1.简介

人类冠状病毒OC43（HCoV-OC43）约占所有感冒的20%（Kaye等。, 1971; Lai和Cavanagh，1997年). 虽然HCoV-OC43感染通常较轻，但更严重的上呼吸道和下呼吸道感染，如毛细支气管炎和肺炎，尤其是婴儿、老年人和免疫功能低下患者（El-Sahly等。, 2000; 加尼厄尔等。, 2002; 圣吉恩等。, 2004). 根据血清学交叉反应性，HCoV-OC43是II类冠状病毒的代表。冠状病毒的RNA基因组由几个编码几个结构和非结构蛋白的基因组成，其排列顺序为5′-pol（聚合酶）-S（棘突）-E（包膜）-M（基质）-N（核衣壳）-3′（Navas-Martin&Weiss，2004). 围绕核衣壳的病毒膜含有结构蛋白S、M、E和N。其中一些含有第三种糖蛋白HE（血凝素酯酶），这种糖蛋白存在于大多数II类冠状病毒中。HCoV N蛋白的主要功能是识别作为包装信号的RNA片段，并在组装过程中形成核糖核蛋白（RNP）复合物（Lai和Cavanagh，1997）). RNP在保持RNA的有序构象以适合病毒基因组的复制和转录方面可能很重要（Lai，2003; 纳尔逊等。, 2000; 黄等。, 2004; Navas-Martin和Weiss，2004年). 此外，N蛋白也是一个重要的诊断标记，是感染宿主中最具免疫优势的抗原（Chan等。, 2005; 求爱等。, 2004).

HCoV-OC43的N蛋白分子量为49.5 kDa，pI为10.0，是一种高碱性蛋白质，具有高亲水性（Hogue&Brian，1986）; 波尔-科普等。, 1995). 我们之前已经证明，HCoV-OC43（N-NTD）的N末端结构域包含大多数负责RNA结合的带正电荷残基，而C末端结构域（N-CTD）主要起着齐聚形成衣壳的模块（黄等。, 2009; 赛卡通杜等。, 2007; 贾亚拉姆等。, 2006; 风扇等。, 2005). N蛋白的中心无序区也被证明含有RNA-结合区（Chang等。, 2009). 为了阐明HCoV-OC43的N蛋白与核酸，我们已经决定晶体结构HCoV-OC43的N末端结构域（残基58–-195）。

2.实验方法

2.1. HCoV-OC43 N-NTD的表达与纯化

HCoV-OC43 N蛋白的模板由中国科学院生物化学研究所（台湾台北）提供。为了产生一种截短形式的重组HCoV-OC43 N-NTD，编码N蛋白的基因被聚合酶链反应（PCR）使用Pfu公司正向引物5′-CGCCTAT聚合酶GAATTC公司AATGTTGTACCCTACTATTTGTTC-3′和反向引物5′-ACAACGCTCGA公司G公司AGCAGCTTCCTGAGCCTTAATAT-3′。PCR产物用生态RI和Xho公司I和得到的DNA片段使用T4连接酶（NEB）克隆到pET28a（Novagen）中。将重组质粒转化为大肠杆菌BL21-RIL使用热冲击法。细胞在310 K的Luria–Bertani培养基中生长，该培养基含有50 mg l⁻¹卡那霉素。在OD诱导蛋白质表达₆₀₀0.6，增加1mM（M）异丙基β-D类-在283 K下保持24小时的1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。表达的N-NTD包含N末端（MGSSHHHH­HSSGLVPRGSHMASMTGQMGRGSEF）和C末端（LE­HHHHH-h）标记。通过离心法收集细菌后（6000转/分⁻¹，30 min，277 K），将细菌颗粒重新悬浮在超声缓冲液中（50 mM（M）三缓冲溶液pH 7.5，150 mM（M）氯化钠和15 mM（M）咪唑），超声裂解30min（3s脉冲打开，6s脉冲关闭）。通过离心（13000转/分）从上清液中获得可溶性蛋白质⁻¹，30分钟，277 K）。N-NTD携带他的₆使用Ni–NTA柱（Novagen）纯化N端和C端的标签，洗脱梯度为15至250 mM（M）咪唑缓冲溶液（50 mM（M）pH 7.5和150 m的三缓冲溶液M（M）氯化钠）。含N-NTD的馏分在250 m处汇集和收集M（M）咪唑和50米透析M（M）pH 7.5的三缓冲溶液，含150 mM（M）氯化钠（图1). 将纯化的N-NTD浓缩至8 mg ml⁻¹50米M（M）Tris–HCl pH值7.5，含255 mM（M）结晶前的氯化钠。

图1 考马斯亮蓝染色HCoV-OC43 N-NTD的SDS-PAGE分析。车道M（M）、蛋白质标记物（kDa）；车道1，纯化HCoV-OC43 N-NTD；通道2，透析后浓缩HCoV-OC43 N-NTD。

2.2. 结晶

使用Qiagen JCSG+Suite和PACT Suite晶体屏幕进行初始结晶实验（Newman，2005)根据我们之前描述的协议（Chou&Hou，2008). 将筛选试剂盒中的每个结晶条件（2µl）与1.5µl纯化蛋白溶液（8 mg ml）混合⁻¹)和0.5µl 40%己二醇在室温下（～298 K），并在Cryschem板孔中与400µl溶液平衡。在七个循环中对条件进行了优化，并在含有0.25的溶液中生长晶体M（M）琥珀酸-磷酸盐-甘氨酸（SPG）缓冲液pH 6.0，25%PEG 1500在293 K下与400µl沉淀溶液平衡。将琥珀酸（Sigma）、磷酸二氢钠（Merck）和甘氨酸（Merck). 晶体在两周内出现，最大晶体的尺寸约为200×100×100µm（图2).

图2 用25%聚乙二醇1500作为沉淀剂，在pH 6.0下，通过坐滴蒸发扩散法获得HCoV-OC43 N-NTD晶体。晶体的近似尺寸为200×100×100µm。

2.3. X射线数据采集和处理

将晶体浸泡在含有30%的储液中(五/五)在100K氮气流中闪蒸冷却之前，甘油作为低温保护剂。使用同步电子辐射源收集高分辨率X射线数据。使用ADSC Q210r探测器在位于SPring-8（日本兵库）的NSRRC（台湾新竹国家同步辐射研究中心）合同束线BL12B2上获得了初步衍射图像。使用ADSC Q315r探测器在NSRRC的束线BL13B1上收集完整的数据集。晶体到探测器的距离为150 mm。每帧的振荡宽度和曝光时间分别为1°和10 s。使用香港（HKL）-2000年课程包（Otwinowski&Minor，1997). 表1列出了N-NTD数据收集的晶体学统计数据.

表1 HCoV-OC43 N-NTD晶体的数据收集统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。 X射线源 BL13B1、NSRRC 波长（Ω） 1 “空间”组 P（P）65 单位-细胞参数（Ω） 一= 81.57,c（c）= 42.87 分辨率极限（Ω） 30–1.70 (1.76–1.70) 总反射 149206 独特的反射 18040 完整性（%） 99.9 (99.9) 冗余 8.3 (7.7) R（右）合并†(%) 5.0 (76.1) 〈我/σ(我)〉 27.8 (2.46) †R（右）合并=.

3.结果和讨论

为本研究选择的HCoV-OC43 N-NTD晶体能够将X射线衍射到1.7°分辨率（图3)并且属于空间组 P（P）6₅，带有单位-细胞参数一= 81.57,c（c）= 42.87 Å. 马修斯系数为2.06Ω^三 Da公司⁻¹使用计算MATTHEWS_COEF公司（合作计算项目，第4期，1994年）; 马修斯，1968年)表明可能有一个分子在非对称单元，溶剂含量为40.26%。使用爆炸服务器（Altschul等。, 1997;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi网站)2008年12月收集同步加速器数据时。序列比对搜索表明，HCoV-OC43 N-NTD与冠状病毒的其他N-NTD具有30-40%的序列同源性（图4)和SARS冠状病毒的N末端结构域（PDB编码2赫兹; 赛卡通杜等。, 2007)被选为初始搜索模型，因为E类值为1×10⁻²³第一次分子置换试验是使用自动界面进行的佩龙日本RIKEN SPring-8中心蛋白质构造平台（PTP）等。, 2008). 使用MOLREP公司项目（Vagin&Teplyakov，2010). 利用分辨率范围为30–3.0º的反射获得旋转和平移函数的单一且明确的解决方案，并得出最终结果相关系数0.79和R（右）系数为0.44。模型的核心由一个紧密堆积的β-由五条反向平行的股线组成的薄板，周围环绕着大环。结构精炼目前正在进行HCoV-OC43 N-NTD的检测。

图3 HCoV-OC43 N-NTD的典型X射线衍射图。箭头显示分辨率极限（1.7°）下的数据。

图4 CoV N-NTD的多序列比对；T-Coffee咖啡（名称等。, 2000)用于定义保守残基。序列上方的编号用于OC43的氨基酸序列。保存的残留物被遮盖。完全保守的残留物被涂成红色。在75%和50%水平上部分保守的残渣分别被涂成橙色和黄色。从GenBank中获得OC43（HCoV-OC43；NP_937954）、SARS（SARS-CoV；ABI96968）、229E（HCoV-229E；AAG48597）和IBV（传染性支气管炎病毒；AAB24054）N-NTD的氨基酸序列。