1.1. 镧系元素

镧系元素（Ln）的原子序数为57–71，也称为稀土元素，是相对丰富的天然金属，在许多现代技术中得到了应用（科特鲁沃，2019; 德西蒙等。, 2018). 这些金属在其3中是稳定的+氧化状态[Ln（III）]在含水条件下，失去其5d日和6秒电子，但保持其4个如果电子与电子配置[Xe]4个如果^n个[其中n个=0–14，从La（III）到Lu（II）]（科特鲁沃，2019年; Daumann，2019年; Bünzli，2006年). 铈在4+氧化状态（富兰克林，2001).

第4个如果Ln（III）离子的价层被外层5屏蔽秒和5第页壳，结果为4如果位于阳离子深处的惰性外壳（Bünzli，2006; 三上等。, 2002; 埃文斯，2000). 这个埋了4个如果轨道对外层轨道的核电荷屏蔽能力较差，导致镧系元素尺寸相对较小，被称为“镧系收缩”（科特鲁沃，2019). 埋藏的另一个后果4如果轨道缺乏与配位配体的轨道重叠d日-嵌段过渡金属配位，导致有机镧系元素的相互作用，这些相互作用在性质上主要是离子性的（Cotruvo，2019; 三上等。, 2002). 与之形成鲜明对比的是，这些离子相互作用导致对配位几乎没有空间要求d日-块状过渡金属；因此，Ln（III）离子优先选择8–12的配位数（CN）（Jahn等。, 2018; 邓等。, 2018; 波尔等。, 2014; Bünzli，2006年; 富兰克林，2001; 香农，1976年). 埋藏和扩散的进一步后果4如果轨道和主要的离子相互作用是，Ln（III）离子几乎没有配位场分裂效应；因此，Ln（III）配合物具有快速的配体交换动力学（Bünzli，2006; 富兰克林，2001).

1.2. 镧系催化剂

Ln（III）化学，特别是高路易斯酸度，高电荷、快速配体交换动力学、高CN、灵活的配位几何结构和氧化还原惰性，使Ln（III）离子成为催化的理想选择（Cotruvo，2019; Lim&Franklin，2004年). 例如，NPAC–La（III）复合物能够水解DNA和RNA的磷酸二酯键（Baykal&Akkaya，1998）). 该复合物使用中性配体，以便不减少路易斯酸度La（III）（贝加尔和阿克卡亚，1998年). 这个路易斯酸度金属的高CN是发生催化作用所必需的（Franklin，2001; 小宫山幸等。, 1999).

尽管Ln（III）离子具有理想的催化性能，尺寸与Ca（II）相似，但人们认为Ln（II）离子由于其强大的催化能力而完全不存在于生命中路易斯酸度导致在中性pH下溶解度低（Peplow，2021; 科特鲁沃，2019年; Daumann，2019年; Allen&Imperiali，2010年; 富兰克林，2001; Firsching&Brune，1991年). 然而，2011年在革兰氏阴性甲基营养细菌中发现了第一种镧系元素酶，这表明Ln（III）离子可能在生物学中发挥重要作用，尽管这种作用很罕见（Fitriyanto等。, 2011; 火火等。, 2011).

由于其独特的化学性质，Ln（III）离子可能用于增强酶化学，允许合成非天然底物的周转，同时保持酶的高度区域选择性和立体选择性。事实上，含血红素的金属酶是通过引入非天然金属来代替铁而设计的，这导致了合成底物（Dydio）的非天然催化作用等。, 2017; 钥匙等。, 2016, 2017).

1.3. 生物中的镧系元素

以前的建议建议镧烯酶应该比现在更常见，例如Ln（III）比Ca（II）更适合催化（Lim&Franklin，2004）). 尽管如此，很少有已知的镧烯酶和镧蛋白的例子。

2011年首次描述的天然镧烯酶是XoxF-MDH，它是一种甲基脱氢酶（MDH），含有吡咯喹啉醌（PQQ）辅因子和Ln（III）辅因子，催化甲醇的双电子氧化（良好等。, 2020; Vu公司等。, 2016; 中川等。, 2012; 菲特里亚托等。, 2011; 火火等。, 2011). 还有一种Ca（II）结合的MDH类似物MxaF-MDH，可以催化甲醇的同样氧化（Chistoserdova&Lidstrom，1997; 安东尼和扎特曼，1964年一,b条). 这两种酶非常相似，只是在XoxF-MDH的Ln（III）配位域中添加了一个天冬氨酸，将CN从7增加到9，这满足了较高的CN偏好，并稳定了3+氧化状态（很好等。, 2020). 由于额外的配体，Ln（III）离子对XoxF-MDH的结合亲和力高于Ca（II）对MxaF-MDH（Nakagawa等。, 2012). 高电荷密度和路易斯酸度Ln（III）与Ca（II）的关系导致XoxF-MDH的催化效率高于MxaF-MDH（Nakagawa等。, 2012; 菲特里亚托等。, 2011; 火火等。, 2011). 这可能表明，正如2004年最初提出的那样，Ln（III）离子在酶中确实优于Ca（II），并表明镧系酶的开发将是一个富有成效的研究方向，可以产生催化效率高的酶（Lim&Franklin，2004). 自从这一发现以来，已经描述了更多的Ln（III）结合的醇氧化酶，如ExaF，一种乙醇脱氢酶（Good等。, 2016).

2018年，发现了一种Ln（III）结合蛋白，称为lanmodulin（LanM），它使用EF-hand基序结合Ln（II）离子（库克等。, 2019; 科特鲁沃等。, 2018). 该蛋白质的功能尚未确定，但清楚地表明Ln（III）离子对细菌王国中蛋白质折叠和功能的更大贡献潜力（Featherston&Cotruvo，2021; 科特鲁沃等。, 2018). Lanmodulin为设计Ln（III）螯合剂提供了经验教训，因为LanM EF-hand相对于钙调蛋白EF-hand具有额外的天冬氨酸，从而满足Ln（II）离子的高CN偏好和高电荷，但也表明金属（Cook）之间的结合域相似等。, 2019; 科特鲁沃，2019年; 科特鲁沃等。, 2018). 值得注意的是，这种差异使兰姆素对Ln（III）的结合亲和力高于钙调蛋白对Ca（II）的结合亲合力；这些都在微摩尔范围内（VanScyoc等。, 2002; 林瑟等。, 1991).

迄今为止，已有一个工程化镧烯酶的例子，即钙调素的EF-hand基序与雕刻同源结构域的螺旋-转-螺旋基序融合形成的嵌合33米金属肽“P3W”（Sirish&Franklin，2002）; 基姆等。2001年; 韦尔奇等。2001年). 这种嵌合体的设计是通过钙调蛋白结构和雕刻的同源结构域的叠加实现的，它们具有非常相似的结构。由于Ln（III）离子靠近磷酸二酯键，嵌合体允许超螺旋DNA结合和水解。总的来说，这些酶提供了一个基本证据，即镧系酶可以被工程化，并且Ln（III）离子保持足够的路易斯酸度当被带负电荷的配体配位时，用于催化。

大多数将Ln（III）离子与蛋白质进行协调的工作都是为了X射线晶体学或核磁共振的目的，并且都是使用通过非天然氨基酸或半胱氨酸残基连接的合成有机多齿配体（Herath等。, 2021; 洛等。, 2013; Allen&Imperiali，2010年; 席尔瓦吉等。, 2007). Ln（III）离子非常好地散射X射线，因此可以帮助解决相位问题求解晶体结构时（Silvaggi等。, 2007; 哈克，1956年). Ln（III）离子也可用于核磁共振研究，因为它们具有顺磁性，可在蛋白质中产生与离子高达40º的假接触位移；因此，用Ln（III）离子标记蛋白质可以提供长程结构信息（Pilla等。, 2017; 八木等。, 2013; 施密茨等。, 2012; Allen&Imperiali，2010年). 然而，对于晶体学，Ln（III）离子必须相对于蛋白质有序，并且对于NMR，Ln（III）迁移率导致信息减少；因此，需要高亲和力Ln（III）结合标签（Allen&Imperiali，2010). 因此，蛋白质核磁共振实验中使用的Ln（III）结合标签具有适应Ln（II）离子的必要特征：高CN和硬路易斯碱配体（赫拉斯等。, 2021; 卢等。, 2013).

镧烯酶的开发可能会产生能够使用非天然底物催化非自然反应的生物催化剂，从而在温和条件下在低温下产生潜在有用的产品。在这项工作中，我们描述了一种镧系结合模型酶。磷酸三酯酶（PTE），双核锌（II）金属酶从缩小假单胞菌，之前经历了定向进化，将其活性从磷酸三酯酶转变为2-萘基己酸酯酶（2NH）；该工程途径中的第18轮变异体（PTE-R18）在活性位点内有一个额外的锌（II）结合位点，表明对两种二价金属（Tokuriki等。, 2012). PTE-R18是由PTE突变H254R、D233E、F306I、I274S、T172I、S269T、M138I、T199I、L272M、A80V、S111R、A204G、L130V、L271F、A49V、K77E、L140M和I313F（Tokuriki等。, 2012). 考虑到PTE在二价金属配位中的天然杂乱性，再加上结合两个阳离子的特异性的额外损失，推测PTE-R18可能具有在其活性部位结合异常金属的潜力。Ln（III）离子是一个有趣的候选者，因为与Zn（II）离子相比，它们更大的尺寸可能导致PTE-R18中不寻常的“第三”结合位点的单核占据。在这里，我们使用X射线晶体学和等温滴定法描述了这些单核Ln（III）–PTE-R18配合物的配位和亲和力热量测定，我们发现酯酶活性是由酶维持的。

2.1、。PTE-R18的生产和纯化

PTE-R18在pETMCSI-PTE-R18中过度表达（参见支持信息). 如前所述进行生产和净化（坎贝尔等。, 2016).

2.2. apo PTE-R18的形成和验证

通过两轮透析从PTE-R18中去除锌（II）螯合作用缓冲器（5 mM（M）HEPES，100米M（M）氯化钠，5米M（M）1,10-菲咯啉（pH 8.0）以1:100的比例通过蛇皮透析管10K MWCO 35 mm（美国赛默飞世尔科技公司）在4°C下24小时。螯合剂1,10-菲罗啉随后通过四次交换与透析缓冲液（5 mM（M）HEPES，100米M（M）NaCl pH值8.0），以1:100的比例通过蛇皮透析管10K MWCO 35 mm，在4°C下持续8小时。通过SDS-PAGE测定PTE-R18保留率。通过100 n孵育证实了apo PTE-R18的形成M（M）2.5m酶M（M） 第页-检测缓冲液中的丁酸硝基苯酯[20mM（M）Tris，100米M（M）氯化钠，2.5%(v（v）/v（v）)甲醇pH值8.5]，阳性对照品含100µM（M）氯化锌₂，并在405nm处分析室温下20min的吸光度。

2.3. 结晶

所有蛋白质都被缓冲交换为20 mM（M）HEPES，50米M（M）NaCl pH 8.0，3000离心克在结晶之前，使用Amicon Ultra-15离心过滤器10kDa MWCO在4°C下过滤。所有晶体均在4°C下用100 mM（M）碳酸钠，14%(v（v）/v（v）)MPD pH 6.5作为悬浮滴扩散的母液（ML）。Zn-PTE-R18（22 mg ml⁻¹)以2:1 ML:蛋白质比结晶。这些晶体被手动粉碎，用作锌种子原料。

载脂蛋白PTE-R18（12 mg ml⁻¹)在1.5:1:0.5 ML:蛋白质：锌种子储备（1×10）下结晶⁻⁸稀释）比率。这些晶体被手动粉碎以用作apo种子原料。

载脂蛋白PTE-R18（10 mg ml⁻¹)用2.77米孵化M（M）La（否_三)_三，Pr（否_三)_三，Sm（否_三)_三，氯化铕_三或GdCl_三在4°C下保持30分钟，形成Ln-PTE-R18。Ln-PTE-R18（10毫克毫升⁻¹)在1.5:1:0.5 ML:蛋白质：载脂蛋白种子库（1×10）下结晶⁻⁸稀释）比率。所有晶体均在100 m范围内手动循环和低温保护M（M）碳酸钠，40%(v（v）/v（v）)MPD，0.92米M（M）LnCl公司_三pH 6.5，随后立即在液氮中闪蒸冷却。

2.4. 荧光扫描

为了评估晶体样品中是否存在镧系元素发射光谱使用硒进行测量K（K）-在澳大利亚同步加速器（Aragáo）的MX2光束线上使用BL_3ID1进行边缘检测，输入能量为12 857.8 eV，扫描时间为30 s等。, 2018).

2.5. 结构确定

衍射数据是在澳大利亚同步加速器（Aragáo）的光束线MX2上收集的等。, 2018). 在13和9.5 keV下收集apo PTE-R18结构的数据，在9.5 keV下收集Ln-PTE-R17结构的数据以收集镧系元素引起的异常数据。所有数据都是在光束衰减70%的情况下收集的，apo和Eu（III）结合结构的探测器距离为130 mm，Gd（III）结构的探测器间距为150 mm。

使用索引和集成数据XDS公司，然后使用无AIMLESS在中实施中央处理器4（Evans&Murshudov，2013）; 阿吉雷等。, 2023; 卡布什，2010年). 所有结构均由求解分子置换使用相位MR在内部实施中央处理器4，使用PDB条目4e3吨作为搜索模型（Tokuriki等。, 2012; 阿吉雷等。, 2023; McCoy，2007年; 麦考伊等。, 2007). 使用菲尼克斯定义和库特版本0.9.8.7（Afonine等。, 2012; 埃姆斯利等。, 2010).毫发_o个负极DF公司_c（c）密度用于模拟替代构象，以及B使用菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012). 使用以下方法验证了结构摩尔概率.凤凰版本1.20.1生成了细化统计（表1; 利布施纳等。, 2019; 阿富汗等。, 2010). 最终确定的结构在中进行了可视化和分析PyMOL公司版本2.5.3（DeLano，2004). 使用检查我的金属服务器（Gucwa等。, 2023; 搬运等。, 2018; 郑等。, 2014, 2017).成本加保险费、运费坐标和结构因子的文件是使用pdb提取物并使用wwPDB验证系统（Yang等。, 2004).

2.6. 等温滴定量热法

等温滴定法测定Eu（III）和Gd（III）与载脂蛋白PTE-R18的结合化学计量热量测定法使用Nano ITC低容量量热计（TA Instruments）进行。所有实验均在20°C下进行，搅拌速度为200转/分⁻¹，连续注射23×2µl 1.5 mM（M）氯化铕_三和2米M（M）氯化钆_三至238和360µM（M）apo PTE-R18（单体浓度），具有360s的间隔。

数据集成使用NITPIC公司版本1.2，然后使用SEDPHAT公司版本12.1（Scheuermann&Brautigam，2015; 赵等。, 2015). 使用A+B分析数据↔ AB异质关联模型和Marquardt–Levenberg方程，以拟合数据的函数。使用绘制和可视化数据古斯语.

2.7. Ln（III）-PTE-R18活性测定

为了测定Eu（III）和Gd（III）结合PTE-R18的活性，量化了2NH的水解。分析包括500µM（M）氯化铕_三或GdCl_三, 50 µM（M）apo PTE-R18，10米M（M）2NH基质和5%(v（v）/v（v）)甲醇，在20m内进行M（M）特里斯，150米M（M）氯化钠pH值7.0或8.0。反应在室温下孵育并混合42小时。在没有apo PTE-R18的情况下进行对照反应。用4.5倍体积的乙腈和2.2 m处理反应M（M）1,3,5-三甲氧基苯，然后通过0.22µm过滤器过滤，并在氮气下浓缩。2-萘酚（2N）的形成由¹使用CDCl在400 MHz下的核磁共振氢谱_三.

3.1. apo PTE-R18的形成

使用强螯合剂1,10-菲咯啉去除共纯化和紧密结合的锌（II）离子，以允许镧系元素结合在PTE-R18的活性部位。通过比色分析和载脂蛋白PTE-R18晶体的X射线衍射实验证实了锌（II）的去除。

3.1.1. 水解分析

测试水解锌（II）的去除酶活性反对对位-对硝基苯丁酸酯（pNPB）进行评估。先前的工作已经证明PTE-R18具有快速水解的能力对位-乙酸硝基苯基酯，产生黄色产物（Tokuriki等。, 2012). 水解反应的产物，对位-硝基苯酚(对位-硝基苯酚（pH 8.5），通过405 nm处的吸光度进行测量（图1). 透析酶显示完全缺乏对位-硝基苯酚的产生，在405 nm处的吸光度与缓冲液对照的吸光度相似，而补充锌的载脂蛋白PTE-R18样品在405纳米处的吸光度迅速增加，表明透析蛋白活性丧失，从而成功去除锌（II）。重组酶实现了2.5 m的完全水解M（M）～30秒后的pNPB，导致估计k个_猫809±165秒⁻¹，与报告中的相比k个_猫用于880±30 s的酯2NH水解⁻¹，证明透析后的蛋白质可以与金属离子重新组合，从而产生天然的全酶活性（Kaltenbach等。, 2015). 先前的工作也表明，1,10-菲罗啉能够从PTE-R18中螯合Zn（II），并且PTE-R18以apo形式稳定（Tokuriki等。, 2012).

图1 帕拉-丁酸硝基苯水解试验。帕拉-405 nm处的硝基苯酚吸光度，用20 m的缓冲液在5 min内测量M（M）Tris，100米M（M）氯化钠，2.5%(v（v）/v（v）)甲醇pH值8.5（品红色），带100µ的缓冲液M（M）氯化锌2（黑色），100 nM（M）透析蛋白（青色）和100nM（M）透析蛋白和100µM（M）氯化锌2（绿色）(N个= 3).

3.1.2. Apo PTE-R18晶体学

从13和9.5 keV的apo PTE-R18晶体中收集X射线衍射数据，以最大化反常散射分别来自Zn（II）和Ln（III）离子（表1). 这是为了确认载脂蛋白PTE-R18活性位点中没有金属离子。13 keV（1.50Ω分辨率；PDB条目8个uqw)和9.5 keV（1.52º分辨率；PDB条目8个uqx)结构显示，在活性部位的预期Zn（II）位置缺乏异常信号，这表明成功去除了Zn（Ⅱ），并且没有任何异常散射体，这可能会与Ln（III）信号混淆（图2一和2c（c）). 然而，在9.5 keV结构中，6σ存在于活动部位；在噪声以上的13 keV结构中不存在此信号。异常信号被认为是氯离子引起的K（K）边缘（2.8 keV），因此在两种结构中都被建模为氯化物，考虑到Lys169的接近性和纯化缓冲液样品中NaCl的丰度（Merritt，2012).

图2 载脂蛋白PTE-R18的结晶研究。(一)apo PTE-R18链的结构A类从13 keV（PDB条目）收集的数据中获得的活跃站点8个uqw). (b条)用于收集13keV衍射数据的apo PTE-R18晶体的荧光发射。(c（c）)载脂蛋白PTE-R18链的结构A类从9.5 keV收集的数据（PDB条目8个uqx)异常图为3σ（青色）和5σ（洋红色）。(d日)用于收集9.5keV衍射数据的apo PTE-R18晶体的荧光发射。

对晶体进行的荧光扫描显示，在Zn（II）（8630、8615和9572 eV）、Eu（III）（5845、5816、6456、6843和7480 eV）和Gd（III）的预期值（6057、6025、6713、7102和7785 eV）下，缺少X射线发射线（图2b条和2d日)，再次表明从PTE-R18中去除了锌（II），并且晶体中不含Ln（III）（Bearden，1967; Kortright和Thompson，2009年).

在两个PDB条目中8个uqw和8克x活性位点残基Lys169在两种不同的构象中建模（图2一和2c（c）); 通常Lys169在金属结合后会发生自发羧基化，并直接与活性中心Zn（II）离子（Tokuriki等。, 2012). 然而，在apo结构中，Lys169脱羧，因此能够采用两种构象。

在这两个结构中，链的剩余量为260–275A类由于缺乏电子密度，无法建模，而在链中B这些残留物被模拟成清晰密度。这个环（环7）在催化过程中固有地经历构象波动（Jackson等。, 2009; 考德威尔等。, 1991). 先前将野生型PTE定向进化为PTE-R18导致环路7稳定，环路7能够嵌入两条链中A类和BZn-PTE-R18晶体结构（坎贝尔等。, 2016; 德力等。, 2012). 这表明，锌（II）的去除导致环7的流动性增加，这在链中观察到A类的晶体结构，但链条的第7环B通过稳定晶体接触使其刚性化，并能够进行建模。

野生型PTE的先前结构表明apo PTE晶体结构与晶体结构全酶（本宁等。, 1994, 1995). 相反，我们的apo PTE-R18结构与全酶晶体结构非常相似，PDB条目的r.m.s.d.值为0.184和0.191 Au8个uqw和8个uqx，分别针对PDB条目4e3吨（托克里基等。, 2012). 这表明酶的结构在先前进行的实验室定向进化过程中得到了稳定，从而产生了一种脱辅基酶晶体结构这与全酶相似。

3.2、。单核镧系元素结合

3.2.1、。Ln（III）-PTE-R18结晶学

选择一系列Ln（III）离子进行共结晶，以提供半径和路易斯酸度，与载脂蛋白PTE-R18共结晶的La（III）、Pr（III），Sm（III。在9.5 keV下从所得晶体中收集衍射数据，以最大化反常散射任何结合的Ln（III）离子。用La（III）、Pr（III）和Sm（III。Eu（III）均为界（1.78μ分辨率；PDB条目8个月)和Gd（III）界限（1.61°分辨率；PDB条目8个单位)结构显示活性部位内有一个强烈的单球异常信号，表明Ln（III）与PTE-R18的单核结合（图3一和3c（c）). 与Zn（II）相比，Eu（III）和Gd（III）的离子半径更大，这可以解释在活性部位只容纳一个离子的观察结果。这些异常信号超过12个σ和40σ分别用于Eu（III）和Gd（III），以支持其在结构中的放置。然而，这些异常信号仅出现在链中A类PTE-R18二聚体在两种结构中的表达。将金属建模为该密度，并将Eu（III）和Gd（III）的占用率分别精炼为16%和24%。这些低占有率值和链中金属的存在A类这可能是与载脂蛋白PTE-R18弱结合的结果，也可能是大量溶剂分子（如高浓度的二甲氨基甲酸酯或MPD）与Ln（III）配位的结果，这些溶剂分子会将Ln（II）从PTE-R18。此外，Ln（III）离子仅存在于链中A类二聚体的形成可能是链间构象或动力学改变的结果；链中A类由于缺乏电子密度，Gd-PTE-R18结构的残基260-274（Eu-PTE-R18中为260-275）无法建模，而链中B对这些残留物进行了建模；apo PTE-R18结构也是如此。

图3 Ln（III）-PTE-R18的结晶研究。(一)根据9.5 keV（PDB入口）收集的数据得出的Eu-PTE-R18活性位点的结构8个月)异常图为5σ（青色）和10σ（品红色）。(b条)Eu-PTE-R18晶体的荧光发射。(c（c）)根据9.5 keV（PDB入口）收集的数据得出的Gd-PTE-R18活性位点的结构8个单位)异常图为4σ（青色）和20σ（洋红色）。(d日)Gd-PTE-R18晶体的荧光发射。

我们期望两条链条A类和B约束Ln（III）。然而，Ln（III）与PTE-R18的结合可能不像Zn（II）那样稳定环7，这将解释链的环7缺失的电子密度A类在Ln（III）束缚结构中。链中缺少Ln（III）B可以解释如下：当链的第7环B采用结晶所需的刚性构象，单体形成无法与Ln（III）配位的构象，有可能从活性部位喷射出任何大的Ln（II）离子，从而形成链B晶体中不含金属。或者，Ln（III）离子与链的结合A类PTE-R18可能导致链的轻微构象变化B这使得随后的Ln（III）结合不利，导致Ln（II）离子仅与二聚体的一条链结合。

尽管如此，荧光扫描显示了Eu（III）和Gd（III）的预期值的X射线发射线（图4b条和4d日)，进一步表明Eu（III）和Gd（III）是配位金属（Bearden，1967; Kortright和Thompson，2009年).

图4 ITC分析Ln（III）与PTE的结合。使用A+B处理金属与apo PTE-R18结合的ITC数据↔ AB结合模型(N个= 1). (一)EuCl等温线三. (b条)GdCl等温线三.

Eu（III）-和Gd（III）-结合的结构在PTE-R18活性位点内显示出相同的配位，由His55、His57、Asp301、H配位₂O（PDB条目中的2528个月PDB条目中的和1588个单位)和一个Cl^负极Lys169桥接（图3一和3c（c）). Ln（III）离子的位置与α-先前PTE-R18结构中的Zn（II）离子（PDB条目4e3吨,4加仑和4加仑1)具有非常相似的配位，由Asp301中具有两个配位键而非一个配位的Ln（III）离子和具有桥接Cl的Ln^负极而不是羧化Lys169（Tokuriki等。, 2012). 这相当出乎意料，因为Zn-PTE-R18的结构表明Lys169是羧基化的，提供了两个硬配位的O原子；然而，在Eu（III）和Gd（III）结合结构中并非如此，尽管这些金属倾向于硬Lewis碱和高配位数。此外，桥接Cl^负极与直接氨基酸配位相比，熵有利性较差，但Cl^负极在apo结构中存在，表明结合的熵成本相对于Cl不会很大^负极离子。

有趣的是，这两个Ln（III）离子都与组氨酸残基配位，这在蛋白质结构中以前没有观察到，并且具有六个CN，与蛋白质有五个配位键。这种低CN，再加上稍微柔软的组氨酸的配合，可能是结构中金属占用率低的原因。通常情况下，镧系结合蛋白结构的CN为9–10，尽管有些报道低至7，这些配位基团是硬路易斯碱，通常是氧。事实上从头开始镧系结合蛋白之前由Zeymer小组设计，含有四个配位谷氨酸残基和一个水，而Franklin小组的工程嵌合核酸酶则使用一个谷氨酸、三个天冬氨酸和一个Thr残基（Caldwell等。, 2020; Sirish和Franklin，2002年; 基姆等。2001年; 韦尔奇等。2001年). 此外，天然镧系结合蛋白XoxF和LanM被描述为分别使用两个Asp、一个Glu和一个Asn残基以及三组辅因子PQQ和一个Glu4个Asp和一个Thr残基（库克等。, 2019; 科特鲁沃，2019年; 科特鲁沃等。, 2018; 波尔等。2014年).

这些结构说明了PTE-R18在二聚酶的一条链的活性部位结合Eu（III）和Gd（III）的能力，并表明组氨酸可以作为镧蛋白中金属离子配位的配体。

3.3. Ln（III）-PTE-R18的酯酶活性

催化相关金属离子与PTE-R18活性位点的配位使我们假设催化活性。鉴于载脂蛋白PTE-R18对活性更强的pNPB没有酯酶活性，我们测试了对2NH的酯酶活性（表2)PTE-R18已被证明可水解（Tokuriki等。, 2012).

动力学分析表明，在这些条件下，Eu（III）和Gd（III）水溶液对2NH没有检测到的酯酶活性，而Eu（II）和Gd-（III。与pH值7.0相比，Eu（III）-PTE-R18和Gd（III）/PTE-R18在pH值8.0时的转化率增加，这可能是Eu（II）和GdK（K）_一值分别为7.66和7.87，导致金属离子配位水在pH 8.0下的脱质子增加，形成更强的亲核剂针对2NH的羰基攻击，符合PTE-R18的拟议机制（Brown&Ekberg，2016; 德力等。, 2012). 因此，尽管PTE-R18与单个大金属阳离子进行了配位，但它能够在活性位点内结合2NH，Ln（III）全酶能够催化酯键水解。