2.1. 芯片制造和组装

微流控芯片的四个不同层和组装示意图如图1所示(一). 封闭的X射线成像区域由COC薄膜（第3层）制成，该薄膜是通过将COC溶液旋涂到硅片上而制备的。溶液的制备方法是将15 wt%的COC溶解在秒-丁苯在120°C下过夜或直至完全溶解。根据旋转速度和溶液浓度，可以改变500 nm至5µm的薄膜厚度。图2显示了6017 COC的自旋曲线。虽然较厚的薄膜提供更好的支撑和较低的透水性，但用户应选择尽可能小的薄膜厚度，以确保低背景。为了改善COC薄膜从硅片上的分层，在COC薄膜沉积之前，先将9 wt%PVA溶于Milli-Q水中的水溶性牺牲层纺丝到清洁的经紫外线臭氧处理的硅片上。使用15分钟的紫外线-臭氧处理来改善硅片的表面润湿性。将PVA牺牲层在120°C的热板上烘烤几分钟，以完全蒸发残余水。然后，在干燥PVA层的顶部以1000转/分的速度旋转温暖的COC溶液（>80°C）⁻¹持续60秒。

图1 (一)改进芯片构造层的示意图。请注意，“顶部”框架（第2层）具有入口孔，而“底部”框架没有。(b条)组装芯片的图像，样品X射线成像区域充满有色溶液。红色虚线表示活动X射线成像区域。通过手动移液管将样品装入其中一个入口/出口孔。每个示例图像窗口都是独立的。

图2 显示不同浓度COC 6017溶解于秒-丁基苯。

支撑框架（第2层）由1 mm PMMA制成，切割前在PMMA板的一侧贴上聚酯胶带。带有聚酯层压板的PMMA是CO₂激光切割；剪切区域定义了sample-imaging窗口。一氧化碳₂还使用激光切割48µm双面丙烯酸粘合剂间隔层（第4层）。对于带有2.7µm 6017 COC膜和48µm垫片的单流道，我们发现3.5 mm的宽度接近最大值，更大的宽度有时会导致薄膜在加载样品之前穿过气隙接触。这些尺寸与大多数结晶溶液粘度和最大尺寸小于30µm的结晶浆液广泛兼容。对于不同的光束线需求，整个芯片尺寸和成像窗口的尺寸都可以轻松定制。为了提高信噪比，样品流动层的厚度应与晶体尺寸相匹配，以最小化结晶溶液的背景。市场上有25至150µm的粘合垫片。

将PMMA框架（第2层）放置在COC膜（第3层）上，聚酯粘合剂面朝下放置在纺丝涂层COC膜上，以组装芯片。通过牢牢按压PMMA框架的所有部件，支撑框架和COC膜之间形成了强大的粘附力。多个框架可以压在一块晶圆上。然后，将粘附的组件浸泡在Milli-Q水中，直到带有附着COC膜的框架从晶圆上脱层。这一过程需要长达36小时，但可以通过在浸泡前使用剃须刀片围绕PMMA框架的外缘进行切割来加速。然后用Milli-Q水冲洗分层的半片，并用温和的N流干燥₂天然气。只有一个PMMA框架具有入口/出口孔（图1一顶部与底部）。将粘合剂垫片（第4层）对齐并放置在一个框架支撑的COC窗户上，以完成施工。然后将完成的另一半（第2层和第3层）放置在垫片上，形成芯片（图1b条). 有关激光切割的详细制造步骤和矢量文件，请参阅支持信息.

2.2. 样品装载

芯片与直接晶体浆料装载和就地通过直接将结晶浆液或蛋白质/沉淀剂溶液移液至入口孔（图1），实现片上结晶（微区或蒸汽扩散条件）b条). 样品溶液通过毛细管作用流入成像通道（Sui等。, 2021). 装载样品后，可以将水晶透明胶带（第1层）包裹在芯片上，以减少分批结晶过程中的水分损失，提高样品稳定性，也可以在蒸汽扩散条件下将其打开。在这两种情况下，就地由于样品体积的高纵横比和用于蒸发的有限面积，结晶时间通常较长。

溶菌酶和索姆丁被用作模型蛋白，以证明芯片性能。将每种蛋白质的市售冻干样品溶解在Milli-Q水中，以产生50 mg ml的蛋白质溶液⁻¹溶菌酶和25毫克毫升⁻¹索默丁。2的储备溶液M（M）含0.1的NaClM（M）醋酸钠缓冲液pH 4.6和1M（M） L（左）-酒石酸钠钾0.1M（M）分别以pH 6–6.5的ADA缓冲液作为溶菌酶和索姆丁的沉淀剂溶液。对于溶菌酶，我们还探索了结晶过程中水凝胶的使用，以进一步证明芯片在不同结晶条件下的效用。在这种情况下，将2 wt%低熔点琼脂糖（购自Hampton Research）加热至85°C，冷却至40°C，然后添加到沉淀液中并与蛋白质溶液混合。将含有0.3wt%琼脂糖的最终混合物在30°C以上用移液管移到芯片的入口，直到通道填满。每条车道上的总样本量为4µl。对于同步加速器测量，需要更大的蛋白质晶体并结晶就地并通常用Crystal Clear胶带密封以提高水合稳定性。补充图S1显示了生长的溶菌酶晶体的光学显微镜图像就地放在一块在环境条件下保存的芯片内。在十天多的时间里，在环境条件下未观察到明显的脱水现象。晶体生长时没有显示出方向偏好就地.

2.3. 蛋白质衍射测量

两种模型蛋白，溶菌酶和索姆丁，在芯片上结晶，并在斯坦福同步辐射光源（SSRL）的光束线12-1上在室温下进行测量。在衍射实验期间，使用带有磁性底座的螺纹拧紧的开槽支架来固定芯片的PMMA框架部分（图3b条). 磁性底座安装在光束线处的测角仪上。使用EIGER X 16M探测器（Dectris AG），在0.9794º的波长下，以0.05×0.04 mm的光束尺寸收集衍射数据，探测器距离为0.2m.光束线样品持有者平移电机用于将单个单晶对准光束路径并使其居中，使用内联高分辨率相机识别每个晶体。数据集是从这些40°楔形的居中单晶中收集的。将来自15个和14个单个晶体（平均直径为50µm）的衍射数据合并，分别给出溶菌酶和索姆丁的完整数据集。图3显示了使用改进芯片的索姆丁衍射图样示例(一).

图3 (一)在SSRL上以10%的透射率从thaumatin晶体获得的X射线衍射图样。安装了一个具有四个独立体积的1〃×1〃芯片设计(b条)SSRL处的波束线12-1和(c（c）)LCLS处的MFX光束线（在红色3D芯片支架中）。

溶菌酶晶体生长就地并在Linac相干光源（LCLS）的高分子飞秒结晶（MFX）光束线上进行测量。采用不同的结晶方案生产较小（平均10µm）的分散溶菌酶晶体，用于比较XFEL测量（50 mg ml⁻¹蛋白溶液与母液比例为1:1的溶菌酶：1M（M）氯化钠，0.1M（M）醋酸钠pH 4.6）。在环境温度下，在富氦环境（HERA）中收集XFEL衍射数据，以减少空气散射的背景。制作了一个具有四个3.5×18mm通道的1′×1′芯片，以匹配MFX样品台的位移范围。制作了一个3D绘制的芯片支架，将芯片连接到样品台上（图3c（c）). 使用SLAC ePix10k2M探测器在1.253°和11%透射率下收集衍射数据。光束线样品架平移电机用于校准芯片并以120 Hz的频率连续光栅化。根据直线平移电机的速度，在120 Hz下，可以在25至200µm之间进行可变炮点间距，数据采集主要在50µm位移下进行。内联摄像头的分辨率是颗粒状的，因此使用较大的光栅扫描来优化数据收集效率，以确保样本窗口区域完全成像。

3.1. 改进了芯片制造和组装

详见表1新一代芯片（芯片2.0）在制造时间和成本方面取得了显著进步，同时具有更大的连续成像面积和更低的样本体积：面积比。通过具有大而连续的窗口区域，每个芯片可以进行更多的放炮，从而最大限度地提高样本到数据的效率。制造的简易性和周转时间的改进表明，芯片可以大规模制造并快速调整以满足特定的束线要求。用户可以根据自己的具体需求轻松制作自己的芯片，只需要一台旋转涂布机和一台CO₂激光切割机。优化芯片以匹配特定晶体类型和测量要求的能力增强了芯片的多功能性及其对一系列实验类型的适用性。

3.2. 微流控芯片背景散射

图4给出了SSRL光束线12-1上两个具有不同COC窗口厚度和48µm间隔层的芯片的背景径向散射。测量了空芯片和缓冲填充芯片的背景散射。来自芯片的大部分背景散射来自水性缓冲液，在约q个= 1.2 Å⁻¹与之前的研究一致（马蒂尔等。, 2021; 任等。, 2018; 吉尔比勒等。, 2021). 对于芯片演示测量，使用相同的通道几何形状以保持一致性。因此，XFEL中使用的较小晶体周围有一层相对较厚的缓冲层，从而形成较高的背景。该芯片可以进一步优化和定制以满足不同的波束线需求。鼓励用户选择最小的信道厚度，以获得最佳的信噪比。相反，更高强度的实验可以与稍厚的窗户和更多的支撑结构相匹配。

图4 在SSRL的光束线12-1上测量的减去空气散射的径向X射线散射背景q个 = ∼1.8 Å−1在填充的芯片中很明显（黑色数据点）。当背景从COC窗口散射时q个 = ∼1.2 Å−1基于薄膜厚度（绿色与红色数据点）可以有效控制，由于薄膜厚度和不同芯片之间的微小变化，它可能会出现微小波动（绿色与黑色数据点）。

比较来自两种不同COC窗口厚度的背景散射，COC厚度从2.7µm减小到1.7µm.将COC散射峰值降低约四倍。总的来说，与基于厚（600–700µm）COC板（Pinker等。, 2013; 瓦西里迪等。, 2022).

3.3. 蛋白质晶体衍射

3.3.2. XFEL测量

为了更好地代表XFEL样品，使用就地选择结晶。用于数据采集的两个芯片的显微图像如图5所示(一). 获得了最大尺寸约为10–15µm的分散溶菌酶小晶体的随机取向衍射。衍射图案示例如图6所示没有任何图像处理。从收集的数据集中获得的合并统计信息如表2所示.

表2 溶菌酶和索姆丁的结晶统计数据 括号中的值表示最高分辨率外壳。 蛋白质 索姆丁 溶菌酶（同步加速器） 溶菌酶（XFEL） 平均晶体直径（µm） ∼50 ∼50 ∼10 分辨率范围（Ω） 36.39–1.48 (1.53–1.48) 39.57–1.45 (1.47–1.45) 24.82–1.70 (1.76–1.70) 一,b条,c（c）(Å) 58.67, 58.67, 151.56 79.15, 79.15, 38.05 78.80 ± 0.3, 78.80 ± 0.3, 38.0 ± 0.2 α,β,γ(°) 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 “空间”组 P（P）41212 P（P）4三212 P（P）4三212 总反射 463922 (46703) 291020 (10061) 22394 (13653) 独特的反射 45060 (4434) 22046 (1243) 13193 (1353) 多重性 10.3 (10.5) 13.2 (13.1) 809 (435) 完整性（%） 99.87 (99.95) 100.0 (99.9) 99.8 (100) 〈我/σ(我)〉 10.89 (0.95) 12.6 (1.03) 4.6 (0.5) 科科斯群岛1/2 0.998 (0.572) 0.999 (0.999) 0.9480 (0.4542) 威尔逊B类系数（Ω2) 19.67 21.77 15.83

图5 (一)在XFEL测量之前，溶菌酶晶体的代表性图像和两个芯片中晶体密度的变化（比例尺适用于图的两个部分）。(b条)在XFEL测量5天后，溶菌酶晶体以50µm的弹丸间距、11%的透射比和0.9–1.0 mJ的脉冲能量进行测量。在微流控通道的某些区域观察到几微米大小的小汽泡，光束被光栅化，如虚线圆圈和插图所示。

图6 LCLS处MFX光束线上以11%的透射率从溶菌酶晶体获得的X射线衍射图。没有任何背景减法的原始图形。

对于第一次XFEL演示测量，传输率为11%，使用了120 Hz的完全重复率。内嵌摄像头的图像质量相对较差。没有为光栅扫描仔细对齐成像X射线窗口，而是粗略地对齐芯片，并在更大的区域上进行光栅化，以确保测量整个样品窗口。因为芯片完全是聚合物和样品，所以通过X射线束光栅化芯片的框架或任何区域都没有问题，无需仔细定位或精确光栅化。如图7所示，在厚PMMA支撑架上的X射线照片具有更高的平均探测器强度，并且在分析数据时很容易通过强度截止值排除在这种情况下，我们也运行了部分填充的溶菌酶芯片，以提供芯片相对于样品的背景的粗略估计。

图7 光栅化半填充芯片时，每个XFEL镜头的平均探测器强度图。灰色区域是扫描PMMA框架的区域，黄色区域是样品（缓冲晶体和衍射晶体），空白区域是仅含空气的聚合物芯片。击中PMMA框架的X射线照片很容易被排除在使用平均强度截止值的分析之外。样本的强度大约是空白空气背景的三倍。

使用宽扫描区域，从两个芯片收集数据大约需要1小时，产生47 948次点击，其中29 215个点阵被索引。重新运行两个成像窗口以耗尽剩余的晶体，总索引命中率为13.5%。数据被合并和精炼为R（右）_工作和R（右）_自由的值分别为0.2512和0.2814，分辨率为1.70Ω。图5(b条)显示了其中一个芯片经过X射线光栅扫描后的图像。即使经过多次扫描，也未观察到微流控通道受损或严重脱水。在XFEL测量五天后对芯片进行成像，证明了芯片的鲁棒性和抗脱水的稳定性。利用此时可用的更高放大率，可以在一些区域检测到间距为50µm的微小汽泡图案，这些区域可能粘附在疏水性COC窗口膜上，以及一些扩散的汽泡。值得注意的是，COC薄膜和芯片仍然完好无损。

在一系列传输中运行另一个具有不同蛋白质筛选样本的芯片。在高达63%的传输中，未观察到命中率下降。然而，在100%的透射下观察到盐晶体的衍射，随着时间的推移，衍射逐渐增加。当芯片从光束线中取出时，可以看到脱水现象。图8显示了芯片从63%传输到100%传输期间的光学图像。50µm的散粒模式非常明显，并且在100%透射率下观察到COC膜中的戏剧性模式。随后在四倍放大率下进行的成像没有检测到COC膜中的穿孔。然而，薄膜必须沿条纹图案存在微小缺陷，导致测量过程中样品脱水。未来的工作将仔细研究高速传输的芯片，以优化这些条件。特别是，使用25µm的粘合层厚度将显著降低缓冲液背景和水吸附，而高湿度氦室可以通过防止样品脱水实现完全操作而不会发生任何变化。

图8 63%（顶部）和100%（底部）传输后的芯片。在这两种情况下，都可以清楚地看到50µm的弹丸间距，但在63%的传播率下，没有发现命中率或脱水的变化。在100%的透射率下，发现盐晶体的脱水和衍射，表明X射线照射可能导致COC膜开裂或针孔缺陷。