1.简介

在过去20年中，生物和工程技术的进步使分子靶向药物发现的效率和有效性发生了重大变化。每一个药物发现计划都是为了满足无法治疗或治疗不佳的患者群体的需求而制定的。基础生物学研究确定了一种易受小分子调控的分子靶点或途径，并有望以良好的治疗指数提供治疗该疾病的途径，即。有益活动和有害副作用之间的良好平衡。确认靶点调制与疾病的联系的过程称为靶点识别（TI）。一旦确定，在药物开发管道的hit-identification（HI）阶段寻找药物发现的起点之前或同时，作为目标验证（TV）阶段的一部分，需要一系列附加和正交验证技术（图1一). 传统上，高通量屏幕（HTS）用于进行HI。为此，将针对目标建立适合高通量的分析，并应用于识别一系列相对精细的小分子点击（分子量350-500），其亲和力通常在微摩尔范围内。这种方法仍然有价值，尽管理论上的考虑表明，当使用具有足够大小的分子库来有效抑制以注册为HTS中的点击时，很难实质上覆盖化学空间（Roughley&Hubbard，2011; 奥斯本等。, 2020).

图1 (一)药物发现管道的临床前组成部分。(b条)晶体碎片筛选活动产生的丰富数据可以为基础生物学和药物发现提供信息。

最近，高温超导已经被一种结构技术所取代或补充，例如X射线晶体学，它不仅提供了结合分子的身份，还提供了其结合位姿的模型（Owen等。, 2016). 晶体学屏幕提供的数据如此丰富，以至于高通量晶体学甚至可以作为反馈回路的一部分，在迭代目标识别/验证过程中为基础生物研究提供信息。例如，晶体学屏幕的输出已被显示为（i）绘制目标上可能与生物功能相关的表面和口袋（Patel等。2014年)，（ii）深入了解已知绑定伙伴的绑定模式和交互（O’Reilly等。, 2019)和（iii）揭示未知变构或隐秘位点，可能提供新的靶调控机制（Wood等。, 2019; 瓦热达等。, 2018). 与这种正构和变构位点结合的片段可以作为抑制剂或降解剂使用（Sun等。, 2019)，它们可以作为生物功能的探针（图1b条)并进一步推动TI/TV进程。事实上，只有当针对靶点的药物被证明具有临床益处时，TI/TV才能被认为是完整的，尽管一般的期望是在HI活动开始之前已经执行了TI/TV尽职调查的阈值。

从晶体学碎片屏幕识别出的点击与HTS的输出产生的挑战不同。基于片段的晶体学筛选为药物发现团队提供了已知结合模式的片段命中（分子量～150），但对靶点的结合亲和力（通常无法测量）较低，通常在毫摩尔范围内（Schiebel等。, 2016). 片段结合也可能是目标晶体状态的人工制品，例如配体的每个分子与晶体晶格中的多个蛋白质形成相互作用。只有当定量或最低级别的碎片命中挑战被克服时，才能使用定量结构-活性关系（SAR）研究将最初的弱结合碎片发展为高亲和力调节剂，在潜在客户识别和潜在客户优化到候选人提名的后期阶段取得的结果（图1一). 本文将概述一些技术和工具，这些技术和工具可用于通知这个早期的hit-expansion阶段。

2.结合亲和力与晶体学屏幕点击的关联

有多种技术可用于评估碎片对靶的结合亲和力（图2)，大多数技术属于基于功能板的测定或直接测量配体结合的技术的类别。这些技术中的每一种都具有限制其自信地对“弱”配体的结合进行评分的能力的技术考虑，因此，在三角测量过程中，使用多种技术对活动进行测量，以建立对每个碎片打击真实性的信心，并为其分配相对优先级，以推进线索识别（休斯等。, 2011). 从晶体学屏幕上找到一个碎片意味着主要的挑战是产生适当数量和纯度的蛋白质，以用于正交评估的反应剂密集技术（图2b条).

图2 (一)验证命中的组成：早期晶体学命中验证中的正交测量和三角测量。(b条)命中验证过程中可用的技术。

3.考虑技术设置

为研究配体在命中验证期间的亲和力和抑制（或激活）效力而开发的工具和技术构成了后续迭代SAR研究中制造测试级联的基础。考虑到在这一点上建立稳健的分析系统所带来的长期优势，此类分析的设计值得仔细考虑。最重要的是确保该分析测量的量可以用作目标生物系统调节的预测替代物。解决这一问题的一种方法是，确认当使用合适的阳性对照物（例如具有已知靶向活性的配体/抑制剂）进行激发时，该分析反应适当。然而，这种工具化合物并不总是可用的，在没有对照化合物的情况下，有许多方法可以验证分析系统。

一种确认分析正在读出相关结合事件的方法是，如果目标被改变了目标位点的突变版本所取代，则确认分析的行为会发生适当的改变。或者，当使用相关和不相关的靶蛋白时，比较分析读数可以提供信息：如果无论靶蛋白的身份如何，都能获得相同的命中活动读数，那么显然有理由担心。

在构建过程中，重要的是通过监测“质量测量”来确保任何分析的稳健性，质量测量的性质在很大程度上取决于所采用的技术（Murray&Wigglesworth，2017）). 然而，无论采用何种技术，在对任何测量进行多次技术和生物复制以增加所生成数据的价值方面都有相当大的优势。对于基于平板的分析，在任何一次分析中对阳性和阴性对照孔的技术复制品的内部一致性进行比较，可以计算Z轴’（张等。, 1999)，一个取值范围为0–1的统计信息。带有Z轴′大于0.5被认为是有用的。然而，除了任何一次化验的内部一致性之外，为了确保数据的可比性，在较长时间内使用多批试剂的技术再现性是至关重要的：药物发现计划可能会运行数年，有多个实验人员，可能在不同的实验室，因此，确保数据的再现性和稳健性至关重要。

虽然在药物发现的大计划中，命中识别和验证的成本相对较低，但在设计过程中仍有与所有必须考虑的技术相关的成本。仪器及其各自的运行成本和试剂都很昂贵。然而，通过批量购买、校准并将分析格式缩小到384孔或1536孔板，可以降低试剂成本，这有助于大幅降低成本。尽管本文没有试图涵盖小分子片段化学和合成发展（Murray&Rees，2016)，我们必须考虑它们对检测技术的影响。通常，通过在有机溶剂（例如二甲基亚砜）中溶解来存储和/或制备化合物以进行检测。因此，必须验证每个分析中所使用的共溶剂的浓度，并密切注意这些或其他缓冲添加剂（休斯等。, 2011).

除了支持选择和实施分析以支持命中识别/验证的科学决定因素外，还可能应用务实的考虑因素。例如，分析方法的选择可能取决于当地技术和/或专业知识的可用性。在没有更多具体定量数据的情况下，可能还需要使用结合的定性评估来确定化学工作的优先级，这是根据化合物在多种分析格式中的表现推断出来的。例如，在这种情况下，由于hit的溶解度与其亲和力或检测灵敏度有关，因此只能获得不完整的结合曲线。特别是在这些情况下，在通常由结构生物学、蛋白质科学和药物化学专业知识组成的项目团队中，就所生成数据的优缺点进行沟通是至关重要的。为此，还建议采用有效的方法在团队中捕获和交流结果。

4.ATAD2碎片战役中的命中识别和验证

ATP酶家族AAA域包含蛋白2（ATAD2）是一种表观遗传读取器蛋白，通过溴代多巴胺与组蛋白的赖氨酸乙酰化尾部结合。CRUK纽卡斯尔药物发现部门的研究人员针对ATAD2的溴代多巴胺开展了一项探索-发现活动，从最初通过聚焦晶体学筛查确定的四个片段序列开始。鉴于在pGEX细菌表达系统中，ATAD2的溴代多巴胺以高毫克产量表达，一些技术（图2一)随时可用。四个片段支架（吡啶酮、异恶唑、乙酰胺和三唑）的结合模式与组蛋白乙酰赖氨酸相似，每个片段支架与保守残基Asn1064形成一个氢键。所有的分子量都低于150，供应量为200 mM（M）二甲基亚砜储备溶液。为了对序列进行排序，我们首先使用ATAD2（5µM（M）)碎片浓度为2 mM（M）在含有5×SYPRO橙和1%DMSO的缓冲液中。在这些条件下，仅ATAD2的熔体曲线显示相对较低T型_米33.7°C，以及随后的ΔT型_米每个片段序列的值均小于0.5°C。在研究时，没有可用的对照化合物来评估这些值的重要性，因此，研究了额外的直接结合测量技术。因此，ITC的尝试低于-c（c）条件，假设n个数值可以从晶体学数据中获得，这些数据表明每个化合物有一个结合事件。每个片段系列都获得了新鲜粉末，通过滴定40 m进行实验M（M）碎片成150µM（M）25°C时，在匹配缓冲液（50 m）中的电池中的ATAD2M（M）HEPES pH 7.4，200米M（M）氯化钠，1米M（M）DTT，2%二甲基亚砜）。从这组低-c（c）ITC实验中，只有吡啶酮系列的片段提供了足够的热交换，表明K（K）_d日2.4米M（M）（图3一).

图3 ATAD2碎片战役中的命中识别和验证。(一)低谷-c（c）ITC温度图和(b条)用于早期片段命中验证的HTRF实验分析设计。(c（c）)晶体结构基于初始验证结果（PDB条目）的详细片段7像素5).

除了直接结合技术外，还建立了384孔低容量HTRF分析形式的功能板分析。在这里，HTRF三明治是使用未分离的GST-ATAD2（5 nM（M）)和生物素化组蛋白H4（500 nM（M）)与激发供体Tb-抗GST抗体孵育（5 nM（M）)和受体链霉亲和素XLL65（62.5 nM（M）)在由50 m组成的缓冲器中M（M）Tris pH值7.5100 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT，100µg ml⁻¹BSA，2%二甲基亚砜（图3b条). 为了研究片段结合，我们从4 m处进行了十点滴定系列M（M）低至25µM（M）在保守的天冬酰胺（N1064A）上使用ATAD2的点突变进行DMSO阳性对照和阴性对照。为了解释复合干扰，在没有蛋白质的情况下测量滴定系列。所得到的测定通常产生优良的Z轴’得分为0.9，这在推断碎片最高滴定浓度以外的数据以指导SAR方面提供了更大的信心。所有四个片段序列均产生IC₅₀值大于测量的最高浓度；然而，对较高浓度的推断被用来指导早期的化学决策点。吡啶酮片段系列中的初始结构导向类似物是商业购买的。这些目录化合物之一是1-甲基-2-喹诺酮晶体结构其中（PDB条目7像素5;补充表S1)发现双环系统与保守的Asn1064保持结合，并与缬氨酸1008、1013和1018形成疏水夹层，导致大规模IC₅₀2.6米M（M），作为初始片段细化的一部分（图3c（c）). Chaikuad的平行研究提供了该化合物作为晶体筛选命中物的进一步验证等。(2014). 虽然这些作者没有进一步描述1-甲基-2-喹诺酮的结合，但他们确实使用了核磁共振化学变换微扰研究，以交叉关联某些含吡啶的晶体点击的结合。他们对核磁共振的使用反映了我们实验室的做法，即通过应用正交结合和/或生化活性分析来确定命中验证的优先级。

5.讨论

以前成功的碎片开发活动产生了临床前化合物，可以为有效的早期制造-测试级联设计提供见解（图4). Dan Erlanson和Teddy Zartler的实用碎片博客是在基于碎片的药物发现（FBDD）中调查此类案例的绝佳资源(https://practicalfragments.blogspot.com/). 本网站重点介绍的项目之一是Heightman及其同事开发ERK1/2抑制剂（Heightman等。, 2018). 在这里，他们将晶体学屏幕与DSF结合起来进行命中验证，然后使用时间分辨荧光（TRF）活性分析推动SAR研究。Practical Fragments Blog上的另一个例子是Tamanini及其同事针对凋亡蛋白1（cIAP1）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的进一步研究等。, 2017). 在这项研究中，塔马尼尼和他的同事们用荧光偏振结合分析跟踪晶体撞击鉴定，以支持化学。Heidenrich及其同事针对11-19白血病蛋白的YEATS结构域的工作（ENL；Heidenrich等。，2018年)使用了多种技术组合来推进晶体碎片打击。最初的化学物质来源于商业，ITC被广泛用于支持发展。在另一个例子中，Wistar研究所的研究以Epstein–Barr病毒蛋白EBNA1为目标，通过DNA结合分析、SPR、ITC和2D（HSQC）NMR（Messick）支持围绕初始片段的药物化学等。, 2019).

图4 命中验证和开发期间的制造测试级联的典型工作流。

阿斯利康进行的研究强调了基于片段的变构MEK1粘合剂的发现（Di Fruscia等。, 2021)由多步骤1D NMR筛选产生，化学通过SPR驱动。Stephen Fesik领导的一个团队使用基于NMR的大片段库筛选来识别与WDR5（一种染色质调节支架蛋白）内WIN位点结合的几个不同的化学点击（Wang等。, 2018). 参与hit验证的团队使用晶体学、荧光偏振各向异性和TR-FRET竞争分析来推动SAR研究。必须提到的是，在缺乏结构数据或重组无细胞分析的情况下，已经为生物活性化合物开发了片段点击，默克公司的研究人员利用GPR7很好地展示了这一点，其中基于细胞的分析被用于SAR研究（莫宁卡等。, 2020). 总之，基于片段的药物发现是一个强大的工具，药物发现界将继续使用它来开发小分子，以应对应对未满足或治疗不良患者群体的挑战。

6.未来方向

虽然近年来结构上支持的FBDD活动大多使用晶体学和核磁共振进行筛选和后续步骤，但“分辨率革命”的出现（Kühlbrandt，2014）)低温电子显微镜（cryo-EM）已经在这个领域产生了影响。Saur最近的工作等。(2020)对模型蛋白质系统的研究举例说明了冷冻电镜如何用于揭示片段和蛋白质靶标之间分子相互作用的细节。预计随着技术的进一步发展，该技术在FBDD中的应用将继续扩大，以解决当前分辨率、低分子量限制和长数据收集时间的限制（Van Drie&Tong，2020）).

另一种可用于支持基于片段的药物发现的技术是细胞热转移分析（CETSA），这是一种可以在细胞环境中评估片段与靶点结合的分析（Martinez等。, 2018). 这种方法补充了Cravatt实验室的工作，该实验室在人类细胞内进行片段筛选（Parker等。, 2017; 亚细亚银行等。, 2020).

最后，值得注意的是，实验设计和随后的迭代药物化学都可能受益于人工智能（AI）和机器学习（ML）的发展。基于AI/ML的方法的卓越性能[例如AlphaFold公司2（跳线等。, 2021)和罗斯塔福尔德(网址：https://robetta.bakerlab.org/)]在最近的CASP14研究中（Kryshtafovych等。, 2021)建议现在可以从一级序列预测结构，并具有很大的可信度，从而简化结构设计过程，以支持上述所有实验方法的实施。类似的算法很可能会在实验结果的指导下加强抑制剂的计算设计，从而进一步提高FBDD的效率和有效性。