Structure of a SARS coronavirus-derived peptide bound to the human major histocompatibility complex class I molecule HLA-B*1501

Røder, G.; Kristensen, O.; Kastrup, J.S.; Buus, S.; Gajhede, M.

doi:10.1107/S1744309108012396

蛋白质结构通讯\（第5em段）

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第64卷| 第6部分| 2008年6月| 第459-462页

doi:10.1107/S1744309108012396

与人类主要组织相容性复合物Ⅰ类分子HLA-B*1501结合的SARS冠状病毒衍生肽的结构

古斯塔夫·罗德,^一 ^* 奥利·克里斯滕森,^b条杰特·卡斯特鲁普,^b条瑟伦·布斯 ^一和迈克尔·加伊赫德 ^b条

^一哥本哈根大学国际卫生、免疫学和微生物学研究所，Blegdamsvej 3，DK-2200哥本哈根，丹麦，和^b条丹麦哥本哈根DK-2100第二大学哥本哈根大学药物科学学院药物化学系
^*通信电子邮件：g.roder@immi.ku.dk公司

(2008年3月5日收到； 2008年4月28日接受；在线2008年5月17日)

人类白细胞抗原（HLA）I类系统包含一组高度多态性的分子，这些分子特异性结合并呈现肽类细胞毒性T细胞。HLA-B*1501是HLA-B62超型的一个典型成员，目前只确定了两个肽-HLA-B*1501结构。在这里晶体结构HLA-B*1501与SARS冠状病毒衍生九肽（VQQESSFVM）的复合物已在高分辨率（1.87º）下测定。肽深深地固定在B类和F类但Glu4残基指向肽结合槽中远离地面的地方，使其可以与潜在的T细胞受体相互作用。

关键词：人类白细胞抗原I类;SARS冠状病毒衍生肽;HLA-B*1501型.

三维视图：3立方厘米

PDB参考：HLA-B*1501–VQQESSFVM复合物，3c9n，r3c9nsf

1.简介

主要组织相容性复合体I类（MHC-I或人类HLA-I）分子是细胞表面糖蛋白。它们的功能是选择肽类来源于细胞内蛋白质代谢，并将其呈现给适应性免疫系统的细胞毒性T细胞，从而可以测量和控制细胞的蛋白质含量等。, 2002 ). MHC-I分子的特异性决定了肽类将呈现并可能被免疫系统识别。HLA系统具有高度多态性，可有效分散免疫反应性。在人类群体中已鉴定出近1600个不同的HLA-I等位基因，使MHC-I成为已知的多态性最强的基因系统。为了减少这种复杂性，有人建议，大多数HLA-I分子可以聚集成12个当前定义的HLA超型之一。已经报道了120多种不同的HLA-I晶体结构，其中大多数属于HLA-A2超型；其他超类型很少填充或根本没有填充。仅报道了HLA-B62超型的几个HLA-I等位基因结构，包括HLA-B*1501的两个结构（Röder等。, 2006 ). HLA-B*1501是HLA-B62超型的原型成员。HLA-B*1501在东南亚和欧洲人群中常见，通常占HLA-I表型的10%以上。

我们参与了人类MHC项目，该项目旨在描述和预测每个HLA超型的一个或多个成员的肽结合特异性（Lauemøller等。, 2000 ). 为此，我们正在生成结构（Blicher等。, 2005 , 2006 ; 罗德等。, 2006)和生物化学（Buus等。, 1995 ; 西尔维斯特·维德等。, 2002 ; 劳埃默勒等。, 2000)肽与HLA相互作用的信息，并利用这些信息生成肽结合的快速计算预测（Stryhn等。, 1996 ; 布斯等。, 2003 ; 彼得斯等。, 2006 ). 对肽-MHC相互作用的详细了解将有助于对T细胞识别的本质和人类免疫反应的合理利用的一般理解（Lauemöller等。, 2000). 因此，预测算法可以快速准确地筛选整个基因组的潜在免疫原表位（Wang等。, 2007 ). 一种可能独立于大规模生物化学实验的方法是使用结构信息预测肽结合物（Rognan等。, 1999 ). 为了填充HLA分子的“结构空间”，我们之前报道了两个HLA-A*1101（Blicher等。, 2005, 2006)和两个HLA-B*1501结构（罗德等。, 2006). 这里，我们报告一个晶体结构HLA-B*1501与SARS冠状病毒衍生的九肽（VQQESSFVM）复合物。

2.材料和方法

2.1. 克隆

通过使用QuikChange多位点定向突变试剂盒（Stratagene）对HLA-A*0201基因进行定点突变，产生了一个代表HLA-B*1501蛋白的基因结构，位置1–276。这一过程涉及81个核苷酸突变，可以使用13个DNA引物完成。将最终HLA-B*1501序列插入pET28a载体（Novagen）。该序列通过DNA测序（3100 Avant，ABI）进行验证。

2.2. 蛋白质生产和纯化

大肠杆菌用HLA-B*1501-pET28载体转化BL21（DE3）细胞，在2l发酵罐（Infors）中通过IPTG诱导产生蛋白质，如前所述（Ferré等。, 2003 ). 通过细胞破碎（恒定细胞破碎系统）获得包涵体，用含0.5%的PBS洗涤两次(五/五)NP40和0.5%(w个/五)脱氧胆酸并溶解于8米尿素和25 m米Tris–HCl pH 8.0。溶解的HLA-B*1501蛋白在8米285 K尿素离子交换色谱法（Q-Sepharose快速流动）。缓冲器A类包含8个米尿素和25 m米Tris–HCl pH值8.0和缓冲液B类相同，但包含1个米氯化钠。缓冲区中有0–50%的梯度B类采用跨越四个柱体的方法。通过以下方法进一步纯化洗脱的蛋白质疏水相互作用色谱法（苯基Sepharose HP）正确分离二硫键合HLA-B*1501（缓冲液A类, 8 米尿素，25 m米Tris–HCl pH值8.0和100 g l⁻¹硫酸铵；缓冲器B类, 8 米尿素和25 m米Tris–HCl pH 8.0；梯度，缓冲区中0–40%B类跨越六列卷）。最后，用Sephacryl-S200纯化HLA-B*1501样品色谱法在8中米尿素，25米米Tris–HCl pH 8.0和150 m米NaCl，通过超滤浓缩，随后在253 K下储存。

2.3. 肽的生产和纯化

VQQESSFVM肽通过常规Fmoc化学合成，然后通过反相HPLC纯化（Schafer-N，哥本哈根）。肽的特性通过反相高效液相色谱法和离子捕获法进行验证质谱法（布鲁克·道尔顿）。纯度测定高于99%。

2.4. MHC-I复合组件

对于复杂组装，3 mg变性HLA-B*1501重链在1 l 50 m内迅速稀释米Tris–HCl pH值7.5，3 m米EDTA和150 m米含2 mg氯化钠β₂-微球蛋白(β₂m）和1毫克肽（最后的重链，β₂m和肽浓度分别为100、170和1000 n米）。折叠反应在291 K下培养48小时，然后使用配备10 kDa分子量截止过滤器的压力电池（Amicon）浓缩至10 ml。让高浓度折叠反应沉淀过夜，然后在10 kDa旋转过滤器（Amicon）上浓缩至0.5 ml。折叠MHC-I复合物从聚集的HLA-B*1501重链中分离出来，游离β₂m和肽在Superdex-200柱上（Amersham Biosciences）。分析了组分（SDS-PAGE和离子阱质谱）和含有两种蛋白质成分的组分，HLA-B*1501重链和β₂m、混合并浓缩在10 kDa旋转过滤器上，浓度为4.2 mg ml⁻¹(96 µ米)50米米Tris–HCl pH值7.5，3 m米EDTA和150 m米氯化钠。

2.5. 结晶和数据收集

HLA-B*1501复合物的晶体是使用悬滴技术生长的。筛选过程中使用了来自Crystal Screens 1和2（Hampton Research）的缓冲液（储液罐体积，500µl；滴体积、1µl储液罐溶液和1µl蛋白质溶液）。实验在277 K下进行。在前两个月内没有晶体出现，之后结晶实验在277K下进行2年。在初始条件下出现单晶，初始条件为0.2米六水合氯化镁，0.1米HEPES，30%(五/五)聚乙二醇400 pH值7.5。衍射数据是在瑞典隆德MAX实验室的I911-5光束线上在低温下收集的。HLA-B*1501复合物结晶于空间组 P（P）2₁2₁2₁，每个具有一个蛋白质-肽复合物非对称单元（见表1). 强度与MOSFLM公司（鲍威尔，1999年 )和缩放比例标量（埃文斯，2006年 ).

表1
水晶数据和数据收集细化统计HLA-B*1501结构

括号中的值表示最高分辨率外壳。

数据收集
波长（Ω）	0.907
单位-细胞参数（Ω）	一= 50.66,b条= 81.71,c（c）= 109.39
“空间”组	P（P）2₁2₁2₁
每个ASU的分子数	1
分辨率范围（Ω）	18.29–1.87 (1.97–1.87)
独特反射次数	38220 (5506)
多重性	4.0 (4.1)
数据完整性（%）	99.8 (100.0)
R（右）_合并†	0.064 (0.362)
〈我/σ(我)〉	15.7 (3.1)
模型详细信息
蛋白质原子	3184
水O原子	357
聚乙二醇（PG4）原子	13
HEPES（EPE）原子	15
细化详细信息
细化中使用的反射数	36303
R（右）所有数据的系数‡(%)	18.8
R（右）_自由的§(%)	22.7
模型
平均各向同性当量B类系数（Ω²)	25.8
MHC-I重量级B类系数（Ω²)	22.3
β₂-微球蛋白B类系数（Ω²)	31.3
肽B类系数（Ω²)	21.2
水B类系数（Ω²)	35.1
杂环化合物B类系数（Ω²)	51
最受欢迎地区的残留物¶(%)	91.4
一般不允许区域的残留物¶(%)	0

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ .
‡R（右）= $[\textstyle\sum\big||F_{\rm o}|-|F_}\rm c}|\big|/]$ $[\textstyle\sum|F_{\rm o}|]$ .
§作为R（右），但根据排除在精致。
¶计算依据PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等。, 1993

2.6.结构确定和精细化

该结构由分子置换使用程序相位器（麦考伊等。, 2005 )带HLA-B*1501（PDB代码1×9)作为搜索模型（罗德等。, 2006). 初始模型由HLA-B*1501重链和β₂m是使用自动生成的ARP协议/弯曲（科恩等。, 2004 )和剩余侧链被替换为吉赛德（科恩等。, 2004). 多轮人工检测和建模库特（Emsley和Cowtan，2004年 )随后在REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 1997 ). 这包括人工构建VQQESSFVM肽。最终结构包含HLA-B*1501（残基1-275），β₂m（残基1-99）、VQQESSFVM肽、一个假定的PEG片段、一个推定的HEPES分子和357个水（表1). MHC-Iα-链条β₂m链和结合肽在下文中分别称为“a”、“b”和“p”。该结构已保存在RCSB蛋白质数据库中，代码为3立方厘米。所有数字均采用PyMOL公司（德拉诺，2002 ).

3.结果和讨论

这是第三个晶体结构HLA-B*1501与肽复合物。之前的两个结构在肽（Röder）的第2位有Leu或Glu等。, 2006). 此处报告的结构在此位置具有Gln。此外，这两个报告的结构均以Tyr作为C末端肽残基，而该结构具有Met，它略微改变了肽C末端的位置。

3.1. 模型质量

目前HLA-B*1501肽结合沟的整体结构与之前确定的两个HLA-B*1501结构相似（Röder等。, 2006)和其他MHC-I分子（见图1). 该结构与之前发布的HLA-B*1501结构的结构叠加（PDB代码1×9)使用中的前181个CA原子α-链产生0.34Ω的根-平方偏差。该结构由重（a）链和轻（b）链的所有残基和结合肽（p）组成（见表1详细信息）。模型被改进为R（右）18.8%的值和R（右）_自由的值为22.7%。一般来说，电子密度是明确定义的，肽结合槽内的所有残基和肽残基都完全溶解（见图2). 此外α2肽结合槽的结构域已明确定义，如图1的插图所示。据推测氧化状态这种二硫键对肽结合沟与肽（Park等。, 2006 ). 当这个二硫键被氧化并且肽被结合时α1和α2个域被认为更稳定。在多种构象中发现了一些溶剂暴露残基（包括肽的pSer5）。Ramachandran分析估计，91.4%的残留物存在于有利区域，而在不允许的区域没有发现残留物。

图1
HLA-B*1501肽结合沟中的相互作用。HLA-I复合物从上方可见，直接朝向肽结合沟的底部。肽（VQQESSFVM）用黄色表示，肽N末端区域位于左侧。与肽相互作用的肽结合沟残基为黑色并标记。插件显示电子密度（1σ，距离为1º）α2螺旋。

图2
(一)结合肽配体。第2个F类_o（o）−F类_c（c）电子密度图（1σ)在肽周围显示1º。从侧面可以看到肽α2个螺旋线，将其N末端定位在左侧。(b条)肽结合槽的表面表示。对接的肽被电子密度网笼住，如(一).

3.2. 与结合肽的相互作用

除了pGlu4侧链外，HLA-B*1501结合槽中结合的肽的电子密度是明确的，pGlu4-侧链暴露在溶剂中，因此仅部分确定（见图2).

3.2.1. 肽残基1

C类^γ中pVal1侧链的原子A类口袋朝向aTrp167的芳香环系统，从而参与疏水相互作用。此外，如前所述，这种疏水性p1残基还与HLA-B*1501中的aTyr59和aLeu163残基相互作用（罗德等。, 2006). N端N原子朝向α2螺旋。这是不寻常的，因为水介导的氢键通常形成于蛋白质残基（Ogata&Wodak，2002 ). 在本结构中，相应的水分子（HOH287）与aTyr7、aTyr59和潜在的aGlu63形成氢键。

3.2.2. 肽残基2

pGln2肽残基位于B类在先前描述的HLA-B*1501–LEKARGSTY结构（Røder等。, 2006). 这种残留物被aArg62完全屏蔽，从而禁止与潜在的T细胞受体发生任何相互作用。pGln2残基与构成底部和顶部侧壁的aTyr7和aIle66发生疏水相互作用B类口袋。pGln2的N和O原子与aTyr9、aGlu63、aSer67和位于B类口袋。

3.2.3. 肽残基3

pGln3肽残基位于D类口袋并指向α2螺旋。该肽残基与aTyr99、aTrp156和aTyr 159形成疏水相互作用。此外，还观察到与两个水分子（HOH341和HOH539）的弱氢键，从而将肽桥接到HLA-B*1501侧链，从而进一步稳定该囊中的结合肽残基。

3.2.4. 肽残基4

pGlu4肽残基远离肽结合沟，侧链不与任何HLA-B*1501残基相互作用。pGlu4的这种取向使其可用于与T细胞受体的潜在相互作用。

3.2.5. 肽残基5

pSer5肽残基存在于两种构象中，都指向α1螺旋C类口袋。O型密封圈^γ原子在A类构象使N与氢键结合^δ2aAsn70的原子和aAlle66的骨架O原子都位于α1螺旋，并与位于表面的水分子（HOH327）形成弱氢键。在B类构象，N形成氢键^δ2aAsn70的原子和两个水分子（HOH79和HOH364）。

3.2.6. 肽残基6

pSer6肽残基指向β-肽结合槽的薄板底板。观察到的构象不与任何HLA-B*1501残基相互作用，但与肽和肽结合沟底部之间的两个水分子（HOH67和HOH348）形成氢键，从而与HLA-B*1501蛋白质形成水介导接触。因此，只有此位置的较大肽残基可能对MHC-I的整体结合有显著贡献。

3.2.7. 肽残留7

pPhe7肽残基暴露于溶剂中，并且直接指向远离肽结合槽的底部。这个残基的电子密度是明确定义的，表明pPhe7向α2螺旋。pPhe7的构象允许与位于α2螺旋段。该残基的主链N原子也与O形成氢键^∊1aGlu152残基上的原子。较大的aTrp147还排除了pPhe7残基侧链堆积到肽结合槽中的可能性，这迫使pPhe6残基暴露在溶剂中。pPhe7的定向使其可以与潜在的T细胞受体相互作用。

3.2.8. 肽残基8

该肽残基的侧链不接触任何HLA-B*1501残基。pVal8残留物从装订袋中突出。然而，由于pVal8的小尺寸，它不太可能是在T细胞受体对接和识别中起重要作用的主要肽残基。

3.2.9. 肽残基9

HLA-I肽结合沟的最后一个口袋是F类口袋。如前所述，HLA-B*1501，该口袋由疏水残基排列，可以容纳大型芳香残基，如Tyr和Phe（Röder等。, 2006). 目前的HLA-B*1501肽结构包含一个C末端蛋氨酸残基pMet9，该残基存在于延伸构象中，达到F类口袋。这个F类口袋由aLeu81、aLeu95、aTyr123和aTrp147排列，使得这个环境主要是疏水的。aSer116位于F类口袋并指向α肽结合沟的1个结构域。因此，aSer116指向远离停靠的pMet9侧链，并且无法与该C末端肽残基相互作用。pMet9和a114不仅对F类-口袋特异性，但也会影响HLA-I与tapasin的相互作用（Park等。, 2003 ; 坦马冯萨等。, 2006 ). 肽的C-末端O原子与N形成一个氢键^δ2aAsn80的原子和N的一个^ζaLys146的原子，稳定肽结合，同时屏蔽肽C末端与T细胞受体的相互作用。

支持信息

三维视图：3立方厘米

PDB参考：HLA-B*1501–VQQESSFVM复合物，3c9n，r3c9nsf

致谢

这项工作由丹麦同步辐射中心（DANSYNC）、EU 6FP 503231和NIH HHSN266200400025C资助。

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