1.简介

2003年SARS冠状病毒在全球爆发，导致8000多名患者750人死亡，自那以来，已经发现了几种新型人类冠状病毒（HCoV），其中之一是人冠状病毒HKU1（HCoV-HKU1；Woo，Huang等。, 2005). HKU1是该属的成员冠状病毒可分为三个不同的组（Spaan和Cavanagh，2004). 与SARS一样，HKU1也属于冠状病毒II类，感染人类（Gerna等。, 2007). 世界各地都有报告称感染了HKU1的患者，包括韩国（Choi等。, 2006)，北美（Esper等。, 2006)，澳大利亚（Slots等。, 2006)和欧洲（Bosis等。, 2007)并且经常在下呼吸道表现出自限性综合征（Zhao等。, 2008). 基因组测序研究表明，HKU1与小鼠肝炎病毒（MHV；Woo，Huang等。, 2005)另一组II型冠状病毒。

HKU1基因组是一个29 926的单链阳性多聚腺苷化RNA核苷酸。与其他冠状病毒一样，该基因组包含两个大ORF（ORFs 1a和1b），它们是RNA转录和基因组复制所必需的，并通过病毒编码蛋白酶（Snijder）加工成16种非结构蛋白等。, 2003; 普伦蒂斯等。, 2004; 刘吴等。, 2005). 根据MHV（Deming）中的缺失实验，Nsp9已被证明对病毒RNA合成和复制至关重要等。, 2007). 两个nsp9分子的存在非对称单元可能表明该蛋白作为二聚体发挥作用，SARS-CoV nsp9（Campanacci等。, 2003). 根据现有的结构数据，nsp9被认为具有稳定新生代的功能核酸类在RNA合成过程中，并根据其单链RNA结合特性（Egloff等。, 2004).

2.表达和纯化

编码HCoV-HKU1 nsp9的cDNA由香港特别行政区香港大学微生物学系的K.Y.Yuen教授提供。用正向和反向引物5′-CGGATCAAAATGAGTTGATGCCT-3′和5′-CGCTCCGAGTTACTGCT-3′分别扩增编码HKU1 nsp9的基因（对应于Asn4211–Gln4320，其中编号为整个多蛋白的编号），然后插入到巴姆HI和Xho公司pGEX-6p-1质粒的I位点。验证序列后，将重组质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）。培养物在含有0.1mg/ml的LB培养基中生长⁻¹氨苄西林在310 K下，直到光学密度600 nm（外径₆₀₀)达到0.6。0.5米M（M）异丙基β-D类-添加1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），诱导培养物在289 K下表达HKU1 nsp9，持续16 h。离心收集细胞，将细菌颗粒重新悬浮在PBS（140 m）中M（M）氯化钠，10米M（M）纳₂高性能操作₄，2.7米M（M）KCl，1.8米M（M）千赫₂人事军官₄pH 7.3）补充1 mM（M）DTT公司。在277 K下超声处理后，将裂解液在12 000下离心克在277 K下保持50 min，并丢弃沉淀。将上清液装入GST-谷胱甘肽亲和柱（法玛西亚）。然后在277K下用GST-鼻病毒3C蛋白酶在柱上裂解融合蛋白18h；在HKU1 nsp9的N末端留下了5个额外的残基（GPLGS）。蛋白酶的切割缓冲液为PBS，蛋白酶与蛋白质的比例约为1:50。使用Thermo-iCON浓缩器浓缩蛋白质。使用Thermo Centra-CL3R浓缩后，使用Superdex 75柱（GE Healthcare）在含有20 m的缓冲液中纯化HKU1 nsp9M（M）人工编码站，150米M（M）氯化钠pH 6.0。典型的产量为每升细菌培养物3毫克纯化蛋白。

3.结晶

纯化后，HKU1 nsp9蛋白浓缩至25 mg ml⁻¹在包含150 m的缓冲器中M（M）氯化钠，20米M（M）MES pH 6.0。使用Crystal Screen试剂盒（Hampton Research）筛选结晶条件。我们在291 K的16孔结晶板中使用蒸汽扩散技术进行晶体筛选。将1.0µl蛋白质溶液与1.0µl储液罐溶液混合，然后静置以达到平衡，同时悬挂400µl储液罐液。HKU1 nsp9的初始晶体是使用汉普顿研究晶体筛1的条件40获得的，其中含有0.1M（M）柠檬酸钠三元脱水剂pH 5.6，20%(五/五)2-丙醇，20%(w个/五)聚乙二醇4000。优化后的条件包含0.12M（M）柠檬酸钠三元脱水剂pH 5.6，20%(五/五)异丙醇，25%(w个/五)聚乙二醇4000（图1).

图1 通过悬滴法在0.1中生长的HKU1 nsp9的典型晶体M（M）柠檬酸钠三元脱水剂pH 5.6，20%(五/五)异丙醇，20%(w个/五)聚乙二醇4000。典型的晶体尺寸为0.3×0.03×0.04 mm。

4.数据收集和处理

将晶体直接安装在尼龙环中，并使用Oxford Cryosystems冷冻流在100K的氮气流中闪蒸冷却。衍射数据是在Rigaku Cu内部收集的K（K）α旋转阳极X射线发生器（MM-007），电压40 kV，电流20 mA（1.5418Ω），配备Rigaku R-AXIS IV⁺⁺成像探测器。使用香港（HKL）-2000个程序DENZO公司和电子秤组件（Otwinowski&Minor，1997年). 晶体衍射到2.7°分辨率（图2). 他们属于空间组 P（P）2₁2₁2，带晶胞参数一= 83.5,b条= 88.4,c（c） = 31.2 Å,α=β=γ= 90°. 基于单体的分子量，马修斯系数（Matthews，1968)计算为2.35º^三 Da公司⁻¹假设每个溶剂中存在两个分子，溶剂含量为47.77%非对称单元。数据收集统计如表1所示。对HKU1 nsp9的进一步结构和功能分析将揭示组成冠状病毒家族的不同群体共有的保守结构和功能方面。

表1 数据收集和处理统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。 波长（Ω） 1.5418 分辨率（Ω） 50.0–2.7 (2.8–2.7) “空间”组 P（P）21212 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 83.5,b条= 88.4,c（c）= 31.2,α=β=γ= 90 R（右）合并†(%) 7.9 (43.6) 马修斯系数三 Da公司−1) 2.35 溶剂含量（%） 47.77 平均我/σ(我) 17.4 (2.1) 完整性（%） 97.1 (91.0) 冗余 5.5 (4.3) 观察到的反射次数 37325 独特反射次数 6738 每个ASU的分子数 2 †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是个人强度测量我(香港特别行政区)〉是所有反射的平均强度我.

图2 Rigaku R-AXIS IV上采集的HKU1 nsp9晶体的典型衍射图案++成像探测器。