2.1、。基因合成与蛋白质过度生产

含有dmmarA公司该基因是商业合成的（荷兰BaseClear B.V.）。该结构包含NdeI和XhoI限制位点、卡那霉素抗性和C末端的六组氨酸标签。pET-24a-DmmarA质粒携带dmmarA公司基因被转化为化学活性大肠杆菌使用热冲击法的BL21（DE3）电池（冰上30分钟，42°C下50秒，冰上3分钟）。添加200µl SOC（含有分解代谢阻遏物的超级最佳培养液）培养基，并在37°C下培养细胞1 h，然后用卡那霉素（35µg ml⁻¹)在37°C下过夜。第二天，通过将几个菌落转移到带有卡那霉素（35µg ml）的10 ml LB培养基中来制备预培养物⁻¹). 前培养物在37°C和200 rev min下培养⁻¹持续3 h。每次预培养都用卡那霉素（35µg ml）接种1 l LB培养基⁻¹)并在37°C和130转/分下培养⁻¹直到光学密度（外径₆₀₀)达到0.4–0.6。通过添加异丙基诱导基因表达β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），最终浓度为200µM（M）（0.5毫升1M（M）1 l LB介质中的IPTG）。细胞在20°C和130转/分下培养⁻¹一夜之间。第3天，通过离心（4°C和4000转/分）收集细胞⁻¹持续10分钟）。丢弃上清液，将每个2 l LB培养基中的颗粒重新悬浮在30 ml缓冲液（10 m）中M（M）特里斯，50米M（M）甲酸钠，10 mM（M）咪唑（pH 8.5）。将收获的细胞质量储存在−70°C下。

2.2. 两步色谱法纯化蛋白质

将含有收获细胞的悬浮液解冻，并添加90µl DNAse（～2µg ml⁻¹). 使用Fisherbrand 705型声波分解器在三个2分钟周期内对细胞悬浮液进行声波分解。将破坏的细胞离心（4°C和14000转/分⁻¹持续1小时）。然后过滤蛋白质并将其装入在缓冲液中平衡的BioLogic DuoFlow FPLC系统（美国Bio-Rad）A类（10米M（M）特里斯，50米M（M）甲酸钠，10 mM（M）咪唑（pH 8.5）和缓冲液B类（10米M（M）特里斯，50米M（M）甲酸钠，500米M（M）咪唑（pH 8.5）。通过金属亲和性纯化蛋白质色谱法使用镍填充柱，流速为1ml min⁻¹用逐渐增加的咪唑梯度（0%、10%、60%和100%缓冲液）洗脱蛋白质B类; 以10%和60%梯度洗脱DmmarA）。使用Amicon Ultra-15离心过滤装置（10 kDa截止值）将60%咪唑梯度的纯化蛋白质浓缩至～5 ml。

将5 ml蛋白质加载到在凝胶过滤缓冲液（10 m）中平衡的Ala KTApure FPLC系统（瑞典Cytiva）上M（M）特里斯，50米M（M）甲酸钠（pH 8.5）。通过以下方法纯化蛋白质尺寸排除色谱法使用Superdex 16/60 200 pg色谱柱（英国GE Healthcare）。SDS–PAGE用于检查来自亲和层析和尺寸排除色谱法（在200 V和400 mA下运行40分钟）。

2.3. 差示扫描荧光法

浓度为0.48 mg/ml的纯化蛋白质⁻¹用于蛋白质稳定性测量。通过差示扫描荧光法在三个毛细管中对纳米级普罗米修斯NT.48进行酶的热去折叠分析。实验在20至98°C的温度范围内进行。熔融温度由350 nm和330 nm处色氨酸荧光的比值推算得出。

2.4。结晶实验

蛋白质浓缩至～10 mg ml⁻¹用于晶体学实验。最初，在20°C下，使用Gryphon LCP结晶机器人（Art Robbins Instruments，USA）在96孔板（瑞士SWISSCI）中使用坐滴蒸汽扩散技术（沉淀剂与蛋白质的比例为1:1或1:2）进行结晶筛选。实验中使用了几个商业屏幕。

一周后，在显微镜下监测晶体生长，并在18°C下使用悬挂滴蒸气扩散技术（1:1、1:1.5或1:2沉淀剂：蛋白质比和500µl沉淀剂溶液）在15孔板（美国EasyXtal）中进一步测试合理条件。在此筛选中测试了不同PEG浓度。一周后，选择最佳结晶条件。在两种溶液中发现了晶体，第一种溶液由0.02组成M（M）千赫₂人事军官₄, 0.1 M（M）双三丙烷pH 6.5，22%PEG 3350，第二种由0.2组成M（M）醋酸铵，0.1M（M）双峰pH 5.5，20%聚乙二醇3350。在这些条件下获得的晶体在液氮中在与补充20%甘油的结晶溶液相对应的冷冻溶液中冷却。

2.5. 数据收集和结构优化

X射线衍射数据在SLS同步加速器的PXIII光束线上以1.0º的波长收集。使用XDS公司软件（Kabsch，2010)数据在无AIMLESS（Evans&Murshudov，2013年). 的内容非对称单元通过计算马修斯系数进行估算（Weichenberger&Rupp，2014).分子替换由执行相位器（麦考伊等。2007年)在中菲尼克斯软件套件（Liebschner等。, 2019)使用由构建的DmmarA模型瑞士模式（水屋等。, 2018)基于其与卤代烷脱卤酶LinB（PDB条目）53.57%的序列相似性4波分（wdq）; 布雷佐夫斯基等。, 2016). 几个自动循环精炼是在年进行的凤凰结构在库特（埃姆斯利等。, 2010). 配体的构建使用肘部（莫里亚蒂等。, 2009). HLD二聚体的结构与SSM叠加中的函数库特（埃姆斯利等。, 2010). 最终结构在中可视化PyMOL公司（版本2.0；薛定谔）。

2.6. 使用结构生物信息学工具进行蛋白质表征

蛋白质界面由PDBePISA公司服务器（Krissinel&Henrick，2007）)链之间的非共价相互作用用物价指数web工具（Adasme等。, 2021). 使用MAFFT公司服务器（加藤等。, 2019)，序列和二级结构的相似性由电子脚本（Robert&Gouet，2014）). HLD蛋白结构使用DALI公司服务器（霍尔姆，2020).字母折叠2（米尔迪塔等。, 2022)用于预测DmmarA的构象和组装。

2.7. 小角度X射线散射（SAXS）

通过SAXS测定DmmarA在溶液中的低聚状态。SAXS数据收集于CEITEC（捷克共和国布尔诺）的Rigaku BioSAX-1000室。通过以下方法纯化蛋白质尺寸排除色谱法在50 m内平衡的垂直KTApure FPLC系统（瑞典Cytiva）上M（M）醋酸钠，10 mM（M）Tris pH值8.5，配备HiLoad 16/600 Superdex 200预颗粒柱（英国GE Healthcare）。使用三种不同浓度的酶测量SAXS数据：2、4.5和8.7 mg ml⁻¹。缓冲区来自尺寸排除色谱法（50米M（M）醋酸钠，10 mM（M）Tris pH 8.5）用作空白。散射曲线拟合到结晶单体和二聚体结构，使用CRYSOL公司从ATSAS公司v.2.8.4（斯维尔根等。1995年).从头算建模由执行达明从ATSAS公司（斯维尔根，1999年). SAXS从头算模型与DmmarA的晶体结构叠加在一起SUPCOMB公司从ATSAS公司（Kozin和Svergun，2001年)并在中可视化PyMOL公司.

2.8. 分子对接

配体的结构(R（右）)-和(S公司)-2-溴戊烷和2-溴己烷的对映体构建于阿伏加德罗1.2.0（汉维尔等。, 2012)并使用通用力场（UFF；Rappe等。, 1992)和最速下降算法。半经验AM1-BCC函数（Jakalian等。, 2000, 2002)使用前室的模块琥珀色工具14（案例等。2014年). 所提议的荧光化合物的三维结构是在阿伏加德罗并使用UFF力场和最速下降算法最小化。受体的三维结构来自RCSB蛋白质数据库（Berman等。, 2000)用于DbjA（PDB条目32万; Prokop公司等。, 2010)或在解出晶体结构（DmmarA）后从这项工作中获得。只使用了每个结构的第一条链条，链条与PyMOL公司（版本1.7.4；DeLano，2002). 去除了水分子、离子和共结晶分子。还去除了几个残基的双侧链，只留下在所有结构中更常见的构象。H原子被添加到缺少它们的结构中减少的程序琥珀色工具14（案例等。2014年)使用位置的动态优化(-建造-核选项）。将PDB格式的配体和受体的输入文件转换为AutoDock葡萄酒-兼容格式PDBQT使用MGL工具（桑纳，1999年)，保持配体先前计算的原子电荷。卤代烷脱卤酶的活性位点被选择为分子对接的感兴趣区域AutoDock葡萄酒1.1.2（Trott和Olson，2010年). 该区域由一个20×20×20Ω的方框表示，该方框以DmmarA催化残基Asp95的CG原子坐标为中心。将穷竭性参数定义为100，以增加构象搜索，能量范围增加到10 kcal mol⁻¹为了获得更多的绑定姿势，保存的最大模式数增加到了20个。对接姿势使用Smina评分函数重新评分（Koes等。, 2013).

所有对接绑定模式都使用PyMOL公司版本1.7.4。S的产生性结合模式（近攻击构象；NAC）的识别_N个2反应基于亲核剂根据Hur等。(2003)：其中一个亲核剂羧基O原子（Asp95 OD原子；DmmarA中的残基编号）和卤素结合的C原子必须d日_O-C公司≤3.41º，O、C和卤化物原子形成的角度α_O-C-Br型≥ 157°. 如前所述（Daniel等。, 2015)，我们还需要反应性Cl原子和卤化物稳定残基之间至少弱的氢键，由Trp96的卤化物和吲哚极性H原子之间的距离和Asn28的侧链NH氢之间的距离定义d日_溴化氢≤ 3.0 Å. 在一些情况下，只发现了准NAC模式，其中超过了先前的一些几何要求。

2.9. 绝热映射

我们研究了势能沿反应坐标使用量子力学/分子力学（QM/MM）混合方法（Ranaghan和Mulholland，2010; 朗斯代尔等。, 2012)评估S的能量分布_N个2-溴代戊烷的两个对映体与DmmarA的反应，并计算各自的能量垒，ΔG公司^‡为此，如上所述确定的生产性对接绑定模式（NAC）需要进行QM/MM计算（Walker等。, 2008)在中实施琥珀色每个结构的拓扑由tLEaP（发光二极管阵列）的模块琥珀色工具14，使用ff14SB（Maier等。, 2015)蛋白质的力场和配体的PREPI参数，从包含如上所述获得的部分原子电荷的MOL2文件中获得。配合物在真空中被最小化(igb=6). 进行了五轮优化，每轮包括500个最陡下降循环，然后是500个共轭梯度循环，作为（i）一步，所有重原子均受到500 kcal-mol的简谐力常数的约束⁻¹ Å⁻²和（ii）四个步骤，减少对蛋白质主链原子的限制力常数500、125、25和1千卡摩尔⁻¹ Å⁻².沿反应坐标由执行砂光机的模块琥珀色16（案例等。, 2016). 系统的QM部分包含配体分子、催化天冬氨酸（Asp95）的侧链和卤素稳定残基（Asn28和Trp96），并带有电荷-1。半经验PM6哈密顿量（Stewart，2007)用于处理系统的QM部分，而ff14SB力场用于处理MM部分。QM/MM边界通过显式链接原子进行处理，QM/MM电荷相互作用的截止值设置为999º。主干受到1.0 kcal-mol的力常数约束⁻¹ Å⁻². The反应坐标定义为Asp95最近的OD原子与受攻击配体的C原子之间的距离。这个反应坐标以0.025Ω的减量进行跟踪，每个减量都涉及有限记忆Broyden–Fletcher–Goldfarb–Shanno准Newton算法的1000个最小化步骤（Zhu等。, 1997). 总数势能系统的琥珀色每个步骤的输出文件。能量屏障，ΔG公司^‡，计算为基态最低能量和过渡态能量之间的差值。

3.1. 质量控制表明存在第四纪结构

通过结合金属亲和力和尺寸排除色谱法（秒）。DmmarA酶的SEC洗脱曲线如图1所示(一). 蛋白质被提纯到很高同质性和结晶质量，如SDS-PAGE分析所证实（图1一).

图1 生化特性和晶体形态。(一)洗脱剖面来自尺寸排阻色谱法和SDS–PAGE。(b条)热展开实验。蓝色曲线代表350 nm/330 nm处的色氨酸荧光比率，橙色曲线是比率的一阶导数。注意，DmmarA的熔化伴随着两个主要熔点：T型平方米=40.7°C和T型平方米=57.3摄氏度。(c（c）)在pH 6.5（左）和pH 5.5（右）下获得的针状DmmarA晶体的显微照片。黑色箭头表示衍射质量的晶体，显示三维形态。棒材代表0.2 mm。

热能变性用纳米DSF测量了DmmarA的轮廓。如图1所示(b条)，nanoDSF实验确定了一个两步熔化转变，第一个转变中点为～40.7°C，第二个转变中点为～57.3°C。我们推断，第一个转变可能对应于DmmarA同型二聚体的解离，而第二个转变可能代表分离单体的展开。

3.2. 晶体形态和衍射质量

结晶筛选和随后的晶体生长优化确定了两种化学条件，即pH 6.5和pH 5.5，在这两种条件下，我们可以重复获得DmmarA晶体。不幸的是，所有生长的DmmarA晶体都是薄而脆弱的针状晶体（图1c（c）); 在冷却过程和处理过程中，大多数晶体分解成小的结晶针。

尽管如此，DmmarA晶体显示出衍射质量，收集了完整的晶体学数据集，并通过分子置换使用HLD LinB（PDB条目）的结构4波分（wdq）)作为搜索模型。人工建造和自动建造的几个循环精炼进一步完善了初始模型。最终模型与理想几何形状有很好的偏差（表2).

第一种结构来源于在含有0.02的母液中生长的晶体M（M）千赫₂人事军官₄, 0.1 M（M）双三丙烷pH 6.5，22%PEG 3350。这个晶体结构分辨率为1.85Ω空间组 P（P）12₁1，带单位-细胞参数一= 91.816,b条= 61.381,c（c）= 106.689 Å,α= 90,β = 106.256,γ= 90°. 这个马修斯概率计算器（Weichenberger和Rupp，2014年)建议在非对称单元这些都是在分子置换搜索中发现的。

第二类衍射晶体是在由0.2组成的母液中获得的M（M）醋酸铵，0.1M（M）双峰pH 5.5，20%聚乙二醇3350。这些晶体的衍射分辨率为1.6º，属于同一晶体空间组 P（P）12₁1.单位-细胞参数为一=90.699，b条= 60.766,c（c） = 104.777 Å,α= 90,β= 105.489,γ= 90°. 类似地非对称单元包含四个DmmarA分子。尽管在pH 5.5下生长的晶体的DmmarA结构的分辨率比在pH 6.5下获得的要好，但电子密度图在几个位置的分辨率很差，因此一些残留物不能被构建成密度。

3.3. DmmarA的结构显示了典型的HLD折叠

DmmarA两种晶体形式（pH 6.5和pH 5.5）的不对称单元包含四条蛋白质链(A类–D类)，其中链条A类和B类形成第一个生物同源二聚体和链C类和D类形成第二生物二聚体。DmmarA的整体结构显示出典型的HLD褶皱，与其他HLD具有相同的主要结构特征。它由一个主域和一个典型的α/β-水解酶折叠和螺旋帽结构域（图2一). 主域包括一个八品牌β-表，带有β2股与其他股反向平行，由三条螺旋围绕(α1,α10和α11） 在一侧和四个螺旋(α2,α三，α8和α9） 在另一边。cap域，包含六个螺旋区域(η1,α4,α5,α5′,α6和α7） ，由L9回路和L14回路锚定在β6股和α8螺旋。与大多数HLD相比，DmmarA序列在其N末端缩短。因此，其三级构造立即从β1股，缺少在其他HLD家族成员中常见的前螺旋（图3). 使用DALI公司服务器（霍尔姆，2020年)表明DmmarA结构最接近脱卤酶LinB（PDB条目1百万焦耳5; 奥克利等。, 2004)，在C上具有54%的序列一致性和平方根偏差（r.m.s.d.）^α0.9Ω的原子(补充图S1).

图2 DmmarA的晶体结构。(一)DmmarA的整体结构。前视图显示在左侧，侧视图显示在中间，底视图显示在右侧。链条A类显示为蓝色卡通和链B类作为一个浅蓝色的卡通。形成催化五肽的氨基酸可视为绿色球体。L5回路为紫色。(b条)立体声2F类哦−F类c（c）2等高线的电子密度图σ关键活性部位残留物（灰色网格）。蛋白质残留物显示为蓝色棍子，水显示为红色球体。(c（c）)DmmarA和HanR的活性位点。左侧面板描述了DmmarA的活动站点。质子中继系统、卤化物结合部位和通道中的残留物显示为蓝色条。独特的残留物突出显示为半透明球体。残留物和水之间的氢键显示为黄色虚线。水被视为一个红色的球体。中间的面板显示了DmmarA（蓝色）和HanR（金色）活性位点的叠加。右侧面板显示HanR的活动站点。残渣显示为金棒；残基之间的氢键和氯离子的配位显示为黄色虚线。氯离子可视为绿色球体。

图3 不同HLD的多序列比对。对齐包括DmmarA、HanR、LinB、DbeA、DhaA、DmxA、DmmA、DccA、DsvA和DpaA序列，对齐序列上方显示了DmmarB的二级结构拓扑。催化三联体的残留物用蓝色圆点标记，卤化物稳定残留物以绿色星形标记，催化腔中的非典型残留物则用粉红色方块标记。二聚化界面用紫色框起。

3.4. 放大活性位点口袋的分子特异性

DmmarA的活性部位位于α/β-核心和螺旋帽域。在活性部位，我们发现质子中继催化三联体，它非典型地由亲核天冬氨酸（Asp95）、碱性组氨酸（His259）和催化酸（Asp219）组成（图2b条和2c（c）). 这种催化三联体（Asp–His–Asp）在HLD-II亚家族成员中是独一无二的，因为该亚家族的其他酶包含谷氨酸作为催化酸（Chovanová等。2007年; 图3). DmmarA中存在两种典型的卤化物稳定残基Asn28和Trp96。Asn28（～3.05μl）和Trp96（～3.73μl）的侧链与水分子形成氢键，水分子占据脱卤反应期间卤素离子通常结合的位置。

令人惊讶的是，DmmarA在卤素稳定Trp96旁边含有一个丙氨酸（Ala193），而不是在迄今为止所有HLD酶中都保存的标准脯氨酸（图3). 这种氨基酸变化导致蛋白质骨架发生轻微变化，使Trp192的羰基靠近Trp96的吲哚胺N原子（～3.06º）。由于这些结构变化，Trp192的羰基O原子和Trp96的吲哚胺之间的键合距离（～3.06Å）短于卤化物稳定Trp96的吲哚胺和卤化物结合位点结合的水分子之间的氢键（～3.73Å）。

活性位点口袋中的另一个独特残基是Arg125。先前在卤代烷脱卤酶HanR（PDB入口）中观察到精氨酸在此位置的存在4个brz; 诺瓦克等。2014年). 然而，Arg125在DmmarA中的定位是相当不同的，这是因为双齿氢键与Glu240的侧链羧酸盐相连。HanR中这种谷氨酸的缺乏使得精氨酸以不同的方式与相邻残基相互作用，从而显著改变其空间位置。由于这些特异性，DmmarA结构中的Arg125侧链向活性位点口袋深深突出，接近催化中心（～7.1º），而HanR中相应的精氨酸（Arg136）没有。在HanR中，Arg136的侧链受到不同的约束，因为它与Ala141的主链羰基形成氢键（图2c（c）).

3.5. 对映选择性起源的计算见解

DmmarA此前透露对映选择性对于(S公司)-对映体(R（右）)-底物2-溴戊烷的对映体(E类-值6.33；瓦西纳等。, 2022). 要理解这种不寻常对映选择性，我们对底物2-溴戊烷（2-BP）和2-溴己烷（2-BH）的两种异构体进行了分子对接。为了进行比较，我们将相同的化合物对接到(R（右）)-对映选择性酶DbjAR（右）-HLD家族的对映选择性(E类-值132，2-BP；Prokop公司等。, 2010; 利斯科娃等。, 2017). 结合能的差异R（右）和S公司异构体不太显著(补充表S1). 尽管如此，尽管很小，但它们的热力学稳定性之间的理论比值始终遵循两种测试酶的已知偏好顺序(R（右）/S公司DmmarA的比率<1.0，DbjA的比率>1.0；补充表S1).

我们分析了生产性绑定模式（图4和补充图S2)通过计算近攻击构象（NAC）。2-BP和2-BH的结果非常相似，主要取决于酶和对映体。在某些情况下，只发现了准NAC结合模式，这可能暗示了在与这些底物实现良好反应性方面存在一些困难，例如对于具有(R（右）)-2-BP和(R（右）)-2小时(补充表S1). The orientations of theR（右）和S公司DbjA中的对映体没有显著差异，而DmmarA中的两种异构体在活性部位采用了非常不同的结合模式（图4). 这似乎是由于在DmmarA中Ile196和Leu121附近发现了一个较大的子口袋，它促进了S公司该区域的基底。由于存在较笨重的Leu217、Ile129和Met132，而不是分别存在Ile196、Leu121和Arg125，因此DbjA中没有此子插座（图4). 活性位点的这种差异可以解释它们不同的结合倾向，并最终催化(R（右）)-和(S公司)-对映体。

图4 通过分子对接获得的生产性结合模式。DmmarA（顶部，青色）和DbjA（底部，绿色）的结果(R（右）)-2-BP（左侧，洋红条）和(S公司)-代表2-BP（中间，鲑鱼棒）；酶的活性位点口袋显示为2-BP的各自首选对映体（右）。邻近配体的残基被标记。S中涉及的残留物N个2个反应（棒）用红色标记：亲核剂（Asp103或Asp95）和卤化物稳定残留物（Asn28和Trp96用于DmmarA或Asn38和Trp104用于DbjA）。S中羧基O原子和C原子之间的距离N个2反应显示为黄色虚线。所有的数字都是从同一个有利位置呈现的。

为了更准确地预测第一个化学步骤（S_N个DmmarA中的2反应）可能因(R（右）)-和(S公司)-2-BP，我们沿反应坐标，如之前报道的其他卤代烷脱卤酶（Marques等。, 2022). 我们可以估计各自的活化能为ΔG公司^‡=14.7千卡摩尔⁻¹的(R（右）)-2-BP和9.9千卡摩尔⁻¹的(S公司)-2-BP。对于(R（右）)-对映体比(S公司)-4.8 kcal-mol对映体⁻¹，可以转换为3.3×10^三-对于S公司基底。这种偏好在质量上与2-BP（Vasina）的实验结果一致等。, 2022)并证实DmmarA的活性部位更适合催化与(S公司)-对映体。

3.6. 通过L5环的异乎寻常的同二聚体模式

仔细检查电子密度图，发现DmmarA同二聚体的非典型模式，这是以前从未观察到的。准确地说，DmmarA结构显示了一种新的所谓的背对背同二聚体模式（图5一)将其与之前描述的HLD二聚体区分开来。DmmarA同二聚体是由于位于主回路中的L5环之间的非共价相互作用而组装的α/β-核心α5′和α一条链的帽域中有7个螺旋，第二条链对应的对称界面。使用PLIP程序工具（Adasme等。, 2021)揭示了两个氢键、八个疏水相互作用和两个水桥。氢键发生在Pro63（L5环，链）的主链羰基之间A类)和Arg194的侧链N原子(α7、链条B类)，距离为2.75°。由于Pro63（L5，链B类)和Arg194的侧链(α7，链条A类)，距离为2.8°。此外，多重疏水和非极性相互作用维持二聚体组装。值得注意的是，Phe65侧链位于L5环（链）中A类)在这里起主导作用，因为它从链上与Leu150（3.91º）、Ile187（3.35º），Leu190（4.04º）和Leu191（3.96º）接触B类在双旋转轴的另一侧观察到类似的疏水相互作用。此外，还形成了一些水介导的桥，例如在Glu146的主链羰基之间(α5′，链条A类)和Gln184的酰胺N原子(α7，链条B类). 在Thr61的侧链羟基（L5，链B类)和Glu146的侧链羧酸盐(α5′，链条A类)距离分别为2.65和2.54Ω。

图5 通过L5回路进行二聚。(一)DmmarA的背靠背二聚化界面。链条A类显示为蓝色卡通和链B类作为一个浅蓝色的卡通。L5回路为紫色。在特写镜头中，相互作用的残基显示为棍子。水被视为红色球体，而键则被视为黄色虚线。(b条)独特的DmmarA L5环路。循环显示为紫色，循环的残留物显示为紫色条。酶的其余部分可视为蓝色表面。右侧面板显示了不同HLD中L5回路的多序列对齐。(c（c）)L5环路构造的类型。在左边，描绘了DbeA（绿色）、DhaA（灰色）、DmxA（粉色）和DmmA（黄色）的较短类型L5循环。第二个面板显示了较长的L5型环，包括HanR（金色）、LinB（棕色）、DccA（蓝紫色）和DpaA（鲑鱼）。第三个面板显示DmmarA型L5回路（紫色）。所有L5回路的叠加显示在右侧面板中。

二聚化界面的计算映射国际学生成绩评估界面计算（Krissinel&Henrick，2007)显示了相对较小的界面溶剂可及区域（618²)与总溶剂可及面积（10 907.7Ų)复合物形成显著性得分（CSS）为0，表明没有生物学相关的低聚组装。相比之下，迄今为止测定的所有其他HLD二聚体显示CSS大于0，通常是较大的界面和低聚物组合（表3).国际学生成绩评估计算二聚体解离的负自由能(ΔG公司^diss公司=−4.6千卡摩尔⁻¹，伴随着K（K）_d日= 2.3 × 10^三)这表明相关的二聚体被预测为热力学不稳定。因此，国际学生成绩评估CSS不支持二聚体形式的DmmarA。此外，DmmarA结构与脱卤酶LinB的结构关系最为密切，LinB是一种特性良好的单体酶。然而，相比之下，使用AlphaFold公司2（米尔迪塔等。, 2022)导致了与我们的晶体结构非常相似的二聚体组装和活性位点残基构象(补充图S3).

3.7. SAXS实验证实溶液中存在同二聚体关联

接下来，我们使用小角度X射线散射（SAXS）技术探测SEC纯化的DmmarA酶，以确定其在溶液中的结构。SAXS实验数据与计算的二聚体DmmarA晶体模型的散射曲线完全吻合χ²= 1.2. 此外从头算模型包络与通过X射线晶体学获得的DmmarA的二聚体结构完全匹配（图6). 相反，实验散射剖面与单体DmmarA结构的计算曲线不一致(χ²= 55). 总之，SAXS分析提供了DmmarA二聚体性质的直接实验证据。

图6 DmmarA的SAXS解决方案结构。(一)实验SAXS散射曲线（点）与单体（红线）和二聚体（蓝线）的计算曲线一起显示。(b条)从头算DmmarA模型（紫色球体）。(c（c）)从头算外壳（半透明球体）和DmmarA晶体二聚体（蓝色卡通）重叠。

3.8. HLD家族中使用的扩展二聚化模式

描述良好的HLD使用三种不同的蛋白质-蛋白质界面形成二聚体，这三种界面可被称为（i）前向二聚体（DbeA、DmmA、DmxA和DbjA），（ii）底向二聚物（DccA）和（iii）盖向二聚化（DpaA、HanR和DatA）。七种实验确定的HLD二聚体的结构比较如图所示。7脱卤酶DbeA通过前对前二聚形成二聚体，其中C末端α-螺旋线起着关键作用（查洛普科娃等。2014年)，而DmmA链通过α10和β8个二级结构（Gehret等。, 2012). DmxA的二聚体由C末端螺旋和β8片，借助每个单体的半胱氨酸残基之间的二硫键（Chrast等。, 2019). DccA主要使用α主要区域有8个螺旋。酶DpaA和HanR通过帽对帽相互作用二聚化，DpaA利用非共价相互作用α5和α6螺旋（迷宫等。, 2021)HanR二聚体严格由螺旋帽结构域中的相互作用形成。因此，本研究确定的DmmarA结构揭示了一种新的第四类自结合界面，导致所谓的背对背二聚化，其中L5环起主导作用。

图7 HLD家族中的多种二聚化模式。中心描绘了HLD二聚体的叠加。的正面互动(一)DmxA（粉红色）(b条)DbeA（绿色）和(c（c）)DmmA（黄色）显示在右侧(d日)底部显示DccA（蓝紫色）(e（电子）)DmmarA（蓝色）显示在左侧(如果)DpaA（鲑鱼）和(克)HanR（金色）显示在顶部。灰色方案说明了不同的二聚模式，深灰色多边形代表帽状域，浅灰色多边形代表主域。

3.9条。L5环的特定组成和构象驱动背靠背二聚

关于为什么DmmarA酶采用新的背对背二聚化界面而不是以前在HLD家族其他成员中观察到的界面，存在一个根本性的问题。仔细检查叠加结构，发现DmmarA中L5环的特定构象，将其与其他HLD区分开来（图5c（c）). 一般来说，HLD中的L5环可以根据序列和结构比较分为两个不同的簇。第一个簇代表具有较短L5环（18个残基；DbeA、DhaA、DmxA和DmmA）的酶，而第二个簇包含具有相对较长L5环的酶（20–22个残基，HanR、LinB、DccA和DpaA）。DmmarA不属于这两个集群中的任何一个，因为它的L5环路具有独特的功能。如图5所示(b条)，DmmarA的L5环具有特定的序列组成；特别是在65位存在苯丙氨酸是非常罕见的。在结构上，Phe65的庞大芳香侧链从蛋白质表面突起，因为附近的表面亚基被保守的Tyr67占据。此外，DmmarA的L5环的特定构象还有一个额外的原因。整个DmmarA序列在其N端被截断；它立即开始于β1股，无N端侧翼区域。在一些HLD（例如DccA和DpaA）中，N端结构元素在空间上与L5环接触，影响其构象行为，而在DmmarA结构中并非如此。总之，我们认为DmmarA中L5环的独特序列和构象导致了一种新型二聚化界面的出现。