2.1. 克隆

染色体DNA的制备变形链球菌SK773是使用GenScript中的BacReady执行的。结构的设计基于spaP公司基因来自变形链球菌菌株NG5（登录代码X17390）和用于求解类似结构SspB的域边界S.戈多尼（福格伦等。, 2010). 使用正向引物5′-AAAA对片段进行PCR扩增CCATGG公司AAGCTAAATTAGCAAAA-3′和反向引物5′-­TTTTTGGTACC公司TTATGGAGTTTTACCGGTGGAGT-3′（限制位点以粗体显示）。PCR产物用Nco公司我和Acc公司65I并连接到pET-M11表达载体（由德国EMBL Gunter Stier善意提供）的等效位点，该表达载体在N末端含有His标签。最后的构造编码了他的₆-PMSDYDIPTENLYFQGAM-SpaP公司_1136–1489分子量为44.1 kDa。将质粒转化为大肠杆菌DH5型α随后在卡那霉素平板上选择菌落。阳性克隆经DNA测序证实。

2.2. 过度表达和纯化

SpaP-C_1136–1489构建物在大肠杆菌添加50µg ml的Luria肉汤中310 K下的BL21 pLysS细胞⁻¹卡那霉素和25µg ml⁻¹氯霉素。当文化达到OD时₆₀₀0.6时，温度降至298 K，0.5 m时诱导蛋白表达M（M）IPTG和培养物允许生长4小时。细胞通过5300离心获得克将细胞颗粒储存在193 K下20 min。将细胞颗粒重新悬浮在20 m内M（M）Tris pH值7.5，150 mM（M）氯化钠和10 mM（M）pH 8.0的咪唑添加EDTA游离蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）。细胞在冰上通过超声波溶解，细胞碎片通过39000离心去除克将上清液加载到Ni–NTA琼脂糖柱（Qiagen）上50分钟。SpaP-C_1136–1489蛋白质用20米洗涤M（M）Tris pH值7.5，150 mM（M）氯化钠和20 mM（M）咪唑pH 8.0，在20 m内洗脱M（M）Tris pH值7.5，150 mM（M）氯化钠和300 mM（M）咪唑，pH 8.0。缓冲区更换为20 mM（M）Tris pH 7.5，150米M（M）氯化钠和0.5 mM（M）EDTA和蛋白质通过尺寸排除色谱法Superdex 200 16/60 PG专栏（Amersham Bio-sciences）。通过SDS-PAGE分析蛋白质纯度（数据未显示）。

2.3. 结晶

SpaP-C_1136–1489将蛋白质浓缩至15毫克毫升⁻¹0.2米M（M）使用Amicon Ultra离心过滤装置（Millipore）过滤pH值为7.5的溶液。最初的结晶试验是使用蚊子吸管机器人进行的，该机器人使用坐滴式蒸汽扩散和96 well板格式的标准晶体筛选工具（汉普顿研究和分子尺寸）。通过混合浓度为15 mg ml的2µl蛋白质溶液，使用悬滴法优化初始点击⁻¹和1µl储液罐溶液，形成适合数据采集的晶体。最终结晶条件为0.1M（M）pH 5.0和15%的醋酸钠(w个/v（v）)聚乙二醇6000。

2.4. 数据收集和处理

在收集数据之前，将晶体浸泡在补充有20%聚乙二醇400的结晶溶液中，安装在回路上，并在液氮中进行玻璃化。在瑞典隆德MAX-lab的束线I911--5上，使用MAR CCD 165探测器在100K下采集2.2°分辨率的衍射数据。衍射数据用XDS公司（卡布施，2010年)和缩放比例SCALA公司来自中央对手方清算所4程序集（协作计算项目，1994年第4期).

2.5. 结构解决和细化

最初的分子替换搜索模型是从S.戈多尼SspB-C（PDB代码2个月; 福斯格伦等。, 2010)和变形链球菌使用程序的SpaP蛋白质序列CHAINSAW公司（斯坦因，2008年)这两种蛋白质在该区域的序列一致性为67%。使用程序求解结构相位器（麦考伊等。, 2007)并用菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2005). 第一个精炼包括刚性体的台阶精炼以及5000 K开始的模拟退火；平移-释放-螺钉（TLS）精炼在精细化，将每条链视为单独的TLS组（Winn等。, 2001). 手动检查、重建和添加水分子库特（埃姆斯利等。, 2010). 模型的质量通过WHAT_检查（发动机罩等。, 1996). 该模型在整个过程中受到六倍的NCS约束精细化。 精炼统计如表1所示.数字是用中央对手方清算所4MG公司（波特顿等。, 2004)

表1 数据收集和处理统计 括号中的值用于外壳。 波长（Ω） 0.90852 “空间”组 P（P）21212 晶胞参数（Å） 一= 135.8,b条= 238.4,c（c）= 78.5 不对称单元中的分子 6 分辨率范围（Ω） 29.50–2.18 (2.30–2.18) 观察到的反射次数 979090 独特反射次数 132886 威尔逊B类系数（Ω2) 27.7 完整性（%） 99.7 (98.8) 多重性 7.4 (7.0) 〈我/σ(我)〉 28.5 (12.2) 对合并† 0.049 (0.170) 对工作‡ 0.210 对自由的‡ 0.248 R.m.s.d.债券（Au） 0.010 R.m.s.d.角（°） 1.228 总体B类系数（Ω2)    蛋白质 25.8  水 23.3  钙 33.6 Ramachandran统计（%）    首选区域 95.24  允许的区域 3.72  异常值 1.04 PDB代码 3人 †对合并=，其中我我(香港特别行政区)是我反射观测香港特别行政区和我(香港特别行政区)〉是所有反射观测值的平均值香港特别行政区。 ‡对工作=，其中F类光突发事件和F类计算分别是观测到的和计算出的结构因子振幅。对自由的是对工作使用从中删除的5%的数据计算精细化。

结构因子和坐标已存入蛋白质数据库（PDB；https://www.rcsb.org/pdb)根据加入代码3人.

3.1. 结晶、数据收集和结构测定

SpaP-C晶体_1136–1489蛋白质通过悬挂滴气相扩散获得。这些晶体属于空间组 P（P）2₁2₁2，其中有六个分子非对称单元，对应于2.68Ω的马修斯系数^三 Da公司⁻¹（54%溶剂含量；Matthews，1968年). 单位-细胞参数为一= 135.8,b条= 238.4,c（c） = 78.5 Å. 该结构通过分子置换使用基于类比的模型S.戈多尼结构作为搜索模型。精炼手动拟合模型，最终对_工作21.0%和对_自由的24.8%。

3.2. SpaP-C的总体结构_1136–1489

SpaP-C的最终模型_1136–1489从变形链球菌由六条独立的蛋白质链组成，每条与两个钙结合²⁺离子。模型中包括545个水分子。精制单体由残留物1152-1489组成。在电子密度中看不到16个N末端残基和来自连接物的残基，因此不包括在内。结晶蛋白由两个结构域组成，C2和C3，每个结构域都采用β-夹层折叠（图1). C2域由两部分组成β-五股和六股的床单。该域还包含两个短α-螺旋线位于β-？三明治，以及一个垂直于β-·三明治。C3结构域由两个片状结构组成，每个片状结构由五股组成。面向C2域的一侧β-夹芯线由长环连接，长环还包括短螺旋和短螺旋β-发夹。在另一侧，股线通过短匝连接，只有一个例外，即长线圈（16个氨基酸）连接两股线。每个域都由金属离子稳定，模型为Ca²⁺.在每个β-夹在中间，两片通过共价键连接异肽键形成于赖氨酸和天冬酰胺的侧链之间。

图1 SpaP-C的总体结构1136–1489C2域以蓝色显示，C3域以浅蓝色显示。两个钙离子被描绘成灰色球体，两个异肽键被描绘成粉红色的棒状模型。

中的六个单体非对称单元通常非常相似，在所有C上计算的均方根偏差（r.m.s.d.）在0.3到0.7之间^α原子。

3.3. 异肽键和钙²⁺地点

在C2中β-三明治和异肽键在一片Lys1157和另一片Asn1307之间形成。类似地，C3的Lys1334和Asn1469之间形成了一个异肽键β-·三明治。赖氨酸的NZ原子和天冬酰胺的CG原子之间形成两个异肽键，从而释放铵。保守的天冬氨酸与肽C=O和NH基团形成氢键。异肽被疏水和芳香残基进一步包围。疏水环境在C3结构域中更为突出。异肽键及其周围的残基与之前报道的类似蛋白SspB非常相似S.戈多尼（福格伦等。, 2010). 在越来越多的革兰氏阳性表面蛋白中描述了同肽，例如在来自化脓链球菌和白喉棒状杆菌（康等。, 2007, 2009). 假设这些共价键被用作抵抗机械力稳定这些表面蛋白质的手段。

加利福尼亚州²⁺离子很可能发挥重要的结构作用，因为它们位于异肽键在每个域中。在这两个结构域中，与异肽形成氢键的天冬氨酸之后是与钙配位的天冬酰胺酸²⁺离子。加利福尼亚州²⁺C2结构域中的离子由两个残基的羧酸基团（Asp1208和Glu1211）、Lys1261、Tyr1209和Ala1263的羰基O原子以及一个水分子进行配位。在C3中Ca²⁺离子由Glu1387和Asp1384的侧链O原子、Lys1430、Gly1431和Tyr1385的主链O原子和一个水分子配位。

3.4. 与的比较S.戈多尼SspB结构

的总体结构变形链球菌SpaP-C通常与S.戈多尼具有异肽键和钙的SspB-C²⁺处于相同位置的原子。两个结构之间的近似r.m.s.d.为1.0º。序列中最大的偏差出现在垂直于β-C2域和以下扩展区域的夹层。该区域被描述为BAR区域（SspB粘附区域）S.戈多尼SspB被牙周病原体用作识别柄牙龈假单胞菌（布鲁克斯等。, 1997). SpaP的此区域不被识别牙龈假单胞菌尽管其结构非常相似（图2一). 两种蛋白质（SpaP中的QEIRDVLSK和SspB中的KKVQDLLKK）中面向溶剂的螺旋中的大多数带电残基不同，从而创造了不同的识别条件。以下扩展区域的序列也不同（SpaP中的GIRPK和SspB中的NITVK）。先前的研究表明，SspB延伸区域中的两个单一突变，即N1182G和V1185P，使该区域更像变形链球菌SpaP蛋白完全消除牙龈假单胞菌遵守（Demuth等。, 2001). 这个晶体结构SpaP的研究表明，这些氨基酸在蛋白质中的自然存在不会改变该区域的二级结构，并对这两个单一位点在牙龈假单胞菌认可和坚持。然而，静电表面有很大不同（图2b条和2c（c）)并为任何交互伙伴创建非常不同的识别属性。对SpaP和SspB结构的比较打开了开发物质以消除粘附的可能性牙龈假单胞菌口腔生物膜。

图2 SspB和SpaP-BAR区域的比较。(一)BAR图案S.戈多尼AgI/II蛋白SspB是识别站点对于牙龈假单胞菌由螺旋线（KKVQDLLKK）和延伸区域（NITVK）组成。钙离子（灰色球体）通过与三条主链、两条侧链和一个水分子的相互作用（折线）来稳定基序。中的类似区域变形链球菌SpaP由α-螺旋（QEIRDVLSKA）后面是一个扩展区域（GIRPK），它与S.戈多尼新加坡特别行政区。这两种蛋白质重叠并立体显示。SspB显示为灰色，SpaP显示为蓝色和黄色。残留物贴上标签，SspB残留物用斜体表示。(b、 c（c）)SspB和SpaP中BAR区域的静电表面比较。SspB BAR区域(b条)和SpaP中的等效区域(c（c）)产生非常不同的静电表面，从而产生不同的识别模式。