2.1. 蛋白质表达和纯化

编码SARS-CoV M的DNA片段^{赞成的意见}菌株SIN 2774（阮等。, 2003)用PCR扩增Pfu公司聚合酶（Stratagene）并克隆到pMAL-c2x（新英格兰生物实验室）中，其中包含SARS-CoV M N末端的麦芽糖结合蛋白（MBP）^{赞成的意见}.正向引物（5′-TACTAATTGAAGGAGTTC公司GGGTTTTAGGAAAAATGG-3′）包含一个Xmn公司I站点（粗体）。反向引物（5′-AGCCGGATCC公司TTATTGGAAGGTAACCAG-3′）包含一个巴姆终止密码子TAA下游的HI位点（粗体）。引入四种额外的氨基酸（IEGR），以促进因子Xa去除MBP。改造后的BL21（DE3）大肠杆菌细胞在添加0.2%葡萄糖的LB培养基中于310 K下生长，直至OD_600纳米达到0.6–0.8。将IPTG加入到1mL的最终浓度M（M）将温度降至303K。2h后，在8000℃下离心收集细胞克10分钟，再次悬浮在缓冲器中A类（20米M（M）Tris–HCl pH 7.4，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）EDTA）并通过超声波溶解20分钟，然后在20 000下离心克在277 K温度下保持20分钟。将上清液加载到装有直链淀粉树脂（新英格兰生物实验室）的Econo-色谱柱（Bio-Rad）上，并与缓冲液进行平衡A类并在277 K下孵育过夜。融合蛋白在277 K下用20 m洗脱M（M）Tris–HCl pH 7.4，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）EDTA，10米M（M）麦芽糖并加载到HiPrep 16/10 Q Sepharose FF柱（Amersham）上，用缓冲液平衡B类（20米M（M）Tris–HCl pH值8.0，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）EDTA）。在缓冲液中使用线性NaCl浓度梯度洗脱蛋白质C类（20米M（M）Tris–HCl pH值8.0，1M（M）氯化钠，1米M（M）EDTA）。含有MBP-SARS-CoV M的馏分^{赞成的意见}在3000℃下通过超滤浓缩克（Centricon，Vivascience）并在20 m内脱盐M（M）Tris–HCl pH值7.0，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）氯化钙₂使用PD-10色谱柱（Amersham）。在297 K温度下，每142µg融合蛋白添加一单位因子Xa，持续6 h。裂解后，使用树脂（Qiagen）去除因子Xa。将裂解产物加载到缓冲液中平衡的XK 16/20苯基Sepharose树脂柱（Amersham）上D类（12.5米M（M）Tris–HCl pH值7.0，300 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT，0.1米M（M）EDTA）。重组SARS-CoV M^{赞成的意见}用缓冲液洗脱E类（12.5米M（M）Tris–HCl pH 7.0，1米M（M）DTT，0.1米M（M）EDTA）。含有SARS-CoV M的分数^{赞成的意见}合并，缓冲区更改为10 mM（M）Tris–HCl pH 7.4，1 mM（M）EDTA，1米M（M）浓度为5 mg ml的DTT⁻¹使用Bradford方法（Bio-Rad）测定，BSA为标准，储存于193K。

2.2. 结晶和数据收集

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒M的晶体^{赞成的意见}采用悬挂滴气相扩散法生长。将等体积（1µl）的蛋白质和母液混合在含有0.1M（M）MES pH 6.5和0.6M（M）（NH₄)₂所以₄291 K时，宏观播种在一周内产生了细长的板状晶体。为了收集数据，将晶体浸泡在含有30%甘油、0.1M（M）人工编码站，0.6M（M）（NH₄)₂所以₄pH 6.5，然后安装并在氮气气流中冷却至100 K（牛津冷冻系统）。在法国格勒诺布尔欧洲同步辐射设施的束线ID14-4上，使用0.125×0.050 mm的衰减光束在ADSC CCD探测器上记录衍射强度。使用来自中央对手方清算所4套（协作计算项目，第4期，1994年). 数据收集和细化统计如表1所示.

表1 数据收集和精炼统计学 括号中的值表示最高分辨率外壳。 数据收集统计    “空间”组 P（P）21212  单位-细胞参数（Ω） 一= 107.7,b条= 44.9,c= 54.2  分辨率范围（Ω） 28–1.90 (1.95–1.90)  独特的反射 19895  冗余 8.0 (5.9)  完整性（%） 97.9 (88.2)  我/σ(我) 4.6 (2.2)  R（右）合并†(%) 7.8 (31.4)  V（V）M（M）(Å三 Da公司−1) 1.95 精炼统计    R（右）‡(%) 22.5 (27.5)  R（右）自由的值（%） 26.4 (31.2)  蛋白质原子数 2302[301残留物]  溶剂分子数量 211  工作集中的反射数 19880  测试集中的反射次数 1077  平均温度系数（Ω2) 35.21  R.m.s.d.粘结长度（Ω） 0.006  R.m.s.d.粘结角（°） 1.31  R.m.s.d.二面角（°） 24.7  拉马钱德兰地块     最受欢迎地区（%） 87.7   额外允许的区域（%） 11.1   大面积允许区域（%） 0.8   不允许的区域（%） 0.4 †R（右）合并=. ‡R（右）=.

2.3.结构确定和精细化

SARS-CoV M的结构^{赞成的意见}很容易被解决分子置换使用程序AMoRe公司来自中央对手方清算所4套SARS-CoV M^{赞成的意见}作为PDB代码存放的结构1个uj1作为搜索模型。程序REFMAC公司5用于精炼循环，与使用程序重建会话交替进行O（运行）（琼斯）等。, 1991). 5%的反射被放在一边，以监测精炼使用R（右）_自由的因素。水分子，使用自动添加果皮/弯曲（佩拉基斯等。, 1999)通过目视检查。模型的质量使用PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等。, 1993). 结构叠加采用LSQKAB公司（合作计算项目，第4期，1994年）).

3.1. SARS-CoV M的总体结构^{赞成的意见}

该模型包括每个单体非对称单元（残留物1–301）。C-末端的五个残基在电子密度图中不可见，已被省略。残基1–101（结构域I）和102–184（结构域II）形成糜蛋白酶样双链-β-在几种病毒中观察到的筒状结构蛋白酶包括小核糖核酸病毒、弓形病毒和黄病毒（Babe&Craik，1997). C端子α-SARS-CoV M的螺旋结构域（残基201–301）^{赞成的意见}是活动所必需的，因为截断的片段仅包含催化域酶活性显著下降（Bacha等。, 2004). 冠状病毒M的结构和功能研究^{赞成的意见}已经表明，要获得最大蛋白酶活性，需要进行二聚反应。在这方面，七个氨基末端氨基酸发挥了重要作用，它们采用延伸构象，与其他单体的结构域II广泛接触，并确保形成催化活性位点（Yang等。, 2003). 在我们的晶体形式中，活性二聚体是通过晶体二重结构产生的。Ser1没有建立接触，它是移动的，如高于平均温度系数所示。然而，主链的路径与先前报道的活性单体中观察到的路径密切相关，300个等效主链原子的r.m.s偏差为0.80Ω（PDB代码1个uj1链A类; 杨等。, 2003)（图1一). 后一种晶体形式属于空间组 P（P）2₁并含有一个二聚体非对称单元具有准双重对称性。这表明N-末端残留物活性位点采用活性构象并非绝对必要。

图1 (一)C的整体叠加α来自SARS-CoV M的痕迹赞成的意见单体存在于我们的非对称单元（红色，PDB代码2c3个)用活性单体A类Yang的等。(2003)（以蓝色显示，PDB代码1个uj1，链条A类). 需要4.5°的剩余旋转才能使两个等效单体B类变成了巧合。每种单体的活性位点残基以棒的形式表示。(b条)以绿色棒表示的活动站点的详细视图(2c3个，本作品）叠加到活性单体上A类SARS-CoV M的赞成的意见(1个uj1，链条A类). 图中显示了空间守恒水分子（红色球体）形成的假定氢键（虚线）。

SARS-CoV主蛋白酶的热因子分布图可用作辅助材料。¹

3.2. 活动场地的结构

基底结合部位位于两者之间的一个缝隙中β--桶。使用催化Cys145-His41二元（半胱氨酸巯基作为亲核剂）代替丝氨酸的经典Ser-His-Asp三元蛋白酶（图1b条). 虽然晶体是在pH 6.5下获得的，但该值可能接近pK（K）_一底物结合位点中His残基的值，当酶显示出轻微的活性降低时，活性位点的构象表明是一种活性酶（图1b条). 活性位点附近与邻近分子发生广泛的分子间接触。因此，这种晶体形式可能更适合于涉及小化合物浸泡或共结晶的研究，而不是长时间的研究肽。有趣的是，在准备和提交这份手稿的过程中，SARS-CoV M的相关晶体形式^{赞成的意见}已由Hsu报道等。(2005)和Tan等。(2005).