨蝶呤在结晶前在冰上孵育1h。将蛋白质溶液（1µl）与储液罐溶液（1μl）混合并存储在室温下。在含有0.1×0.1×<0.05 mm的储层上方数天内形成的小型正交板M（M）MES pH 6.5，10%(v（v）/v（v）)二恶烷和1.6M（M）硫酸铵（图1).

图1 水晶Ld公司PTR1.该样品的近似尺寸为0.1×0.1×0.03 mm。

首先通过40%PEG 400溶液对晶体进行低温保护后，将其放置在尼龙环中，并在氮气流中闪冷至100 K。使用Rigaku MicroMax-007旋转阳极X射线发生器和R-AXIS IV进行初始内部X射线实验⁺⁺镀膜探测器只能产生模糊的低分辨率衍射图像。退火步骤提高了衍射质量，其中手动转移低温气流，并在5-10秒后重新引入（数据未显示）。然后在金刚石光源同步加速器的光束线I04上收集衍射数据。

2.3. 结构解决和细化

数据通过以下方式进行处理和缩放MOSFLM公司（莱斯利，2006年)和SCALA公司（埃文斯，2006年; 协作计算项目，第4期，1994年)分别是。这个空间组是C类222₁单元间参数为一= 107.51,b条= 126.44,c（c）= 87.51 Å. 马修斯系数（Matthews，1968)2.5º^三 Da公司⁻¹对应于约50%的体积溶剂，表明两个亚基占据了不对称单元。

这个Ld公司PTR1结构由分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007). 搜索模型是单一的Lm（磅）PTR1亚单位（PDB代码1e7周; 古尔利等。, 2001)其中发散残差被截断为C^β并去除所有配体。两个亚单位被定位并呈刚性精炼随后的所有改进都是使用REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997). 图形程序库特（埃姆斯利和考坦，2004年)用于检查差异图和电子密度图，用于模型拟合、溶剂和配体搜索。蛋白质模型完成后，添加硫酸盐和水分子精炼已执行。非晶体学对称性在分析过程中没有使用约束。结晶统计见表1.数字是用PyMOL公司（德拉诺，2002).

表1 数据收集和精炼统计学 括号中的值表示最高分辨率外壳。 “空间”组 C类2221 晶胞参数（Å） 一= 107.5,b条= 126.4,c（c）= 87.5 分辨率范围（Ω） 29.9–2.5 (2.6–2.5) 波长（Ω） 0.973 测量次数 144524 (21138) 独特反射次数 21004 (3022) 多重性 6.9 (7.0) 完整性（%） 99.9 (100.0) 平均值我/σ(我) 11.9 (3.8) 威尔逊B类系数（Ω2) 46.9 R（右）合并†(%) 9.6 (42.4) R（右）工作‡(%) 22.7 (28.0) R（右）自由的§(%) 28.5 (33.0) R.m.s.d.债券（Au） 0.019 R.m.s.d.粘结角（°） 1.802 拉马钱德兰分析  有利（%） 95.2  允许（%） 4.6  异常值（%） 0.2 蛋白质残留物（总量） 432 原子（总计） 3201 总体B类系数（Ω2) 43.5 其他组    水域   不。 24   平均B类系数（Ω2) 38  硫酸盐   不。 2   平均B类系数（Ω2) 53.4 †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是我反射测量香港特别行政区和我(香港特别行政区)〉是我我(香港特别行政区)为所有人我测量值。 ‡R（右）工作=，其中F类光突发事件是观察到的结构系数振幅F类计算是根据模型计算的结构系数振幅。 §R（右）自由的与相同R（右）工作除非使用排除在外的数据子集（5%）进行计算精炼计算。

3.1. 总体结构

PTR1是一种四聚体酶Ld公司PTR1有两个亚单位（标记A类和B类)在中不对称单元；a 2个₁螺旋轴平行于c（c）生成四聚体（图2一). 每个单体由一个七个品牌的中心组成β-床单两侧有一组三个α-两侧的螺旋（图2b条)：罗斯曼重复（古利等。, 2001). 亚单位的结构A类和B类高度保守，212℃时的r.m.s.d.为0.51Ω^α原子匹配；因此，除非另有说明，否则所有描述均指子单元A类属于Ld公司PTR1。

图2 (一)的功能区图Ld公司PTR1四聚体。子单位A类和B类构成非对称单元。(b条)功能区图Ld公司PTR1亚单位。七个红色β-线（编号）夹在蓝色之间α-螺旋；环路区域为黄色。硫酸盐被描述为活性位点中的棒状物，S颜色为橙色，O颜色为红色；蛋白质的N端和C端被标记。蓝色、红色和黑色星号标记缺失两侧的残留物β3–α三，β4–α4和β6–α分别为6个回路。

3.2. 无序的活动场所

序列比较Ld公司PTR1和Lm（磅）PTR1（未显示数据）表明，参与活性位点构建的残基，以及对结合辅因子、底物、产物和抑制剂的催化作用至关重要的残基是严格保守的，并且在Tb（涡轮机）PTR1（道森等。, 2006). 然而，与同一区域的Lm（磅）PTR1和Tb（涡轮机）PTR1，没有与NADP对应的电子密度⁺或甲氨蝶呤，在结晶条件下以五倍摩尔过量存在的配体。这个K（K）_我用于甲氨蝶呤抑制Lm（磅）PTR1为39±19 nM（M）关于Tb（涡轮机）PTR1为152±16 nM（M）（道森等。, 2006).

硫酸铵是晶体生长的沉淀剂，硫酸根离子结合在由β1–α1圈和中间的环路β2和α2、接受三大中国捐赠的氢键酰胺类（His38、Arg39和Ser40）和Ser40 OG（图3). 这个极性空腔是辅因子（Gourley）腺嘌呤2′-磷酸基团的结合位点等。, 2001; 道森等。, 2006).

图3 这个F类o（o）−F类c（c）硫酸盐结合的不同密度OMIT图Ld公司PTR1 NADP+-结合部位（绿色网格轮廓为3.5σ). 橙色虚线表示离子和酶之间形成的潜在氢键。这些相互作用在2.7–3.1Ω范围内。

亚单位的核心结构保存在Ld公司PTR1和Lm（磅）PTR1结构（图4)和202摄氏度的覆盖层^α这两个亚单位共有的原子的r.m.s.d.为1.3º（使用库特; 埃姆斯利和考坦，2004年). 由于缺乏明确的电子密度Ld公司与Lm（磅）PTR1或Tb（涡轮机）PTR1.缺失的片段包括残基70–80（环连接β3和α3） ，112–132（β4–α4回路）和227–254（β6–α6回路）。这个β3–α3回路中的顺序也很差Lm（磅）PTR1（Schüttelkopf等。, 2005). 然而β4–α4回路有序Lm（磅）PTR1，但在中缺失Ld公司PTR1。这意味着Ld公司PTR1，Phe113是一个关键残基，是无序的。苯丙氨酸与烟酰胺一起形成π-稳定催化位点配体结合的堆叠相互作用（Gourley等。, 2001; 道森等。, 2006). 电子密度最大的断裂涉及残基227–254，它们形成了所谓的基底结合环连接β6至α6（塔洛赫等。, 2010). 该循环中的残留物结合叶酸物质、产品和一些抑制剂的部分。缺少β4–α4循环在活动位点裂缝中腾出一个区域，允许β5–α5个回路，共个Ld公司PTR1采用不同的位置来填补空白。这里，C^α几个残基的原子重新定位在10到16度之间。

图4 A和Cα一个的踪迹Ld公司PTR1亚单位（青色）覆盖有Lm（磅）PTR1亚单位（PDB代码1e7周; 古尔利等。, 2001; 黑色）。硫酸盐离子结合到Ld公司PTR1显示为黄色棒状，而NADPH和甲氨蝶呤与Lm（磅）PTR1分别描述为红色和橙色棒。这个β6–α的6个环路Lm（磅）PTR1型号已标记。中缺少此循环Ld公司PTR1β5–α5子串绑定环路在两种结构中采用不同的位置。

在Ld公司PTR1 Arg17紊乱。该残留物在结合焦磷酸辅酶（McLuskey等。, 2004)它反过来与烟酰胺相互作用并定位烟酰胺。Asp181、Tyr194和Lys198是关键的催化残留物。Asp181位于β5和α5，但这个回路已经内置到相对于整个结构的弱电子密度中。Tyr194的方向与Lm（磅）PTR1。但是，只有C^αLys198及其近邻的原子与相同的原子相当吻合Lm（磅）PTR1残基，而侧链延伸到不适合与烟酰胺核糖形成稳定相互作用的位置Lm（磅）PTR1（古利等。, 2001; 数据未显示）。

PTR1呈现顺序有序机制，首先是辅因子结合，然后是底物；还原后的产品叶子，然后是氧化辅因子（Luba等。, 1998; 古尔利等。, 2001). 底物或抑制剂只能在二元蛋白-辅因子复合物形成后结合。由于硫酸盐结合阻断了2′-磷酸结合位点，NADP⁺不存在，这导致活性位点的底物结合部分紊乱。